一種識別膠質瘤干細胞(gsc)的核酸適體及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種識別膠質瘤干細胞(GSC)的核酸適體及其制備方法。涉及一種核酸，提供具有高特異性和高親和力的GSC的核酸適體及其制備方法與應用。所述GSC的核酸適體具有莖環結構，制備方法包括：設計并合成單鏈DNA隨機寡核苷酸庫，篩選目的寡核苷酸序列，并通過流式分析法鑒定其與靶細胞結合的特異性和親和力。篩選獲得的核酸適體分子量小，滲透性好，無毒性，經濟，易于合成與標記，能特異性識別GSC，而對其他細胞系不具有識別功能。
【專利說明】
一種識別膠質瘤干細胞(GSC)的核酸適體及其制備方法
技術領域
[0001] 本發明涉及一種核酸，特別涉及GSC的核酸適體制備方法及其在腫瘤靶向治療中 的應用。
【背景技術】
[0002] 膠質瘤是中樞神經系統腫瘤中最常見而又最難治療的惡性腫瘤，即使運用現代顯 微神經外科技術、放療、化療等綜合治療措施后，高度惡性的多形性膠質母細胞瘤患者3年 以上的生存率僅為2.2%，無疑給社會、家庭和患者帶來了沉重的精神和經濟負擔。1997年， Bonnet和Dick(l.Bonnet D，Dick JE.Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell.[J].Nat Med, 1997,3:730-737)從白血病腫瘤細胞中分離出少量細胞，它們是眾多腫瘤細胞中惟一具有 致瘤性的細胞，且能分化為其他腫瘤細胞，具有干細胞特征，從而證實了腫瘤干細胞的存 在。2004年Singh等（2?Singh SK,Hawkins C,Clarke ID,et al.Identification of human brain tumour initiating cells. [J]Nature,2004,432:396-401).從膠質瘤中分離出具 有干細胞樣特征的細胞，證明了膠質瘤干細胞(G1 ioma Stem Ce 11 s，GSC)的存在。現有的膠 質瘤治療方法，包括顯微神經外科手術、放射治療、化學治療以及免疫和基因治療，這些方 法往往只針對腫瘤實體中的已分化細胞，而忽視了腫瘤祖細胞和GSC，而這些占少量的GSC 很可能負責腫瘤的起源和生長、侵襲和復發。最新研究表明，GSC的存在是當前膠質瘤治療 療效不高、復發性高的一大可能原因之一（3.Cho WC.Updates in cancer research: insights from the AACRIOOth Annual Meeting.[J]Expert Rev Mol Diagn,2009,9: 411-416.)〇
[0003] TSC是腫瘤中具有自我更新能力并能多向分化的腫瘤細胞(3.Cho WC.Updates in cancer research:insights from the AACR 100th Annual Meeting.[J]Expert Rev Mol Diagn, 2009,9:411-416.)。許多研究證實了TSC在膠質瘤的發生、發展、耐藥、復發等過程中 起著關鍵作用。根據TSC理論，腫瘤起源于腫瘤組織中的一小部分具有增殖和轉移浸潤能力 的TSC，而腫瘤組織中其余大部分的腫瘤細胞并無轉移能力。TSC不僅具有干細胞的自我更 新和分化潛能的特性，這些細胞的另一特點就是耐藥性。TSC細胞膜上多數表達ABC transporter家族膜蛋白，這類蛋白大多可運輸并外排包括代謝產物、藥物、毒性物質、內源 性脂類物質、多肽、核苷酸及固醇類等多種物質，使許多對腫瘤非干細胞具有抑制或殺傷作 用的化療藥物卻對TSC殺傷作用明顯減弱。TSC的耐藥性直接影響了腫瘤化療的成敗。目前 腫瘤的常規治療，如放療、化療，可以殺死大部分腫瘤細胞，但是對存在于腫瘤中的數量稀 少的干細胞樣細胞群卻作用甚微。治療后殘存TSC的增殖，足以促使腫瘤復發和轉移。因此 在治療時，應該針對TSC，從源頭上根治腫瘤的發生。
