用于處理病毒的陽離子型聚胺的制作方法

用于處理病毒的陽離子型聚胺的制作方法
【專利摘要】通過用引入包含一個或多個碳和至少一個醇羥基的側鏈的N-酰化劑對聚乙烯亞胺進行改性來制備抗病毒陽離子型聚胺。所述陽離子型聚胺可具有直鏈或支鏈聚乙稀亞胺骨架結構。優選地，所述陽離子型聚胺包含側接單糖基團，所述側接單糖基團可通過包含側接受保護單糖(例如，甘露糖)基團的環狀碳酸酯被引入。所述陽離子型聚胺在低濃度下可對廣譜病毒具有活性和選擇性，并且通常無毒。
【專利說明】
用于處理病毒的陽離子型聚胺
技術領域
[0001] 本發明涉及用于治療病毒感染的陽離子型聚胺和其方法，且更具體地涉及用于抗 病毒應用的經改性的陽離子型聚乙烯亞胺。
【背景技術】
[0002] 由于病毒結構的差異(RNA病毒、DNA病毒、有包膜病毒和無包膜病毒)連同病毒快 速突變并獲得抗性的能力，因此病毒感染的治療一直難以實現。病毒性疾病自古以來一直 是發病和死亡的主要原因之一。近年來，主要由于人群的快速增加、衰老、氣候變化和抑制 免疫系統的醫學治療(包括照射療法、抗癌化學療法和器官移植），因此病毒感染已顯現為 突出的全球公共健康問題。例如，嚴重急性呼吸性綜合征(SARS)于2003年的世界性爆發、亞 洲在最近二十年內的登革熱和禽流感(例如，H1N1)的爆發已經造成了巨大的經濟負擔。最 近，已經在人群中發現幾種新的病毒病原體，如尼帕病毒(Nipah virus)、基孔肯雅病毒 (Chikungunya virus) (CHIKV)和突變的流行性禽流感病毒(例如，H7N9)。因此，已付出巨大 努力來開發疫苗和抗病毒藥物以控制和根除病毒感染。然而，病毒(尤其是流感病毒）由于 固有的基因組不穩定性所致的快速突變使得疫苗接種效率低下。此外，對于許多病毒感染 (例如，登革熱病毒和基孔肯雅病毒)來說，沒有可用的臨床藥物。由于容易突變而形成抗藥 株的病原性病毒存在如此多的類型和亞型，因此還不可能單個地控制它們。
[0003]病毒可根據它們持有的基因被分類為DNA病毒和RNA病毒，以及有包膜病毒和無包 膜病毒。這顯示嘗試設計通用型抗病毒劑的問題的復雜性。多數出現的和再次出現的病毒 屬于RNA類型，包括黃病毒科(例如，登革熱病毒或DENV)、流感、CHIKV、腸道病毒71(EV 71) 和SARS Co-V。這些病毒中的許多利用胞內體途徑來感染細胞。胞內體的低pH允許將病毒基 因組引入胞質中。此外，許多有包膜病毒利用陰離子型磷脂酰絲氨酸(PS)/TIM(T細胞/跨 膜、免疫球蛋白和粘蛋白）受體結合和/或凋亡細胞清除途徑來進入細胞中。這表明掩蔽TIM 受體可為控制病毒感染提供新的手段。
[0004] 由于在病毒表面上存在陽離子區域和陰離子區域，因此帶電荷的聚合物潛在地提 供了利用靜電相互作用來抑制病毒感染的手段。然而，嘗試使用陰離子型聚合物(例如，硫 酸化的多糖如葡聚糖、木糖咲喃聚糖(171<^1?^1^11)、核糖咲喃聚糖(1'；[130；^^1^11)和凝膠 聚糖)與病毒表面上的陽離子電荷結合來預防病毒感染獲得的成功有限。
[0005] 從動物中提取的肝素具有抗登革熱病毒的強活性，但由于它是抗凝血劑而因此具 有有限的實用性。
[0006] 陽離子型聚合物(包括陽離子型丙烯酸酯聚合物、聚乙烯亞胺和陽離子型聚(亞苯 基亞乙基）聚合物)還可通過非特異性靜電相互作用與病毒表面的陰離子基團潛在地相互 作用。
