一種t細胞抗原受體基因及其應用
【專利摘要】本發明公開了一種T細胞抗原受體基因，用于制備嵌合抗原受體T細胞，使得后者展現出特定的食管癌相關功能活性，針對食管癌的治療具有重要的潛在和實際價值，為食管癌的治療提供一個新的技術方向。
【專利說明】
一種T細胞抗原受體基因及其應用
技術領域
[0001] 本發明涉及一種基因工程技術領域，尤其是一種食管癌相關T細胞抗原受體基因 及其應用。
【背景技術】
[0002] 癌癥一直是困擾人類的巨大難題。我國每年新發腫瘤病例約為312萬例，平均每天 8550人意味著每分鐘就有6人就診斷為惡性腫瘤，這些數據都表明，癌癥依然是威脅健康的 一大殺手。多年來，癌癥治療的方法主要是手術、化療和放療，對腫瘤患者的臨床治療有效 率仍舊很低，據統計，同一種抗腫瘤藥物的有效率僅為25%。針對同一種腫瘤，用同樣的藥、 標準劑量的治療方法，在不同病人身上所起的療效及毒副作用卻有很大的差異。造成這種 結果的主要原因在于，腫瘤是一種多病因、異質性的疾病。過去十年來，依賴于患者個體生 物標志物的腫瘤個性化治療正在逐漸取代依據傳統經驗的治療模式，并展現出優越的療效 和廣闊的前景。
[0003] 免疫療法是繼手術、化療、放療和靶向療法后出現的一種新型療法，被稱為治療癌 癥的"第五大療法"。它是利用患者自身免疫系統的力量來抵抗癌癥;癌癥免疫療法主要包 括過繼性細胞治療、免疫調節劑、腫瘤疫苗以及免疫結合點阻斷治療等。雖然有關免疫治療 的研究早在30年前就已開展，最近兩年《細胞》、《科學》、《自然》等國際頂級期刊刊出多項該 領域的突破研究成果，制藥巨頭也不斷推出此類型的重鎊療法。2014年12月6號-9號在舊金 山舉行的美國血液學會年會(ASH)上，癌癥免疫療法可謂是賺足了眼球，其中的CAR-T療法 更是備受關注。
[0004] CART的概念是以色列ZeligEshhar博士上世紀80年代提出的，1989首次開發出嵌 合抗原受體T細胞。CART療法即嵌合抗原受體T細胞療法，繞過了過繼性細胞治療療法啟動 過繼免疫應答這一難關，開創了跨越式發展的醫學史新篇章。CART針對那不怎么靠譜的過 繼免疫，引入全新的概念與方法，成功地誘導出抗癌的過繼免疫應答。首先CART解決了抗原 的難題。既然在自然的狀況下免疫系統找不到抗原，那就人為指定一種抗原。考察急性淋巴 B細胞白血病的CART療法。淋巴B細胞表面有一個分化抗原CD19,無論是正常B細胞還是癌變 B細胞都有表達。選⑶19為靶抗原可以確保沒有漏網之魚。接下來，怎樣確保T細胞能找到 ⑶19靶抗原?這也是CART的核心技術。自然的T細胞肯定不會將⑶19當作靶抗原的。CD19表 達于正常B細胞，T細胞對CD19耐受。CART將一個抗原受體嵌合到T細胞表面。這抗原受體本 質是一種抗體，對CD19有很高的親和性。兩者碰到就會結合，不離不棄。于是，用抗體蛋白聯 接定位，T細胞就釘住了癌細胞。所以有一比喻，這抗原受體就像GPS，給T細胞導航，為找到 目標提供了保證。抗體又是怎樣插入進T細胞的？這是通過基因轉染技術實現的。這里轉染 的并不是抗體本身而是編碼抗體的基因，也就是說轉染的是DNA。轉染的DNA會編碼抗體然 后表達于T細胞表面。
[0005] 僅僅嵌合了抗體的T細胞療法是第一代CART，解決了靶抗原或第一信號的問題。但 是臨床效果差強人意，原因是第二信號即共刺激信號的缺失。沒有共刺激信號T細胞仍然沒 法激活，那樣就算釘住了癌細胞也沒有戰斗力。產生共刺激信號需要T細胞和抗原提呈細胞 之間的互動。可是抗原提呈細胞也需要第一信號。這樣勢必還要將同樣的抗體嵌合進抗原 提呈細胞如DC，過于復雜了。于是，針對共刺激信號又開發出第二代CART。第二代CART在靶 向⑶19的基礎上，加入了⑶28或⑶137, T細胞上的共刺激受體。T細胞的信號域包括:⑶％(T 細胞抗原受體信號轉導的組成成分)--CD28,或CD3G-一CD137。免疫應答的貫序可表述 為:CD 19激活抗體，抗體激活CD28(CD 137)，CD28 (CD 137 )激活CD3G。可以說，第二代CART同時 解決了第一信號和第二信號，不再依賴不怎么靠譜的腫瘤相關抗原，不再依賴抗原提呈細 胞，也不必擔心MHC的低表達。第三代CART的特點是在⑶28之后又加入了共刺激分子蛋白 0X40或4-lBB(4-lBB就是⑶137)。這兩種共刺激分子蛋白可進一步活化T細胞，延長生存期。 三代CART技術的演化反映了共刺激分子的重要作用。