[0004] 當前GSC研究的一個技術難題是如何獲得特異性標記物以用于GSC的分離純化。目 前人們主要是利用GSC特異性抗體來識別GSC，并通過細胞分選技術來分離GSC。現階段GSC 的標志物主要借助廣譜的干細胞標志物(如⑶133 )、黏附分子(如⑶15、CD34、神經細胞黏附 分子11)、神經干細胞標志物(如0)15、42135、11681：；[11、]\11183811；[1)、胚胎干細胞相關標志物(如 SOX家族蛋白、Nanog)等。CD133在人造血干細胞、神經干細胞、表皮干細胞、血管內皮祖細 胞、大腸癌、前列腺癌、肝癌中均有表達，它是一種廣譜的干細胞標志物(4.Prestegarden L,Svendsen A,ffang J，et al.Glioma cell populations grouped by different cell type markers drive brain tumor growth. [J]Cancer Res，2010,70:4274_4279) D因此， CD133作為GSC標志物的特異性受到了質疑。CD15抗原也稱階段特異性胚胎表面抗原-1，是 一種細胞黏附分子;CD34屬于鈣黏蛋白家族，在多種干(祖)細胞中表達。2010年Patru等 (5.Patru C,Romao L,Varlet P,et al.CD133,CD15/SSEA-1,CD34or side populations do not resume tumor-initiating properties of long-term cultured cancer stem cells from human malignant glio-neuronal tumors.[J].BMC Cancer,2010,10:66.)M 47例長期傳代的膠質母細胞瘤和髓母細胞瘤細胞系進行研究發現，各細胞系中存在不同亞 群，其中部分細胞具有干細胞樣特征，表達⑶133、⑶15、CD34等，但是⑶133、⑶15、⑶34的表 達情況以及Hoechst著色能力與致瘤性、化療抵抗均無明顯相關，且CD34與CD133幾乎不同 時表達，可見上述標志物并非特異性的GSC標志物。A2B5是膠質前體細胞膜表面的一種神經 節苷脂，多用于膠質瘤細胞譜系研究。2008年Ogden檢測了 25例WHO分級II~IV級膠質瘤，均 表達A2B5;而且⑶133僅表達于A2B5+細胞，在A2B5-細胞則無表達。但該研究未能說明A2B5+ 細胞的分化特性，未能進一步闡述〇)133+和4285+細胞之間的關系（6.(^(1611八1'，1 &2化1 AE,Lochhead RA,et al.Identification of A2B5+CD133-tumor-initiating cells in adult human gliomas ? [J] .Neurosurgery,2008,62:505-515)。因此，A2B5作為GSC標志物 有待進一步探討。Nestin在未分化的神經干細胞(Neural Stem Cells,NSC)和未成熟的星 形膠質細胞中表達，成熟的星形膠質細胞中消失，它是NSC的主要標志之一。雖然Nestin作 為GSC的一個重要指標被廣泛應用，Nestin高表達的高級別膠質瘤預后差(7. Arai H, Ikota H,Sugawara K,et al.Nestin expression in brain tumors:its utility for pathological diagnosis and correlation with the prognosis of high-grade gliomas ? [J]Brain Tumor Pathol ? 2012,29(3): 160-167 ?)，但能否作為GSC的特異性標志 物還有待商榷。此外，國內有學者用化療藥物長春新堿作用于膠質瘤細胞來篩選TSC，但由 于化療抵抗機制復雜，該方法得到的細胞目前只能稱為"富含TSC" (8. Zhou ZH，Ping YF，Yu SC,et al.A novel approach to the identification and enrichment of cancer stem cells from a cultured human glioma cell line.Cancer Lett,2009,281:92-99) 〇因此 尋找和發現GSC特異性的標記物成為解決問題的關鍵所在，并將會對膠質瘤的早期診斷、治 療和預后起著極其重要的意義。