[0007] 聚乙烯亞胺(PEI)是商購的寬范圍分子量的聚胺。PEI形成為直鏈(LPEI)或支鏈 (BPEI)大分子。PEI在例如洗滌劑、添加劑、水處理劑和化妝品的產品中有許多應用。由于 PEI能夠通過細胞膜進入細胞中，因此它們已在生物醫學應用中被用作藥物載體。聚陽離子 型PEI可作為與DNA的復合體在體外和體內介導向哺乳動物細胞中的基因轉移。然而，陽離 子型聚合物如直鏈聚乙烯亞胺(PEI)展現出對哺乳動物細胞的高的非特異性細胞毒性并誘 導溶血。此外，直鏈PE I的水溶性低于支鏈PE I。
[0008] 許多病毒感染是pH依賴性的，其中復制需要胞內體中的低pH。最近，氯硝柳胺(一 種經roA批準的抗蠕蟲化合物)被報道通過中和胞內體pH來預防pH依賴性病毒的感染。然 而，其抗流感病毒(PR8)和人鼻病毒(HRV14)的最高選擇性僅為約24。具有pH中和能力的氯 化銨和氯喹也被報道預防病毒感染，但它們是高毒性的，從而限制了臨床應用。
[0009] 對非溶血性的且提供一般且安全的策略來預防病毒感染的廣譜抗病毒劑一直存 在需要。需要具有獨特官能團的抗病毒大分子特異性地結合到病毒表面蛋白質并且與病毒 競爭與免疫細胞/靶細胞結合以預防感染。

【發明內容】

[0010] 因此，公開了一種方法，其包括：
[0011]用陽離子型聚胺處理病毒，由此形成包含所述陽離子型聚胺的經處理的病毒，所 述陽離子型聚胺通過非共價相互作用結合到所述病毒；
[0012]其中：
[0013] i)所述經處理的病毒相比于未經處理的病毒進入活的哺乳動物細胞中的能力和/ 或在活的哺乳動物細胞內進行復制的能力變弱，
[0014] i i)所述陽離子型聚胺包含：
[0015] 多個式（1)的不帶電荷的N-酰化乙烯亞胺單元：
[0017] 其中每個f包含至少一個碳和至少一個醇羥基，和
[0018] 多個式(3a)的帶正電荷的仲乙烯亞胺單元：
[0020] 其中氮的帶星號鍵連接到碳，且X?是通過非共價締合與帶正電荷的氮結合的帶 負電荷的抗衡離子，并且
[0021] iii)所述陽離子型聚胺包含以隨機分布排布且頭接尾共價連接的N-酰化乙烯亞 胺單元和仲乙稀亞胺單元，其中給定乙稀亞胺單元的氮1連接到不同乙稀亞胺單元的碳3。 [0022]還公開了一種方法，其包括：
[0023]用陽離子型聚胺處理活的哺乳動物細胞，由此形成包含通過非共價相互作用結合 的所述陽離子型聚胺和細胞的經處理的細胞;其中：
[0024] i)所述經處理的細胞相比于未經處理的細胞對病毒進入所述經處理的細胞中和/ 或病毒在所述經處理的細胞內復制具有更高抗性，
[0025] i i)所述陽離子型聚胺包含：
[0026]多個式（1)的不帶電荷的N-酰化乙烯亞胺單元：
[0028] 其中每個f包含至少一個碳和至少一個醇羥基，和
[0029]多個式(3a)的帶正電荷的仲乙烯亞胺單元：
[0031]其中氮的帶星號鍵連接到碳，且X0是通過非共價締合與帶正電荷的氮結合的帶 負電荷的抗衡離子，并且
[0032] iii)所述陽離子型聚胺包含以隨機分布排布且頭接尾共價連接的N-酰化乙烯亞 胺單元和仲乙稀亞胺單元，其中給定乙稀亞胺單元的氮1連接到不同乙稀亞胺單元的碳3。 [0033]公開了另一種方法，其包括：
[0034] 向被病毒感染的患者施用治療有效量的陽離子型聚胺，由此抑制和/或阻止所述 病毒的復制；
[0035] 其中：
[0036] i)所述陽離子型聚胺包含：
[0037]多個式（1)的不帶電荷的N-酰化乙烯亞胺單元：
[0039] 其中每個f包含至少一個碳和至少一個醇羥基，和
[0040] 多個式(3a)的帶正電荷的仲乙烯亞胺單元：