[0006] 急性淋巴B細胞白血病的CART療法獲得了驚人的90%-100%的響應率，長期有效，不 少病患完全緩解也就是臨床痊愈了。更何況，這些入組CART的病患都是化療失敗、骨髓移植 后復發等就快走投無路重病患。CART將會成為人類歷史上偉大里程碑:真正治愈癌癥的方 法。
[0007] 推廣CART療法的主要障礙來自脫靶效應。像CD19不是腫瘤的靶點，而是B細胞本身 的靶點。腫瘤細胞清除掉的同時B細胞也被清除掉了。這已不是殺敵一千，自傷八百。更不是 殺敵一千，自傷八十。而是寧可錯殺一千，絕不放過一個。好在患者沒有B細胞照樣可以生 存，只要定期輸入丙種免疫球蛋白即可。只要靶點不是百分百腫瘤特異性，就會有脫靶效 應，這是CART副作用的主要來源。據報道，一例以HER2為靶抗原針對結腸癌的第三代CART治 療，病人輸入CART十五分鐘后出現呼吸窘迫，五天后死亡。檢測到高水平的細胞因子并發現 CART細胞浸潤肺組織。一個解釋是靶抗原在正常肺組織中有表達。為了提高CART治療安全 性和有效性，一個保守的劑量遞增方法是在2天或以上分散T細胞輸入劑量，不斷監測毒性 跡象，阻止可能誘發大規模反應的進一步T細胞輸入。用單克隆抗體封閉靶抗原來緩解脫靶 反應也是必要時的一種選擇。最近還提出了引入自殺基因的方案，必要時立即啟動CART自 殺，目前在III期臨床試驗。CART療法另一副作用是細胞因子風暴。據報道早期CART治療時 60%的病患要住ICU。現在用劑量遞增方法可大大減少細胞因子風暴的產生。
[0008] 綜上所述，嵌合抗原受體CAR能與革E抗原高親和性結合而不受中樞耐受的影響，這 一特性使得CAR的免疫治療能夠克服以往免疫治療的大部分缺陷。到目前為止大多數臨床 CART引人注目的結果都來自治療血液疾病，針對實體瘤的CART臨床也開始起步。CART療法 的風險在于抗原受體的非特異性造成的脫靶效應。
【發明內容】
[0009] 本發明要解決的技術問題是提供一種T細胞抗原受體基因，為食管癌的治療提供 一個新的技術方向。
[0010] 為解決上述技術問題，本發明所采取的技術方案如下。
[0011 ] -種T細胞抗原受體基因，主要由如下五部分構成:⑶8-pre序列，EGFR-scFv序列， ⑶8鉸鏈+跨膜序列，4-1BB或⑶137序列，⑶沉序列。
[0012]具體的，本發明的T細胞抗原受體基因具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。
[0013]進一步的，本發明還包括含有上述基因的重組載體。
[0014] 進一步的，本發明還包括含有上述基因的轉化體。
[0015] 進一步的，本發明還包括含有上述基因的T細胞。
[0016] 進一步的，本發明還包括由上述基因經轉錄表達形成的抗原受體。
[0017] 進一步的，本發明還包括嵌合有上述抗原受體的T細胞。
[0018] 進一步的，本發明還包括上述的T細胞抗原受體基因在制備抗食管癌藥物中的應 用。
[0019] 進一步的，本發明還包括上述的抗原受體在制備抗食管癌藥物中的應用。
[0020] 進一步的，本發明還包括上述的嵌合有抗原受體的T細胞在制備抗食管癌藥物中 的應用。
[0021] 采用上述技術方案所產生的有益效果在于:本發明的抗原受體及其基因是經過發 明人精心設計和嚴格試驗驗證的，是本發明的核心技術點。參見下文的【具體實施方式】部分， 利用本發明的抗原受體基因制備的"嵌合抗原受體T細胞CART-EGFR"相比"CART-對照組"展 現出了特定的食管癌相關功能活性，本發明的基因針對食管癌的治療具有重要的潛在和實 際價值。
【附圖說明】
[0022]圖1為二代和三代的CAR結構示意圖。
[0023] 圖2顯示CART細胞制備流程。
[0024] 圖3顯示CART-EGFR及CART-對照組的GFP表達結果。
[0025] 圖4顯示CART-EGFR細胞分群。
[0026] 圖5顯示CART-對照組細胞分群。
