一個簇毛麥凝集素類受體激酶基因及其表達載體和應用【專利摘要】本發明公開了一個簇毛麥凝集素類受體激酶基因及其表達載體和應用，屬于基因工程領域。Hv-LecRK的cDNA序列為SEQIDNO.1及其編碼的氨基酸序列為SEQIDNO.2。該基因來自二倍體簇毛麥(Haynaldiavillosa,L.,2n＝2x＝14,基因組VV)，可以和白粉病抗性相關基因Hv-CMPG互作，在抗白粉病二倍體簇毛麥中受白粉菌誘導表達增強。通過瞬間表達將該基因轉化感病小麥品種揚麥158，結果表明Hv-LecRK基因的過量表達可以降低揚麥158的吸器指數。因此，Hv-LecRK可望用于基因工程育種，將其導入易感白粉病小麥品種中，有望提高小麥的白粉病抗性。【專利說明】一個簇毛麥凝集素類受體激酶基因及其表達載體和應用
技術領域：
[0001]本發明屬于基因工程領域，公開了一個簇毛麥凝集素類受體激酶基因及其表達載體和應用。【
背景技術：
】[0002]由專性寄生真菌小麥白粉病菌（BlumeriagraminisDCf.sp.tritici)引起的小麥白粉病是小麥（TriticumaestivumL.，2n=6x=42，基因組AABBDD)最嚴重的葉部病害之一，在中國及其他許多國家廣泛發生。該病在小麥整個生育期都可發生，并且可侵害小麥地上植株各個部分，以葉片和葉鞘為主。[0003]隨著栽培品種、栽培條件以及氣候條件的影響，目前我國小麥白粉病危害呈加重趨勢。白粉病能用殺菌劑防治，但化學防治必然增加人力、物力投入，而且還會引起環境污染等生態問題，因此發掘抗病基因、培育抗病品種是防治小麥白粉病的有效措施。明確小麥抗白粉病的機制，克隆抗病相關基因，可以為小麥白粉病防治、小麥抗白粉病育種提供重要的理論和物質基礎。[0004]栽培小麥的親緣物種在長期進化和自然選擇過程中，保留了大量的抗病蟲害、抗逆、優質等有益基因，是普通小麥品種改良的重要基因來源，因此，研究和利用親緣物種抗病基因，是改良小麥抗病性的重要途徑。[0005]簇毛麥（HaynaldiavillosaL.，2n=2x=14，基因組VV,)是普通小麥的二倍體親緣物種，具有高抗白粉病的優良性狀。在研究過程中發現，來自簇毛麥的Hv-CMPG基因受白粉病誘導快速上調表達，在抗白粉病中發揮重要的正向調控作用。Hv-CMPG基因編碼一個E3連接酶，參與泛素化過程，識別目標底物蛋白并對其進行泛素化修飾（HershkoA，TheUbiquitinSystem.Springer,1998)，或與底物蛋白互作或通過26S蛋白酶體將底物蛋白降解。【
發明內容】[0006]本發明的目的提供一種受體蛋白激酶基因Hv-LecRK。[0007]本發明的另一目的是提供該基因的表達載體。[0008]本發明的又一目的是提供該基因和表達載體的應用。[0009]本發明的目的可通過如下技術方案實現：[0010]凝集素類受體激酶基因Hv-LecRK，來自二倍體簇毛麥（Haynaldiavillosa,VV,2n=14)，其核苷酸序列為SEQIDNO.1。[0011]該受體激酶基因編碼的蛋白質Hv-LecRK，其氨基酸序列為SEQIDNO.2。[0012]含有所述的凝集素類受體激酶基因Hv-LecRK的表達載體。[0013]所述的含有權利要求1所述的凝集素類受體激酶基因Hv-LecRK的表達載體優選以PBI220為出發載體，將權利要求1所述的Hv-LecRK基因插入載體pBI220的BamHI和KpnI酶切位點間所得。[0014]所述的凝集素類受體激酶基因Hv-LecRK在構建抗白粉病小麥品種中的應用。[0015]所述的含凝集素類受體激酶基因Hv-LecRK的表達載體在構建抗白粉病小麥品種中的應用。