[0042]其中氮的帶星號鍵連接到碳，且X?是通過非共價締合與帶正電荷的氮結合的帶 負電荷的抗衡離子，并且
[0043] ii)所述陽離子型聚胺包含以隨機分布排布且頭接尾共價連接的N-酰化乙烯亞胺 單元和仲乙稀亞胺單元，其中給定乙稀亞胺單元的氮1連接到不同乙稀亞胺單元的碳3。 [0044]本領域技術人員根據以下【具體實施方式】、附圖和所附權利要求將了解和理解本發 明的上述和其它特征以及優點。
【附圖說明】
[0045] 圖1是⑶Cl3中的陽離子型聚胺B3的1H NMR譜。
[0046]圖2A是陽離子型聚胺B11的前體在氫解前于MeOD中獲取的1H匪R譜。支鏈聚乙烯 亞胺結構是用于賦予NMR峰的簡化再現。
[0047]圖2B是陽離子型聚胺B11在氫解和酸化后于D20中獲取的1H NMR譜。支鏈聚乙烯亞 胺結構是用于賦予NMR峰的簡化再現。
[0048]圖3是顯示陽離子型聚胺B3預防DENV-2病毒感染人原代外周血單核細胞的能力的 圖表。在病毒感染后，峰移位到更高的PE-A(藻紅蛋白（PE)綴合的抗小鼠IgG)。從用2mg/L或 10mg/L的B3處理獲得的樣品的峰未移位，而是與無病毒感染的對照樣品的峰幾乎重疊，表 明B3處理有效地預防人原代外周血單核細胞被DENV-2感染。
[0049]圖4是顯示陽離子型聚胺B3預防DENV-2病毒感染巨噬細胞的能力的圖表。在病毒 感染后，峰移位到略高的PE-A。從2mg/L或1 Omg/L的B3處理獲得的樣品的峰未移位，而是與 無病毒感染的對照樣品的峰幾乎重疊，表明B3處理有效地預防巨噬細胞被DENV-2感染。 [0050] 圖5是比較表達HM-1受體或HM-3受體的293T細胞與不表達HM-1受體或TM-3受 體的空載體293T細胞(標記為〃空〃）的CHIKV(基孔肯雅病毒)感染率的條形圖。HM-1受體或 TIM-3受體的存在增強了 CHIKV感染。
[0051 ] 圖6是顯示陽離子型聚胺B3在預防空載體293T細胞（即，不表達TIM-1或TM3受 體)的CHIKV感染方面的作用的條形圖。EC50是0.2 lmg/L。
[0052]圖7是顯示陽離子型聚胺B3在預防表達TM-1受體的293T細胞中的CHIKV感染方面 的作用的條形圖。EC50是1.26mg/L并且選擇性指數(CC50/EC50) > 794。
[0053]圖8是顯示陽離子型聚胺B3在預防表達TM-3受體的293T細胞中的CHIKV感染方面 的作用的條形圖。EC50是0.68mg/L并且選擇性指數(CC50/EC50) > 1471。
[0054]圖9是顯示陽離子型聚胺B3在預防自然表達HM-1受體的A549細胞的DENV-2感染 方面的作用的條形圖。EC50是6 ? 8mg/L，CC50 > 1000mg/L，并且選擇性指數> 147。
[0055]圖10是比較有陽離子型聚胺B3的細胞、無B3(標記為DMS0)的細胞和有強效抗病毒 的腺苷核苷類似物祖了0008(21?，31?，41?，51〇-2-(4-氨基吡咯并[2,3-(1]嘧啶-7-基)-3-乙炔 基_5_(羥甲基)氧戊環_3,4_二醇的細胞的熒光素酶活性的條形圖。該發現證實抗病毒聚合 物B3在DENV-2的細胞進入的晚期和復制周期未發揮功能。
[0056]圖11是顯示陽離子型聚胺B3(和肝素）的添加時間對LLC-MK2細胞中的DENV-2的抑 制的作用的一組圖表。對于時間=_1.5小時來說，將病毒和B3-起在4°C添加到所述細胞 中。對于所有其它時間來說，在將病毒和細胞在4°C培育1.5小時且升溫到37°C后添加B3。結 果顯示當在病毒附著步驟期間或附著步驟后的早期(0-1小時）添加時，B3在預防病毒感染 方面有效，但此后無效。