[0005]核酸適配體是指從人工合成的單鏈DNA/RNA文庫中篩選得到的能夠與靶標高特異 性和高親和力結合的單鏈寡核苷酸。核酸適體借助氫鍵、范德華力、疏水作用等分子間弱作 用力形成特殊的三維結構，如發夾、假結、凸環、G-四聚體等，從而特異地識別靶物質甚至影 響其生物活性。核酸適體本身特有的生化特性使其在生物醫學應用領域具有諸多優勢，如 靶分子范圍廣、親和力與特異性強、合成修飾方便快速、分子量較小、良好的生物兼容性、無 毒、體外穩定性好等。核酸適體可以通過配體指數富集系統進化技術（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)篩選獲得，其基本原理是在 體外人工化學合成一個寡核苷酸文庫，包括RNA、ssDNA或修飾的RNA和ssDNA，通過寡核苷酸 文庫與目標分子的相互作用，結合PCR技術指數級放大與靶分子特異結合的寡核苷酸，經過 幾輪或數十輪篩選富集過程，獲得高親和力和高特異性的核酸適體。
【發明內容】
[0006] 本發明的第一目的在于提供具有高特異性和高親和力的GSC的核酸適體。
[0007] 其序列如下：
[0008] TT GAC TTG CCA CTG ACT ACC CCA GTA TCT CTT CAA CGC TAT GGT GCA TGT ACT ACG TAT TGA AGT CAG TCG GTC GTC ATC〇
[0009] 該序列可以被切短或部分堿基替換，所述的切短為兩端堿基分別或同時截短1-20 個堿基。在本發明的優選實施例中，其兩端堿基同時截短7個堿基，其也同樣具有和GSC的高 特異性和高親和力。
[0010] 本發明的第二目的在于提供GSC的核酸適體的制備方法。
[0011] 所述GSC的核酸適體的制備方法包括以下步驟：
[0012] 1)合成單鏈DNA隨機寡核苷酸庫，人膠質母細胞瘤細胞系U87為反篩細胞，去除DNA 隨機寡核苷酸庫中的非特異性結合部分，以GSC為正篩細胞篩選得到與GSC特異結合的核酸 序列；
[0013] 2)將步驟1)所得與GSC特異結合的核酸序列進行PCR擴增，PCR擴增產物以鏈酶親 和素微珠為基質進行分離，通過堿變性解鏈，過濾，純化，即得用于次輪篩選的單鏈DNA文 庫；
[0014] 3)將步驟2)所得的單鏈DNA文庫進行下一輪篩選，經過20輪篩選后獲得目的寡核 苷酸序列；克隆測序所述目的寡核苷酸序列，并鑒定其與GSC結合的特異性和親和力，獲得 GSC的核酸適體。
[0015]在步驟1)中，所述單鏈DNA隨機寡核苷酸庫的兩端為固定序列，中間為40個堿基的 隨機序列，即為5'-TTG ACT TGC CAC TGA CTA CC-40nt-GAA GTC AGT CGG TCG TCA TC-3'，庫容量為1015以上。
[0016] 在步驟2)中，所述PCR擴增的引物為：
[0017] 引物1:5，-FAM-TTG ACT TGC CAC TGA CTA CC-3'；
[0018] 引物2:5，-Biotin-GAA GTC AGT CGG TCG TCA TC-3'；
[0019] 所述PCR擴增產物為3 '端帶有生物素標記、5 '端帶有FAM標記的雙鏈DNA文庫。
[0020] 本發明的優點在于:CELL-SELEX技術與流式細胞分析法相結合的篩選方法使篩選 獲得的核酸適體無毒性，分子量小，滲透性好，易于合成與標記。通過SELEX方法篩選獲得的 核酸適體只特異性識別GSC，對其他細胞系不具有識別功能。上述優點使得所述核酸適體成 為GSC檢測的有力工具，識別GSC的核酸適配體在膠質瘤的診斷和靶向治療中具有重要的意 義。
