一種豬流行性腹瀉病毒穩定傳代的培養方法
【專利摘要】本發明涉及一種豬流行性腹瀉病毒穩定傳代的培養方法。本發明使用含有低濃度胰酶、磷酸胰蛋白肉湯、酵母提取液、二甲基亞砜、雙抗、胚牛血清的a?MEM培養基，通過對豬流行性腹瀉病毒與Vero細胞預處理的過程，使在Vero細胞中難以穩定傳代的豬流行性腹瀉病毒的流行毒株，可穩定傳至130代以上，TCID50達108.0/ml以上；同時進行初步鑒定，提高了檢測陽性率，大大縮短了檢測周期，這對于分離豬流行性腹瀉病毒的田間野毒、穩定傳代并致弱、制備疫苗以預防豬流行性腹瀉是重要的突破。CGMCC No.1226020160411
【專利說明】
一種豬流行性腹瀉病毒穩定傳代的培養方法
技術領域
[0001] 本發明涉及一種豬流行性腹瀉病毒穩定培養傳代的方法，屬于生物培養領域。
【背景技術】
[0002] 豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)于 1978年在英國 和比利時首次被報道后，中國、加拿大、匈牙利、日本、德國等多個國家相繼報道了PED的發 生，目前PED已成為危害世界養豬業的主要流行性疾病之一，給養豬業帶來嚴重的經濟損 失。各國研究人員嘗試用不同的方法使PEDV適應于細胞，以期將其分離培養，穩定傳代，以 便更好地研究其功能和制備疫苗。1988年，Hofmann等首次在Vero細胞上成功繁殖出PEDV， 并發現胰酶是PEDV在Vero細胞中生長繁殖所必需的。此后Vero細胞系成為分離培養PEDV的 首選細胞。中國學者也在Vero細胞上成功對個別PEDV毒株進行了分離傳代，但毒株間的差 異及培養條件對于PEDV的分離培養影響非常大，經常出現分離不到病毒或連續傳代后病毒 丟失的現象。這嚴重影響了流行野毒株的分離，尤其是毒株不能穩定傳代，直接阻礙了流行 強毒株的傳代致弱，也影響了該病疫苗的研究進展。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的在于突破了豬流行性腹瀉病毒在Vero細胞中穩定傳代的瓶頸，提供 了一種豬流行性腹瀉病毒穩定傳代的培養方法。使用該方法獲得的PEDV在Vero細胞中能夠 穩定傳代，可傳至130代以上病毒不丟失，TCID 5Q達108'Vml以上，對于研發豬流行性腹瀉病 毒的新流行毒株疫苗是一個重大的突破。
[0004] 為了實現上述目的，本發明采取了如下技術方案：
[0005] 1.-種豬流行性腹瀉病毒傳代培養方法，在于該方法中病毒接種傳代細胞前，病 毒和細胞均需要在含胰酶終濃度40~100μg/ml的營養液中進行預處理。
[0006] 2.本發明所述一種豬流行性腹瀉病毒傳代培養方法，在于該方法中病毒和細胞的 預處理為：
[0007] (1)病毒活化將分離到的豬流行性腹瀉病毒流行毒株回溫至37°C，并加入含胰酶 終濃度40~lOOμg/ml的營養液于37°C處理5~10min;
[0008] (2)細胞敏化將生長優良的Vero細胞單層用PBS洗滌1~3次，再用濃度為0.02%的 m)TA溶液清洗一次，最后用含胰酶終濃度40~100μg/ml的營養液加到細胞單層中在37 °C處 理5~10min。
[0009] 3.本發明所述一種豬流行性腹瀉病毒傳代培養方法，還包括：
[0010] (1)接毒取預處理活化好的種毒按終培養體系的10%接種到敏化完成的細胞單 層；
[0011] (2)孵育37 °C孵育1~2小時，期間做輕微晃動1~2次以保證種毒液均勻分布到細 胞單層；
[0012] (3)換液:孵育完成后棄去孵育液，添加pH值為7.0~7.4的維持液；
[0013] (4)收毒:種毒接種完成后定期觀察CPE，待細胞單層80%左右出現CPE后收毒，分 裝于-80度保存。
[0014] 4.本發明所述的一種豬腹瀉病毒穩定傳代的培養方法，在于：
[0015] (1)所述營養液為:含有40~100μg/ml的a-MEM培養基；
[0016] (2)所述維持液的成份為(V/V):磷酸胰蛋白際肉湯(Tryptose phosphate broth， TPB)0? 1 %~1 %，酵母提取液（Yeast extract)0? 001 %~0? 003%，胰酶（Trypsin)5~20y 區/1111，二甲基亞砜（0150)0.1%~0.5%，胎牛血清0.5%~1%，￡0丁八0.001%，雙抗1%，&-MEM89.0%~96.9%。