[0027]圖6顯示流式細胞儀檢測細胞EGFR表達的結果。
[0028] 圖7顯示CART-EGFR及CART-對照組細胞分泌結果。
[0029] 圖8顯示CART-EGFR、CART-對照組對靶細胞及非靶細胞的殺傷作用。
[0030] 圖9顯示CART-EGFR、CART-對照組GFP細胞檢測結果。
【具體實施方式】
[0031]以下實施例詳細說明了本發明。本發明所使用的各種原料及各項設備均為常規市 售產品，均能夠通過市場購買直接獲得。
[0032] 實施例1、CAR-EGFR的設計與構建 1- 1、CAR的設計說明。經統計，目前臨床實驗中使用最多的CAR結構包括二代和三代CAR (參見附圖1)，在有關的臨床報道中，二代CAR報道較多，其中尤其以賓夕法尼亞大學主導的 CAR結構療效顯著(NCT01626495，NCT01029366)，因此我們采用了此二代CAR框結構。
[0033] 1-2、CAR的結構及構建。CAR-EGFR序列包括如下幾個部分:CD8-pre，EGFR- scFv， CD8鉸鏈+跨膜，4-lBB(CD137)，CD3G。其完整序列參見SEQ ID N0:1。
[0034] 1-3、CAR對照組的結構及構建。CAR-對照組序列結構包括:CD8-pre，EGFR- scFv， 〇)8-八〇)沉。其完整序列參見3￡0 10從):2。
[0035] 實施例2、CAR-EGFR修飾的T細胞(CART-EGFR)的制備與表型驗證 2- 1、CART-EGFR及CART-對照組的制備。CART-EGFR及CART-對照組制備流程如附圖2所 示。具體包括如下內容： 2_1_1、實驗試劑和實驗儀器： 實驗試劑包括： Ficol1-Paque PLUS(GE，cat#17-1440_02) 完全培養基TexMACS (Miltenyi Biotechnolog，cat#170-076-309)+IL-2 (Miltenyi Biotechnolog，cat#l30-097-748) PerCP5.5 anti-human CD3(BD,cat#552852) PE anti-human CD4(BD，cat#555347) APC anti-human CD8(BD，cat#555369) FACS buffer:PBS+2.5%FBS TRANS B〇
[0036]實驗儀器包括： 離心機:湘儀L550 流式細胞儀:K) C6 C02培養箱:ESCO MC0-20AIC 細胞計數儀:Cellometer Auto 1000。
[0037] 2-1-2、PBMC分離：將新鮮血液轉移到50 mL離心管中。用生理鹽水按照1:1(體積 比）進行稀釋，輕輕上下吹打3-5次混勻。將6 mL Ficoll加入到15 mL離心管中，豎直放置 到水平臺面上靜置備用。將稀釋好的血液(總體積8 mL)用移液管緩慢均勻加入到豎直放置 在臺面的含Ficoll溶液的離心管中。將加好血液與Ficoll的離心管輕輕轉移至離心機中。 在轉移離心管過程盡量減少晃動，保持離心管豎直，以避免打破液面分層。室溫400g離心30 分鐘。離心結束后，輕輕轉移離心管至超凈臺中。用移液器吸取中間的白膜層（即淋巴細胞 層)轉移至新的50 mL離心管中。盡量避免吸取到下層或上層的細胞，避免造成污染。加入30 mL生理鹽水至上述轉移出來的淋巴細胞中，輕輕吹打混勻，60-100g室溫離心10分鐘。 重復洗滌淋巴細胞，去除上清，加入一定量的完全培養基重懸細胞。計數調整密度為5*10 5 細胞/ml，預先處理過的12孔板中每孔加入lml。將培養板放置于37° C，5%C02培養箱培養48 小時。
[0038] 2-1-3、慢病毒感染：收集上述PBMC，室溫300g離心4min，調整密度為5*105細胞/ ml，新的12孔板中每孔加入lml細胞，實驗組加入7.5ul EGFR二代CAR的慢病毒(慢病毒的制 備是比較常規化的技術，可以自行制備或提供本發明的基因序列交由上海吉凱基因化學技 術有限公司制備），病毒滴度為2*10 8/mL，M0I=3;對照組加入7.5ul對照病毒，病毒滴度為2* 108/11^101=3，每孔加入一定的11^吧8感染試劑打1^奶8感染試劑購自上海吉凱基因化 學技術有限公司；其用量依據產品說明書確定）。將細胞培養板置于37° C，5%C02培養箱培 養。第三天每孔加入lml新鮮的培養基，繼續培養。第七天計數計算擴增倍數。