【附圖說明】
[0021] 圖1為流式細胞儀檢測篩選進程中DNA隨機寡核苷酸庫對GSC的富集圖。在圖1中， 橫坐標為熒光強度，縱坐標為細胞數，曲線A為初始DNA隨機寡核苷酸庫，曲線B為第8輪DNA 隨機寡核苷酸庫，曲線C為第14輪DNA隨機寡核苷酸庫，曲線D為第20輪DNA隨機寡核苷酸庫。
[0022]圖2為流式細胞儀檢測篩選進程中DNA隨機寡核苷酸庫對于U87細胞的富集圖。在 圖2中，橫坐標為焚光強度，縱坐標為細胞數，曲線A為初始DNA隨機寡核苷酸庫，曲線B為第8 輪DNA隨機寡核苷酸庫，曲線C為第14輪DNA隨機寡核苷酸庫，曲線D為第20輪DNA隨機寡核苷 酸庫。
[0023]圖3為流式細胞儀測定所得核酸適體W5對GSC的解離常數。在圖3中，橫坐標為DNA 濃度(nmol/L)，縱坐標為平均熒光強度。
[0024] 圖4為流式細胞儀測定所得核酸適體W5對GSC的熒光偏移。在圖4中，橫坐標為熒光 強度，縱坐標為細胞數。
[0025] 圖5為流式細胞儀測定所得核酸適體W5對多種其他腫瘤細胞系的熒光偏移。在圖5 中，橫坐標為熒光強度，縱坐標為細胞數。
【具體實施方式】
[0026] 實施例1體外篩選與GSC特異結合的核酸適體
[0027] 1)將合成好的5nmol單鏈DNA核酸庫溶于結合緩沖液（lxPBS，4.5g/L葡萄糖， 0.5mmol/L MgCl2,0.1g/L tRNA，lg/L BSA)中，進行熱處理：95°C加熱5min，在冰上放置 lOmin;所述單鏈DNA隨機寡核苷酸庫的兩端為固定序列，中間為40個堿基的隨機序列，即為 5'-TTG ACT TGC CAC TGA CTA CC-40nt-GAA GTC AGT CGG TCG TCA TC-3'，庫容量為 1015 以上。
[0028] 2)將處理好的單鏈DNA核酸庫與用roS洗滌后的U87細胞進行孵育，收集未與U87細 胞結合的液體；
[0029] 3)將未與U87細胞結合的液體加入GSC中于冰上孵育40min;
[0030] 4)使用洗滌緩沖液洗滌孵育后的GSC，95°C加熱10min，13000g離心5min，獲取結合 了 GSC的寡核苷酸，然后做PCR反應；
[0031] PCR 反應程序為：94°C 預變性 3min，94°C30s，60°C30s，72°C30s，擴增 16 個循環，最 后72°C終延伸5min，
[0032] 引物1:5，-FAM-TTG ACT TGC CAC TGA CTA CC-3,；
[0033] 引物2:5，-Biotin-GAA GTC AGT CGG TCG TCA TC-3,；
[0034] 5 )PCR反應結束后，產物為3 '端帶有生物素標記，5 '端帶有FAM標記的雙鏈DNA，加 入鏈酶親和素微珠，反應30min，然后用0.2mol/L NaOH進行單鏈化，經脫鹽柱純化即得到用 于下一輪篩選的單鏈DNA文庫；
[0035] 6)之后每輪使用200pmol的單鏈DNA文庫，并且逐步增加洗滌次數以增強篩選強 度。共進行20輪篩選，而后通過流式細胞儀檢測單鏈DNA文庫的富集情況，結果顯示第20輪 庫與GSC有比較明顯的結合(參見圖1)，而與U87細胞沒有結合(參見圖2)，最后把第20輪庫 進行克隆測序。所得的序列為
[0036] 5'-TT GAC TTG CCA CTG ACT ACC CCA GTA TCT CTT CAA CGC TAT GGT GCA TGT ACT ACG TAT TGA AGT CAG TCG GTC GTC ATC-3'。
[0037] 該序列命名為W-5。
[0038]實施例2以流式分析法檢測所得單鏈DNA與GSC的結合能力
[0039] 首先PCR擴增帶熒光標記的單鏈DNA，使用引物2:5'-FAM-TTG ACT TGC CAC TGA CTA CC-3'；引物3:5'-Biotin-GAA GTC AGT CGG TCG TCA TC-3'，PCR產物為5'端帶有FAM 并且3 '端帶有生物素的雙鏈DNA，加入鏈酶親和素微珠，反應30min，然后用0.2mol/L NaOH 進行單鏈化，經脫鹽柱純化即得到用于流式分析的帶FAM標記的單鏈DNA。