[0017] 5.本發明所述一種豬流行性腹瀉病毒傳代培養方法，在于該方法還包括對PEDV初 步鑒定使用的ZC法，即：該方法還包括提取病毒RNA，反轉錄作為PCR的擴增模板，sF與sR作 為擴增引物，擴增程序為:94°C預變性41^11 ;941€308,601€308,721€308,30個循環，最后72 °C延伸1 Omin，擴增的片段大小為640bp;其中檢測引物通過分析GenBank中PEDV S基因的保 守區域后設計：
[0018] sF: 5，-CTACAGACGGATGITCTACAGCGGA-3，（序列 1)
[0019] sR: 5，-CCGTCGCAGTATCTTGAAGTTCGTG-3，（序列2)。
[0020]本發明【具體實施方式】
[0021] 1 ?病毒培養
[0022] 采用Vero細胞作為傳代細胞，PEDV作為毒種，采用含有磷酸胰蛋白豚肉湯、酵母提 取液、DMS0、胰酶、雙抗的a-MEM作為培養液，采用5 % C02的37 °C恒溫培養箱為孵育設備，并 包括如下步驟：
[0023] (1)細胞培養
[0024] 將生長優良的Vero細胞單層用roS洗滌1~3次，用含胰酶終濃度40~100ug/ml的 營養液于37°C處理5~10min，敏化細胞單層；
[0025] (2)活化病毒
[0026] 將PEDV流行毒株回溫至37°C，并加入用含胰酶終濃度40~100μg/ml的營養液活化 5~10min;
[0027] (3)接毒
[0028] 取預處理活化好的種毒按終培養體系的10%接種到敏化完成的細胞單層；
[0029] (4)孵育
[0030] 接毒后37°C5 %⑶2培養箱中孵育1~2小時，期間做輕微晃動1~2次以保證種毒液 均勻分布到細胞單層；
[0031] (5)換液
[0032] 孵育完成后棄去孵育液，添加pH值為7.0~7.4的維持液；
[0033] (6)收毒
[0034] 種毒接種完成后定期觀察CPE，待到細胞單層80%左右出現CPE后收毒(72小時左 右）。分裝于-80度保存；
[0035] 2.病毒培養物的鑒定
[0036] 使用RT-PCR進行初步鑒定，通過分析GenBank中PEDV S基因的保守區域后設計檢 測引物即：
[0037] 是提取病毒RNA，反轉錄作為PCR的擴增模板，設計一對sF與sR作為擴增引物：
[0038] sF:5，-CTACAGACGG ATGTTCTACA GCGGA-3,25(序列 1)
[0039] SR:5，-CCGTCGCAGT ATCTTGAAGT TCGTG-3,25(序列2)
[0040]擴增程序為:94°C 預變性 4!^11;941€3〇8,6〇1€3〇8,721€3〇8,30個循環，最后72°(：延 伸lOmin，能擴增出片段大小為640bp的特異性條帶，為敘述方便，本發明稱此方法為ZC法。 [00411本發明所述營養液成份為含有終濃度40~100μg/ml胰酶的a-MEM培養基
[0042]本發明所述維持液成份為（V/V):磷酸胰蛋白,際肉湯（Tryptose phosphate broth，TPB)0.1~1 % (上海瑞楚生物科技有限公司，20150803)，酵母提取液（Yeast extract )0? 001 % ~0 ? 003 % (Qxoid，1275118-02)，膜酶（Trypsin)5~20ug/ml (Gibco， 1665845)，二甲基亞砜(DMS0)0.1 ~0.5% (Sunshine(生興生物），4J094J09)，胎牛血清0? 5 ~1%(6訃。〇，1624110)，￡0了厶0.001%(6訃。〇，厶192606)，雙抗1%(辦。1〇116，了140016)， &-MEM 89.0~96.9%(Hyclone，NAA1323);
[0043] 本發明所述雙抗為含10000IU/ml的青霉素和10000μg/ml的鏈霉素（Hyclone， J140016)
[0044] 本發明所述PBS緩沖液的成份與含量為:NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L;KH2P〇4 0.24g/L; Na2HP〇4. 12H20 3.65g/L，pH為7.2~7.4。