[0057] 圖12是顯示在添加LLC-MK2細胞前將DENV-2病毒和陽離子型聚胺B3在4°C組合1小 時的作用的條形圖。獲得了病毒效價的40%降低，表明B3結合到病毒抑制了病毒感染。 [0058] 圖13是顯示在添加DENV-2病毒前用陽離子型聚胺B3將LLC-MK2細胞在37°C預處理 15分鐘到2小時的作用的條形圖。EC50值是8.7mg/L，表明B3結合到細胞膜是抑制DENV-2病 毒的感染的因素。
[0059]圖14是顯示陽離子型聚胺B3和肝素對被病毒感染的細胞融合的作用的一組顯微 照片和相應的程序圖解。用DENV-2病毒處理白紋伊蚊(Aedes albopictus)C6/36細胞。在4 °C(標記為〃4°C+〃的圖像)或在28°C(標記為〃4°C-〃的圖像)添加抗病毒劑。標記為〃培養基 (Medium) 〃的樣品僅含有細胞和病毒(無抗病毒劑）。標記為〃模擬(Mock) 〃的樣品僅含有細 胞(無病毒或抗病毒劑）。在含有B3的樣品中未發現融合細胞。
[0060]圖15是使用Marvin Sketch軟件構建的模型支鏈PEI的模型大分子的二維結構。模 型支鏈BPEI并非意在表示用于實施例中的支鏈PEI的完整結構。
[0061 ] 圖16是DENV-2E蛋白質（包膜蛋白質）的使用MVD(Molegro Virtual Docker)軟件 的三維計算機繪圖，其中突顯的斑點區域表示在4個對接網格中以相等結合能結合的模型 支鏈PEI的4種位姿。
[0062]圖17是顯示DENV-2E蛋白質的與模型陽離子型聚胺B3結構形成氫鍵 圖18是模型陽離子型聚胺B3與DENV-2 E蛋白質的有利結合相互作用的使用MVD軟件的 三維計算機繪圖。 圖19是顯示EV 71 VP1蛋白質的與模型陽離子型聚胺B3形成氫鍵的7個氨基酸基團的 使用MVD軟件的計算機繪圖：Gin 269、Arg 267、Glu 124、Asn 228、Ser 275、Ala 224和Gly 223〇 圖20是顯示模型陽離子型聚胺B3與EV 71 VP1蛋白質的有利結合相互作用的使用MVD 軟件的三維計算機繪圖。 圖21是顯示HSV-1 GD蛋白質的與模型陽離子型聚胺B3形成氫鍵的7個氨基酸基團的使 用MVD軟件的計算機繪圖：Asp 13、Asn 15、Arg 18、Leu 22、Val 24、Gln 27、Ser 8〇 圖22是顯示模型陽離子型聚胺B3與HSV-1⑶蛋白質的最有利結合相互作用的使用MVD 軟件的三維計算機繪圖。 圖23是顯示DENV-3 E蛋白質的與模型陽離子型聚胺B3形成氫鍵的7個氨基酸殘基的使 用MVD軟件的計算機繪圖：Thr 155(B)、Lys 47(B)、Thr 274(B)、Ser 271(B)、Asn 8(B)和 Asp 98(A)、His 27(B)。
[0063]圖24是DENV-3E蛋白質中的5個空腔的使用MVD軟件的三維計算機繪圖。
[0064]圖25是顯示模型陽離子型聚胺B3與DENV-3E蛋白質的最有利結合相互作用的使用 MVD軟件的三維計算機繪圖。
[0065]圖26是顯示CHIKV E1蛋白質的通過氫鍵合與模型陽離子型聚胺B3相互作用的7個 氨基酸殘基的使用MVD軟件的計算機繪圖：Gin 373、Gln 368、Thr 17、Gly 12、Glu 32、Thr 338和His 394。