[0039] 本次制備，初始PBMC細胞量均為1E+6，第七天時實驗組PBMC細胞量為2.50E+07，其 中97.9%為⑶3 +T細胞，見圖2，細胞擴增倍數約為25倍;對照組PBMC細胞量為1.77E+07，細 胞擴增倍數約為17倍，見表1。
[0040] 表1 CART-EGFR及CART-對照組細胞增殖
2-2、CART-EGFR表型檢測。實驗目的：確定CART-EGFR及CART-對照組的感染效率。實驗 設計:流式細胞儀檢測所制備細胞GFP的表達。計數每個細胞取出1.0 xlO6個，lOOOrpm，離 心3min，加入lOOul FACS buffer 重懸細胞，加入 15ul APC anti-human CD8、15ul PE anti-human CD4、15ul PerCY5.5 anti-human 003。4。〇避光孵育30min，1000rpm，離心 3min，去掉上清加入FACS buffer再洗兩遍。加入150ul FACS buffer重懸細胞，FACS檢測 焚光。用I3D Accure C6 software對數據進行處理分析。實驗結果及分析：CART-EGFR及 CART-對照組GFP表達結果如圖3。如圖3所示，CART-EGFR感染效率約為56.1%，CART-對照組 感染效率約為19.3%。
[0041 ] 2-3、CART的細胞分群檢測。實驗目的：確定CART-EGFR的細胞中T細胞的亞群分布 特征。實驗設計:流式細胞儀檢測所制備細胞表面標志物，檢測標的及意義如下表2所示。
[0042] 表2 T細胞亞群分布
實驗結果及分析:CART-EGFR及CART-對照組細胞分群檢測結果如圖4、5。由上述結果可 知，所制備的CART-EGFR細胞分群如表3;所制備的CART-對照組細胞分群如表4。
[0043] 表3 CART-EGFR細胞亞群分布比例
表4 CART-對照組細胞亞群分布比例_
實施例3、CART-EGFR的功能驗證--靶細胞的驗證 實驗目的:檢測靶細胞和非靶細胞上EGFR的表達。實驗設計:使用EGFR的流式抗體對靶 細胞(Ecal09)及對照細胞(MCF7)進行檢測。實驗結果與分析：流式細胞儀檢測Ecal09及 MCF7 EGFR表達結果如圖6，結果顯示陰性對照MCF7中EGFR表達較低，但靶細胞Eca 109中 EGFR高表達。
[0044] 實施例4、CART-EGFR的體外功能驗證--細胞因子分泌實驗。
[0045] 實驗目的:通過檢測CART-EGFR細胞與靶細胞共同孵育后，細胞因子分泌是否有上 升判斷CART是否有功能。實驗設計:分別對比CART-EGFR、CART-對照組與靶細胞和非靶細胞 共同孵育后，培養基上清中細胞因子的分泌情況。試劑包括:Human TH1/TH2 cytokine CBA kit(BD，Cat#550749)。細胞（Cell line)包括：MCF7(Medium:DMEM+10%FBS) ;ECA109 (Medium:DMEM+10%FBS)。儀器包括:離心機:湘儀L550;流式細胞儀:BD C6。實驗方法包括： 4-1、細胞因子分泌:收集靶細胞，用稀釋緩沖液將細胞洗滌一次，lOOOrpm 3min離心， 棄上清，以含2% FBS的1640重懸細胞，計數，最終將細胞稀釋到1*106個/ml濃度;收集CART 細胞(效應細胞），用稀釋緩沖液將細胞洗滌一次，lOOOrpm 3min離心，棄上清，2% FBS的 1640重懸細胞，計數，最終將細胞稀釋到1*106個/ml濃度;將100ul靶細胞和100ul CART細 胞1:1混合加入96孔板中，37°C、5%C02共同培養20-24小時；lOOOrpm 5min離心，收集上清檢 測細胞因子。