[0045] 本發明涉及的微生物資源信息
[0046] 本發明涉及的微生物是豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus， PEDV)流行毒株ZC株該毒株是本發明人分離自江蘇泰州某發病豬場，該毒株于2016年04月 11日送交北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物保藏委員 會普通微生物保藏中心，保藏號為CGMCC No. 12260。
【附圖說明】
[0047] 圖 1 本發明的部份代次PCR結果圖 1 中：1、6marker-DL2000，2 ? PEDV P10代3 ? PEDV P50代，4.PEDV P100代5.PEDV P130代。
[0048] 圖2本發明的部份代次?0?結果圖2中：1.?￡0￥?3代，2.?￡0￥?30代，3.?￡0￥?123 代，4 ? PEDV P150代，5 ? marker-DL2000 〇
[0049] 本發明的有益效果
[0050]本發明涉及一種豬流行性腹瀉病毒穩定傳代的培養方法。本發明突破了 PEDV難以 穩定傳代的瓶頸，先使用低濃度胰酶敏化細胞與豬流行性腹瀉病毒，然后再用含低濃度胰 酶、磷酸胰蛋白標肉湯、酵母提取液、二甲基亞砜、EDTA、雙抗的a-MEM培養基進行培養傳代， PEDV可以獲得穩定傳代，傳至130代以上病毒不丟失（圖1和圖2)，TCID 5Q達108'Vml以上；同 時使用RT-PCR對PEDV進行初步鑒定，大大縮短檢測周期，這對于分離PEDV野毒、傳代致弱及 初步鑒定提供了重要的技術支撐。 實施例
[0051 ]以下實施例為進一步對本發明進行闡述，但這些實施例不構成對本發明的限制。 [0052] 實施例1
[0053] 一一豬流行性腹瀉病毒的培養，
[0054] 1.將生長優良的Vero細胞(揚州大學農業部畜禽傳染病學重點開放實驗室惠贈） 單層用PBS洗滌3次，再用濃度為0.02%的EDTA溶液清洗一次，最后用含胰酶終濃度60μg/ml 的營養液于37°C處理lOmin，敏化細胞單層；
[0055] 2.將ZC株（中崇信諾生物科技泰州有限公司分離于江蘇泰州某發病豬場，命名為 ZC株）回溫至室溫，并加入胰酶終濃度60μg/ml的a-MEM營養液于37°C活化lOmin;
[0056] 3.取上述活化好的毒株按終培養體系的10%接種到敏化完成的細胞單層；
[0057] 4.孵育:37°C孵育1小時，期間做輕微晃動2次以保證種毒液均勻分布到細胞單層；
[0058] 5.換液:孵育完成后棄去孵育液，添加pH值為7.2的維持液；
[0059] 6.收毒:病毒接種完成后定期觀察CPE，待到細胞單層80%左右出現CPE后收毒(72 小時左右）。分裝于-80度保存；
[0060] 實施例2
[0061] --收獲的病毒鑒定；
[0062] (1)TCID5Q 的檢測
[0063] 取細胞毒液，用含20iig/ml胰酶的MEM培養液將病毒作10倍系列稀釋10' 10' 1(T7 三個滴度分別接種于每孔含l〇〇yl Vero細胞液的96孔培養板的4個孔內，每孔100ul，同時 設不接毒的細胞對照孔，置37°C、5%C02培養箱，培養3天，觀察細胞病變，計算TCID 5Q。豬流 行性腹瀉病毒含量為l〇8'QTCID5Q/ml。
[0064] (2)ZC 法檢測
[0065] 用RNA提取試劑盒（TaKaRa，AK704)提取病毒RNA，一步法RT-PCR試劑盒（TaKaRa， AK3601)進行鑒定，引物為sF和sR擴增目的片段，擴增程序為:94°C預變性4min; 94°C30s，60 1€3〇8,721€3〇8,30個循環，最后72°(：延伸1〇111111。擴增的片段大小為64(^口（圖2)。
[0066] 實施例3
[0067] --連續傳代試驗
[0068]用上述方法連續傳代，從P1代穩定傳至P150代，部分代次PCR結果如圖2。