[0016]有益效果[0017]本發明首次從簇毛麥中克隆得到了一個和白粉病抗性相關基因凝集素類受體激酶基因Hv-LecRK及其所編碼的蛋白質Hv-LecRK，為簇毛麥中首次報道。將其插入表達載體PBI220,得到的該基因的過量表達載體導入感病小麥品種中，可以提高感白粉病小麥品種對白粉病的抗性。Hv-LecRK用于基因工程育種，將其導入易感白粉病小麥品種中，能夠提高小麥的白粉病抗性。【附圖說明】[0018]圖lHv-LecRK基因的克隆[0019]M:DL2000;1:Hv-LecRK基因[0020]圖2Hv-LeCRK在二倍體簇毛麥白粉菌誘導后的葉片中的Q-PCR分析[0021]X軸：0h、30min、45min、lh、2h、6h、12h、24h、48h、72h分別表示簇毛麥接白粉菌后的不同時間段；Y軸：Hv-LecRK基因在不同樣品中受白粉菌誘導后的表達倍數。[0022]圖3Hv_LecRK過量表達載體構建[0023]圖4利用單細胞瞬間表達技術研究Hv-LecRK抗病效應[0024]圖5Hv-LecRK轉化揚麥158T。代植株PCR鑒定[0025]圖6Hv-LecRK轉化揚麥158T。代植株離體鑒定【具體實施方式】[0026]實施實例lHv-LecRK基因的克隆[0027]在本實驗室前期的研究中發現Hv-CMPG基因在小麥抗白粉病中起重要作用，為更好地研究Hv-CMPG基因抗白粉病的機制，以Hv-CMPG基因為誘餌利用酵母雙雜交技術，篩選酵母雙雜交文庫獲得Hv-LecRK基因。設計引物PI:ATGGCCTTGGTCGTGTGCCCC(SEQIDN0.3)和P2:TCATCTTCCACCTGAGATGTA(SEQIDNO.4)，以簇毛麥受白粉菌誘導后24h的cDNA為模板，克隆Hv-LecRK基因，得到Hv-LecRK基因的全長，序列為SEQIDNO.1(圖1)。[0028]實施例2Hv-LeCRK基因受白粉菌誘導的表達特征[0029]將高抗白粉病的簇毛麥品系91C43(編號：PI368886,引自英國植物園）（參考文獻：齊莉莉，陳佩度，等，小麥白粉病新抗源一基因Pm21，作物學報，1995,21(3):257-262)播于培養皿中發芽，露白后移栽到盆缽（周圍用圓柱狀透明塑料片隔離，頂端用濾紙封閉，形成無白粉菌的環境）。待三葉期，把在感病品種蘇麥三號上培養的南京本地混合白粉菌新鮮孢子輕輕抖落在簇毛麥的幼苗上。接種白粉菌后的簇毛麥葉片保存在16°C。接種后0h、30min、45min、lh、2h、6h、12h、24h、48h、72h取樣，置于一70°C冰箱內保存備用。用TRIZOL(Invitrogen)提取受白粉菌誘導的簇毛麥葉片的RNA，利用AMV酶（Takara)合成反轉錄第一鏈，得到反轉錄產物。[0030]應用能擴增Hv-LecRK的特異引物P3:ACGCTTAGGGGACTTCG(SEQIDN0.5)和P4:CCTTCGCCCACAGGTTA(SEQIDNO.6)，對該基因在受白粉菌誘導樣品中進行Q-PCR分析。PCR反應在Q-PCR儀（RocheLightCycler480,Roche)上擴增。20ylPCR反應體系中含2ylcDNA,10y12XSYBREXTaqTM(TakaRa)，0?4y1引物PI(10yM)和P2(10yM)。擴增參數為：95°C5min，然后95°C10s、60°C30s，72°C15s，共41個循環。反應結束后，計算相對表達量：根據得到的CT值計算目標基因在處理后的不同時間點相對于未處理的相對表達量，即2AACT。其中，AACT=(CT.Target_CT.Tublin)Timex_(Ct.Target_CT.Tublin)Time。。