[0066]圖27是模型陽離子型聚胺B3與CHIKV El蛋白質的最有利結合相互作用的使用MVD 軟件的三維計算機繪圖。
[0067]圖28是顯示流感病毒HA蛋白質的與模型陽離子型聚胺B3形成氫鍵的4個氨基酸殘 基的使用MVD軟件的計算機繪圖：Arg 285、Ser 282、Ser 130和Phe 415。
[0068]圖29是HA蛋白質中的4個空腔的使用MVD軟件的三維計算機繪圖。
[0069]圖30是顯示模型陽離子型聚胺B3與HA蛋白質的最有利結合的使用MVD軟件的三維 計算機繪圖。
[0070] 圖31是顯示HSV-2⑶蛋白質的與模型陽離子型聚胺B3形成氫鍵的9個氨基酸殘基 的使用MVD軟件的計算機繪圖：Asp 139、Arg 222、Ser 140、Asp 26、Asn 227、Thr 230、Lys 237、Val 24和Gin 27。
[0071] 圖32是⑶蛋白質中的4個空腔的使用MVD軟件的三維計算機繪圖。
[0072]圖33是顯示模型陽離子型聚胺B3與⑶蛋白質的最有利結合相互作用的使用MVD軟 件的三維計算機繪圖。
[0073]圖34是顯示TM-1蛋白質的與模型陽離子型聚胺B3形成氫鍵的8個氨基酸殘基的 使用MVD軟件的計算機繪圖：Lys 102(B)、Ser 3(B)、Thr 20(A)、Thr 20(B)、Ser 22(A)、Gln 101(A)、Asp 100(A)和Glu 6(B)。
[0074]圖35是顯示模型陽離子型聚胺B3與TIM-1蛋白質的最有利結合相互作用的使用 MVD軟件的三維計算機繪圖。
[0075]圖36是顯示HM-3蛋白質的與模型陽離子型聚胺B3形成氫鍵的5個氨基酸殘基的 使用MVD軟件的計算機繪圖:Glu 106(A)、Cys 39(A)、Lys 103(A)、Ser 20(A)和Tyr 7(A)。 [0076]圖37是顯示模型陽離子型聚胺B3與TM-3的最有利結合的使用MVD軟件的三維計 算機繪圖。
[0077]圖38是顯示DENV-3E蛋白質的與模型陽離子型聚胺B3結構形成氫鍵的3個氨基酸 殘基的使用MVD軟件的計算機繪圖:Glu 13(A)、Ala 35(A)和Phe 335(A)。
[0078]圖39是顯示模型陽離子型聚胺B3與DENV-3E蛋白質的最有利結合相互作用的使用 MVD軟件的三維計算機繪圖。
[0079]圖40是顯示流感HA蛋白質的與模型陽離子型聚胺B2形成氫鍵的5個氨基酸殘基的 使用MVD軟件的計算機繪圖：Arg 285、Glu 430、Ser 282、Ile 283和Asp 287。模型B2材料具 有2個甘露糖基團。
[0080] 圖41是顯示模型陽離子型聚胺B2與流感HA蛋白質的最有利結合的使用MVD軟件的 三維計算機繪圖。
【具體實施方式】
[0081] 公開了預防、處理和/或抑制病毒進入哺乳動物細胞中和/或在哺乳動物細胞中復 制的方法。所述方法利用了經改性的聚乙烯亞胺(PEI)，其在本文中被稱為陽離子型聚胺。 所述陽離子型聚胺包含連接到各自的骨架氮的具有一般結構的側鏈，其中f 包含至少一個碳和至少一個醇基。所述陽離子型聚胺可包含1到約70個連接到PEI的伯胺基 和仲胺基的側鏈基團。PEI的總數的0%到約70%、優選約20%到約40%的胺基 (即，伯胺基、仲胺基和叔胺基)包含f基團。陽離子型聚胺的超過0%且最多100%的任何剩 余未經改性的伯胺基、仲胺基和叔胺基以作為銨鹽的質子化形式存在。在一個實施方案中， 每個f基團包含單糖部分(糖部分）。