[0069] 本發明的技術方案中，所述維持液成份為（V/V):磷酸胰蛋白_肉湯（Tryptose phosphate broth，TPB)0.1%，酵母提取液(Yeast extract)0.003%，膜酶（Trypsin)20ug/ ml，二甲基亞砜(DMS0)0.1%，胎牛血清1%，EDTA0.001%、雙抗1%，a-MEM 95.9。；
[0070] 本發明的技術方案中，所述雙抗為含l〇〇〇〇IU/ml的青霉素和10mg/ml的鏈霉素溶 液。
[0071] 本發明的技術方案中，所述PBS緩沖液的成份與含量為:NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L; KH2PO4 0.24g/L;Na2HP〇4. 12H20 3.65g/L，pH為7.2~7.4。
[0072] 在本說明書中的"實施例，指的是結合該實施例描述具體特征、結構或者特點。進 一步來說，結合任一實例描述一個具體特征、結構或者特點時，所要主張的是結合其他實例 來實現這種特征、結構或者特點也落在本發明的范圍內。
[0073] 盡管這里參照本發明的實例對本發明進行了描述，但是，應該理解，本領域技術人 員可以設計出很多其他的修改和實施方式，這些修改和實施方式將落在本申請公開的原則 范圍和精神之內。更具體地說，在本申請公開和權利要求的范圍內，可以對主題組合布局的 組成部件和/或布局進行多種變型和改進。
【主權項】
1. 一種豬流行性腹瀉病毒傳代培養方法，其特征在于該方法中病毒接種傳代細胞前， 病毒和細胞均需要用含胰酶終濃度40~lOOwg/ml的營養液進行預處理。2. 如權利要求1所述一種豬流行性腹瀉病毒傳代培養方法，其特征在于該方法中病毒 和細胞的預處理為： (1) 病毒活化將分離到的豬流行性腹瀉病毒流行毒株回溫至37°C，并加入含胰酶終濃 度40~100μg/ml的營養液于37°C處理5~lOmin; (2) 細胞敏化將生長優良的Vero細胞單層用roS洗滌1~3次，再用濃度為0.02%的EDTA 溶液清洗一次，最后用含胰酶終濃度40~lOOμg/ml的營養液加到細胞單層中在37°C處理5 ~10min〇3. 如權利要求1所述一種豬流行性腹瀉病毒傳代培養方法，其特征在于該方法還包括： (1) 接毒取預處理活化好的種毒按終培養體系的10 %接種到敏化完成的細胞單層； (2) 孵育37°C孵育1~2小時，期間做輕微晃動1~2次以保證種毒液均勻分布到細胞單 層； (3) 換液:孵育完成后棄去孵育液，添加 pH值為7.0~7.4的維持液； (4) 收毒:種毒接種完成后定期觀察CPE，待細胞單層80%左右出現CPE后收毒，分裝于-80度保存。4. 如權利要求1所述的一種豬腹瀉病毒穩定傳代的培養方法，其特征在于： (1) 所述營養液為:含有40~100μg/ml的a-MEM培養基； (2) 所述維持液的成份為(V/V):磷酸胰蛋白J示肉湯(Tryptose phosphate broth，TPB) 0· 1 %~1 %，酵母提取液（Yeast extract)0.001 %~0.003%，膜酶（Trypsin)5~20μg/ml， 二甲基亞砜（DMS0)0· 1%~0.5%，胎牛血清0.5% ~1%，EDTA 0.001%，雙抗1%，a-MEM 89.0%~96.9%。5. 如權利要求1所述的一種豬腹瀉病毒穩定傳代的培養方法，其特征在于該方法還包 括對PEDV初步鑒定使用的ZC法，即：該方法還包括提取病毒RNA，反轉錄作為PCR的擴增模 板，sF與sR作為擴增引物，擴增程序為:94 °C預變性4min; 94 °C 30s，60 °C 30s，72 °C 30 s，30個 循環，最后72°C延伸10min，擴增的片段大小為640bp;其中檢測引物通過分析GenBank中 PEDV S基因的保守區域后設計： sF: 5 ' - CTACAGACGGATGTTCTACAGCGGA-3 '（序列 1) sR: 5 ' - CCGTCGCAGTATCTTGAAGTTCGTG-3 '（序列2)。
【文檔編號】C12R1/93GK105821007SQ201610282129
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年4月29日
【發明人】何海蓉, 王正春, 陳堅, 孫石靜, 王秋娟
【申請人】中崇信諾生物科技泰州有限公司