TimeX表示任意時間點，Time0表示未處理點。結果表明，和看家基因（Tubulin)相比較，在簇毛麥葉片中Hv-LecRK受白粉菌誘導上調表達，在簇毛麥葉片受白粉菌誘導45min后表達水平達到峰值，之后開始下調，并在24h-72h維持高表達水平。Q-PCR的結果表明，Hv-LecRK可能與白粉病抗性相關（附圖2)。[0031]實施例3Hv_LecRK正義表達載體構建[0032]利用上述經白粉菌誘導后的簇毛麥cDNA為模板，以可擴增Hv-LecRK基因蛋白編碼區的引物對P3(CGGGATCCATGGCCTTGGTCGTGTGCC(SEQIDN0.5))和P4(GGGGTACCTCATCTTCCACCTGAGATG(SEQIDNO.6))進行PCR擴增，回收擴增片段。用BamHI和Kpnl雙酶切將擴增目標片斷插入到載體pBI220(JeffersonRA，KavanaghTA，BevanMW?⑶Sfusions:beta-glucuronidaseasasensitiveandversatilegenefusionmarkerinhigherplants.EMB0J.1987,6:3901-3907)的35S啟動子后面的多克隆位點BamHI和Kpnl之間。由此將目標基因Hv-LecRK克隆到強啟動子35S的下游，獲得表達載體pBI220:LecRK(圖3)。[0033]實施例4利用單細胞瞬間表達方法將Hv-LecRK基因轉入小麥葉片[0034]單細胞瞬間表達方法是一種可靠且快速鑒定基因功能的方法（公知公用,Schweizer,Pokornyetal.ATransientAssaySystemfortheFunctionalAssessmentofDefense-RelatedGenesinWheatMolecularPlant-MicrobeInteractions.1999,12:647-654)。本研究利用單細胞瞬間表達方法，將質粒DNA包裹到金屬微粒外層，借助基因槍將金屬微粒轟擊到小麥葉片的表皮細胞，然后統計轟擊Hv-LecRK細胞的白粉菌吸器指數與未轟擊Hv-LecRK細胞的白粉菌吸器指數，明確目標基因是否具有白粉病抗病功能。[0035]載體DNA與金屬微粒包裹的程序如下：[0036]制備媽粉：稱取30mg的媽粉于1.5mleppendorf管中，加入1ml70%酒精，禍旋3-5min后靜置15min，使金粉完全沉淀。12,OOOrpm離心lmin后棄上清。加入lmlddH20，渦旋混勻后，離心棄上清（重復3次）。最后加入500iil50%甘油渦旋混勻，備用。[0037]包裹子彈：吸取5y1渦旋均勻的鎢粉于1.5ml的印pendorf管中，加入5y1質粒DNA(總量應為1yg，如質粒濃度較大不夠5y1的用ddH20稀釋成5y1/1yg的濃度）。邊禍旋邊向eppendorf管內滴加50y12.5MCaCl2,然后加入20y10?1M亞精氨（現配先用），禍旋3min。[0038]靜置lmin后離心2s，棄上清。加入140yl70%酒精，充分渦旋，離心2s，棄上清。然后加入140yl100%酒精，充分渦旋，離心2s，棄上清。最后加入15yl100%酒精，充分渦旋，以備使用。[0039]實施⑶S基因單轉化時，將含有⑶S基因表達載體pAHC25(ChristensenAH，QuailPH.Ubiquitinpromoter-basedvectorsforhigh-levelexpressionofselectableand/orscreenablemarkergenesinmonocotyledonousplants.TransgenicResearch,1996,5:213-218)的質粒DNA與鎢粉包裹；當實施Hv-LecRK與⑶S基因共轉化時，將含有Hv-LecRK基因表達載體pBI220:LecRK的質粒DNA與含有⑶S基因表達載體PAHC25的質粒DNA按摩爾濃度1:1的比例混合，包裹鎢粉。