[0040]使用 lnmol/L，2nmol/L，5nmol/L，10nmol/L，20nmol/L，50nmol/L，100nmol/L， 200nmol/L濃度梯度的單鏈DNA與GSC來測定解離常數(Kd)。用200yl結合緩沖液配置上述各 濃度的DNA溶液，95°C加熱5min，冰上放置lOmin。加入到50xl0 4個GSCs，冰上孵育40min。使 用洗滌緩沖液洗滌細胞3次，而后把細胞重懸在250yL結合緩沖液中。設置未經過篩選的初 始DNA隨機寡核苷酸庫作對照。
[0041 ] 使用BD公司的FACSAria流式細胞儀對細胞進行焚光測定，而后用sigma plot軟件 作圖，計算出所得核酸適體的解離常數(結果參見圖3)。
[0042]實施例3篩選得到核酸適配體與其他各種細胞系結合情況
[0043] 1)將合成好的5nmol單鏈DNA溶于結合緩沖液中，進行熱處理:95°C加熱5min，冰上 放置l〇min。
[0044] 2)將處理好的單鏈DNA與500000個細胞種于24孔板24小時進行孵育，冰上孵育 40min〇
[0045] 3)孵育好后，洗滌緩沖液溶液洗3次，再將細胞刮下來溶于200iiL結合緩沖液中，使 用BD公司的FACSAria流式細胞儀對細胞進行熒光測定(結果參見圖5)。
【主權項】
1. 識別膠質瘤干細胞的核酸適體，其特征在于，其序列如下： TT GAC TTG CCA CTG ACT ACC CCA GTA TCT CTT CAA CGC TAT GGT GCA TGT ACT ACG TAT TGA AGT CAG TCG GTC GTC ATC〇2. 基于權利要求1所述的膠質瘤干細胞的核酸適體的切短或部分堿基替換的GSC的核 酸適體，所述的切短為兩端堿基分別或同時截短1-20個堿基。3. 如權利要求1所述的識別膠質瘤干細胞的核酸適體的制備方法，其特征在于包括以 下步驟： 1) 合成單鏈DNA隨機寡核苷酸庫；以人膠質母細胞瘤細胞系U87為反篩細胞，篩選除去 DNA隨機寡核苷酸庫中的非特異性結合部分，以GSC為正篩細胞篩選得到與GSC特異結合的 核酸序列； 2) 將步驟1)所得與GSC特異結合的核酸序列進行PCR擴增，PCR擴增產物以鏈酶親和素 微珠為基質進行分離，通過堿變性解鏈，過濾，純化，即得用于次輪篩選的單鏈DNA文庫，形 成次一級核酸庫； 3) 將步驟2)所得的單鏈DNA文庫進行下一輪篩選，經過20輪篩選后獲得目的寡核苷酸 序列；克隆測序所述目的寡核苷酸序列，并通過流式分析法鑒定其與靶細胞結合的特異性 和親和力。4. 如權利要求3所述的識別膠質瘤干細胞的核酸適體的制備方法，其特征在于在步驟 1)中，所述單鏈DNA隨機寡核苷酸庫的兩端為固定序列，中間為40個堿基的隨機序列，即為 5'-TTG ACT TGC CAC TGA CTA CC 40nt GAA GTC AGT CGG TCG TCA TC-3'，庫容量為 1015 以上。5. 如權利要求3所述的識別膠質瘤干細胞(GSC)的核酸適體的制備方法，其特征在于在 步驟2)中，所述PCR擴增的引物為： 引物1:TTG ACT TGC CAC TGA CTA CC; 引物2: GAA GTC AGT CGG TCG TCA TC。6. 如權利要求1所述的識別膠質瘤干細胞的核酸適體的用途，在制備膠質瘤干細胞識 別試劑的應用。7. 如權利要求1所述的識別膠質瘤干細胞的核酸適體的用途，在制備膠質瘤干細胞診 斷試劑的應用。8. 如權利要求1所述的識別膠質瘤干細胞的核酸適體的用途，在制備膠質瘤干細胞治 療藥物的應用。
【文檔編號】A61K48/00GK105821043SQ201610048666
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年1月25日
【發明人】康德智, 吳巧藝, 吳亮, 王煜喆, 楊朝勇, 朱志
【申請人】福建醫科大學附屬第醫院, 福建醫科大學附屬第一醫院