[0046] 4-2、細胞因子檢測:準備15ml離心管，在瓶蓋上標注1，將標準品轉移至EP管內，并 向其中加入標準品稀釋液2ml，輕柔顛倒混勻，室溫防止15min-20min平衡。取9支1.5ml EP 管，并向每管中加入300ul標準品稀釋液，瓶蓋上標注編號2-9,在1管中取300ul至2管內混 勻；在2管內取出300ul至3管內，依次類推進行2倍梯度稀釋，另取一支1.5ml EP管，加入 300ul標準品稀釋液作為陰性對照。確定好需要檢測的細胞因子及樣品個數。取出待檢測的 細胞因子捕獲珠子瓶，用力混勻。每種珠子取出（待檢測樣品數+標準品數+陰性對照數)* l〇ul的捕獲珠子量。并將每種珠子進行渦輪震蕩混勻。用標準品稀釋液對樣品進行稀釋(稀 釋倍數可自行決定，如1:10、1:100等)取N個1.5ml EP管(N=樣品數+標準品數+對照數）向 每管(標準品、樣品、陰性對照）中加入50ul混合珠子;并向各管中加入相應待測試劑(標準 品、樣品、對照）50ul以及PE Detection Reagent 50ul，充分混合后，避光室溫孵育3小時。 向每管中加入lml wash buffer，輕柔吹勾后200g離心5分鐘。小心吸去上清，并向每管中加 入300ul wash buffer，并重懸沉淀。將樣品進行流式細胞儀檢測。用BD的FCAP Array v3軟 件對數據進行處理分析。
[0047] 4-3、實驗結果與分析:本次實驗分別檢測了 IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF_a、IFN- Y的分泌，其中IL-4和TNF-a分泌水平較低，變化不明顯，結果如圖7所示，CART-EGFR在存在 靶細胞時，細胞因子的分泌高于CART-對照組，結果顯示CART-EGFR具有一定的功能活性。 [0048]實施例5、CART-EGFR的體外功能驗證--細胞殺傷能力檢測。
[0049] 實驗目的：檢測CART-EGFR及CART-對照組的殺傷能力。實驗設計:通過LDH釋放實 驗，判斷CART細胞對靶細胞的特異殺傷。實驗結果與分析:CART-EGFR和CART-對照組對靶細 胞及非靶細胞的裂解效應如圖8。與CART-對照組相比，CART-EGFR對靶細胞具有一定殺傷活 性，在CART-EGFR:靶細胞比例為20:1共培養4hr后，靶細胞裂解率為40.42%。
[0050] 實施例6、存在靶細胞時CART-EGFR的增殖實驗 實驗目的：檢測CART-EGFR及CART-對照組在靶細胞存在時的增殖作用。實驗設計： CART-EGFR及CART-對照組與靶細胞比例為2:1，共同培養48小時，流式細胞儀檢測帶有GFP 細胞的增殖。實驗結果與分析:CART-EGFR和CART-對照組細胞增殖結果如圖9,在靶細胞存 在條件下，CART-EGFR及CART-對照組增殖不明顯。
[0051] 由上述試驗例可知，利用本發明的抗原受體基因制備的嵌合抗原受體T細胞CART-EGFR相比CART-對照組展現出了一定的功能活性，本發明的基因針對食管癌的治療具有重 要的潛在和實際價值。
[0052]上述描述僅作為本發明可實施的技術方案提出，不作為對其技術方案本身的單一 限制條件。
【主權項】
1. 一種T細胞抗原受體基因，其特征在于：該基因主要由如下五部分構成：CD8-pre序 列，EGFR-scFv序列，CD8鉸鏈+跨膜序列，4-1BB或CD137序列，0)3ζ序列。2. 根據權利要求1所述的Τ細胞抗原受體基因，其特征在于:其具有SEQ ID NO: 1所示的 核苷酸序列。3. 包含權利要求1或2所述基因的重組載體。4. 包含權利要求1或2所述基因的轉化體。5. 包含權利要求1或2所述基因的T細胞。6. 由權利要求1或2所述基因經轉錄表達形成的抗原受體。7. 嵌合有權利要求5所述抗原受體的T細胞。8. 權利要求1所述的T細胞抗原受體基因在制備抗食管癌藥物中的應用。9. 權利要求5所述的抗原受體在制備抗食管癌藥物中的應用。10. 權利要求6所述的嵌合有抗原受體的T細胞在制備抗食管癌藥物中的應用。
【文檔編號】C12N5/0783GK105821064SQ201610251248
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年4月21日
【發明人】汪治宇
【申請人】汪治宇