當⑶S基因與Hv-LecRK基因進行共轉化時，Marker基因⑶S轉入的細胞也是Hv-LecRK轉入的細胞。因⑶S基因表達的細胞經染色整個細胞呈現藍色，所以本研究以藍色細胞作為Hv-LecRK的表達細胞。[0040]基因槍轟擊程序如下：剪下長約6cm的小麥幼苗葉片端部，平行貼在載玻片上，每張玻片貼6片葉片左右。基因槍使用roSlOOO/He系統，采用1350psi的可裂膜片，真空度為28inHg。轟擊后將葉片置于墊有潤濕濾紙的瓷盤內，罩以打有小孔的保鮮膜，保濕并透氣，18-20°C恢復培養4h后，高密度接種白粉菌分生孢子。接種48h后用GUS染液（配方為：0?ImolLNa2HP04/NaH2P04緩沖液（pH7.0)，含lOmmolLEDTA，5mmolL鐵氰化鉀和亞鐵氰化鉀，〇?lmg/mlX_Gluc，0.1%TritonX_100,20%甲醇，）真空滲透10min，37°C染色12h，然后用70%酒精脫色2天直至葉片變成白色為止，最后利用濃度為0.6%的考馬斯亮藍對白粉菌孢子染色。[0041]白粉菌侵入小麥葉片表皮細胞后，在表皮細胞中產生的指狀物稱為吸器。吸器不能正常產生是葉片細胞對白粉菌具有抗性的重要指標。在GUS表達的細胞中，細胞會被GUS染色液染成藍色，在顯微鏡下容易辨認。在GUS基因轉化細胞后，通過統計與白粉菌互作的GUS表達細胞中，吸器形成的細胞所占的比例（％)，即為"吸器指數"（公知公用，Schweizer,Pokornyetal.ATransientAssaySystemfortheFunctionalAssessmentofDefense-RelatedGenesinWheatMolecularPlant-MicrobeInteractions.1999,12:647-654)。吸器指數越小，表明抗病性越強。本研究利用"吸器指數"作為抗病強弱的衡量指標。[0042]當單獨轉化⑶S基因時，感白粉病小麥品種揚麥158中的吸器指數為62.68%;當⑶S基因與Hv-LecRK共轉化感白粉病小麥品種揚麥158后，統計了⑶S基因表達（即Hv-LecRK表達）且有白粉菌互作的細胞的吸器指數，結果表明當Hv-LecRK轉入后，揚麥158的吸器指顯著下降，平均從62.68%降到35.98%(圖4)。該結果說明，Hv-LecRK的瞬間過量表達可以顯著地降低吸器指數，Hv-LecRK對白粉菌具有抗病作用。[0043]實施例5Hv-LeCRK的穩定遺傳轉化及基因功能研究[0044]利用基因槍介導的遺傳轉化方法（邢莉萍.小麥/簇毛麥抗白粉病相關基因的轉化及功能鑒定[D].南京農業大學，2007)將PBI220:HvLecRK轉化感病品種揚麥158的幼胚愈傷組織。挑取預培養7d的約2500個揚麥158幼胚愈傷組織，轟擊前在高滲培養基（MS+ABA0.5mg/L+水解酪蛋白500mg/L+2,4_D2mg/L+葡萄糖30g/L+0.4mol/L甘露醇，pH5.8)上預處理4-5h，將攜有目的基因HvLecRK的過量表達載體pBI220:HvLecRK通過基因槍轟擊法轉化到揚麥158中，轟擊后在高滲培養基上繼續培養16h。之后將愈傷組織轉移至恢復培養基（1/2MS+水解酪蛋白500mg/L+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L，pH5.8)上暗培養2周，再將其轉移至含有除草劑的篩選培養基上（1/2MS+ABA0.5mg/L+水解酪蛋白500mg/L+2,4-Dlmg/L+鹿糖30g/L+4mg/LBialaphos，pH5.8)，篩選培養2周。然后將具有抗性的愈傷組織轉移到分化培養基中（1/2MS+L-谷氨酞胺1mmol/L+水解酪蛋白200mg/L+KTlmg/L+IAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂0.8%，pH5.8)進行分化，待分化芽長至2-4cm時將其轉移至生根培養基（1/2MS+KTlmg/L+蔗糖30g/L+瓊脂0.8%，pH5.8)中，至再生苗長約8cm、根系較健壯時，即可開管煉苗1_2d，最后洗去根系攜帶的培養基殘渣便可移栽入盆缽，獲得再生植株共280棵。[0045]提取所有再生植株基因組DNA，對轉化植株利用載體上啟動子引物P5(TGCGATAAAGGAAAGGCTATC(SEQIDN0.7))和基因內部引物P6(GAGGTAGTAGCCCGTAGGGTAGGA(SEQIDN0.8))進行PCR擴增，鑒定陽性轉基因植株。PCR程序：10-50ng/ul基因組模板，10yM的P5和P6各0?5y1;2.5y1lOXbuffer;2.5y12.5mM的dNTP;1.5y125mM的Mg2+;0.25y1(5U/y1)Taqpolymerase(TaKaRa)，加水至25y1。PCR反應條件為：94°C預變性3min;94°C30s，55°C45s，72°C458,35個循環；72°〇延伸lOmin。PCR產物經8%的聚丙烯凝膠電泳檢測，其中9株可以擴增600bp的目的條帶，鑒定為陽性植株，株系編號依次為：LecRK-TQ-16-3、LecRK-TQ-19-l、LecRK-TQ-19-2、LecRK-T。33-5、LecRK-To-36-1、LecRK-To-37-1、LecRK-To-38-4、LecRK-To-40-4、和LecRK-T0-55-3(圖5)。[0046]用江蘇南京地區田間采集的白粉病菌混合菌種，對所有PCR鑒定的T。代陽性植株進行白粉病抗性鑒定，同時接種轉基因受體品種揚麥158作為對照。抗性鑒定標準采用"0-9級"白粉病抗性反應型的分級標準，0-2級為高抗、3-4級為中抗、5級以上為感病。苗期離體抗性鑒定的兩次重復結果表明：揚麥158表現為中感或高感，陽性轉基因植株均表現為高抗（表1，圖6)。[0047]表1Hv-LecRK轉基因T。代植株的白粉病抗性鑒定【主權項】1.一個簇毛麥凝集素類受體激酶基因Hv-LecRK，其特征在于其核苷酸序列為SEQIDNO.1〇2.權利要求1所述凝集素類受體激酶基因編碼的蛋白質Hv-LecRK，其特征在于其氨基酸序列為SEQIDNO.2。3.含有權利要求1所述的凝集素類受體激酶基因Hv-LecRK的表達載體。4.根據權利要求3所述的表達載體，其特征在于所述的凝集素類受體激酶基因Hv-LecRK的表達載體是以pBI220為出發載體，將權利要求1所述的Hv-LecRK基因插入PBI220的BamHI和ΚρηΙ酶切位點間所得。5.權利要求1所述的凝集素類受體激酶基因Hv-LecRK在培育抗白粉病小麥品種中的應用。6.權利要求3或4所述的含凝集素類受體激酶基因Hv-LecRK的表達載體在培育抗白粉病小麥品種中的應用。【文檔編號】C12N15/82GK105821055SQ201510001972【公開日】2016年8月3日【申請日】2015年1月4日【發明人】王秀娥,程江月,李穎波,肖進,王宗寬,王海燕,曹愛忠,邢莉萍,祝燕飛,法希姆穆罕默德,袁春霞,郝永利,趙佳,陳煒,陳忠明【申請人】王秀娥,南京農業大學,江蘇瑞華農業科技有限公司