[0082] 陽離子型聚胺可與免疫細胞以及靶細胞競爭與病毒包膜蛋白質(E蛋白質）結合， 由此阻礙所述病毒進入哺乳動物細胞中、緩解對免疫系統的應力并且減輕因免疫缺陷所致 的副作用。分子對接計算揭示了陽離子型聚胺與病毒表面蛋白質的意外的且通常特異性的 相互作用。病毒結合測定證實在將病毒與陽離子型聚胺培育后的感染的顯著降低。該動態 氫鍵合特異性相互作用的一般性提供了似乎對突變免疫的廣譜抗病毒活性，由此緩和和/ 或預防產生病毒抗性。
[0083] 陽離子型聚胺還可通過結合到表面蛋白質和其它分子如細胞的硫酸乙酰肝素蛋 白聚糖來干擾病毒進入哺乳動物細胞中。例如，陽離子型聚胺可結合到TIM(T_細胞免疫球 蛋白和粘蛋白）受體蛋白質，由此抑制靶向哺乳動物細胞的HM受體的病毒。經處理的細胞 可具有在約2.7mg/L到約6.8mg/L范圍的EC50值（即，將抑制50%細胞的病毒感染的陽離子 型聚胺的有效濃度），EC50值取決于HM受體的類型。
[0084]陽離子型聚胺的pH緩沖能力也可抑制酸驅動的病毒的胞內體釋放，由此阻礙病毒 復制。
[0085]陽離子型聚胺可抑制一種或多種病毒。代表性病毒包括登革熱病毒（例如，0￡附-1、DENV-2、DENV-3、和/或DENV-4)、流感病毒(A/H3N2)、CHIKV(基孔肯雅病毒）、SARS Co-V (SARS冠狀病毒）、EV 71(腸道病毒71)和單純皰疹病毒(例如，HSV-1和HSV-2)。在一些情況 下，在低到〇.〇12mg/L的陽離子型聚胺濃度下，病毒活性被有效地抑制，對哺乳動物細胞具 有高選擇性。在對病毒的有效濃度下，陽離子型聚胺對哺乳動物細胞可以是非細胞毒性的 和非溶血性的。
[0086]陽離子型聚胺
[0087]陽離子型聚胺包含至少一條具有聚合物骨架的聚合物支鏈，所述聚合物骨架包含 多個在本文中被稱為乙烯亞胺單元的重復單元。每個乙烯亞胺單元具有排布如下的1個骨 架氮和2個骨架碳：
[0089]這里，帶星號的鍵表示附著點，而非甲基。應當理解，標記為1的氮是三價且每個碳 是四價。碳和氮上的其它取代基在上述結構中未顯示。標記為1的氮表示給定乙烯亞胺單元 的頭部，并且標記為3的碳表示給定乙烯亞胺單元的尾部。相鄰乙烯亞胺單元是頭接尾共價 連接的（給定乙稀亞胺單元的帶星號的氮1鍵連接到相鄰乙稀亞胺單元的碳3)。
[0090] 陽離子型聚胺可以是不具有呈季銨鹽形式的骨架氮的有效抗病毒劑。這里，季銨 鹽包含僅共價連接到碳(例如，4個碳)且與帶負電荷的抗衡離子X _共價締合的帶正電 荷的氮。季銨鹽的帶正電荷的氮不共價結合到任何氫。在一個實施方案中，陽離子型聚胺結 構不包括呈季銨鹽形式的任何骨架氮。
[0091] 陽離子型聚胺包括一條或多條包含乙烯亞胺單元的聚合物鏈(支鏈）。直鏈陽離子 型聚胺包含i) 一個包含多個乙烯亞胺單元的支鏈和ii)兩個聚合物鏈端基(也被稱為外周 端基或懸掛端基）。支鏈陽離子型聚胺包含兩個或更多個包含乙烯亞胺單元的交叉支鏈和 三個或更多個外周端基。
[0092] 方案1說明直鏈陽離子型聚胺和具有兩個支鏈的支鏈陽離子型聚胺的乙烯亞胺單 元的骨架碳對和骨架氮的交替排布的示例。包圍在圓括號中的*-C-C-N-*單元表示乙稀亞 胺單元。未顯示骨架碳和氮的端基、電荷、抗衡離子和取代基。
[0093] 方案 1.
[0095]如上文所示，相鄰*-C-C-N_*單元頭接尾連接（即，一個乙稀亞胺單元的氮1連接到 相鄰乙烯亞胺單元的碳3)。
[0096]陽離子型聚胺的骨架伯胺氮、骨架仲胺氮和骨架叔胺氮可作為質子酸的銨鹽（即， 伯銨鹽、仲銨鹽或叔銨鹽)存在。伯銨鹽包含共價連接到1個碳和3個氫并且與帶負電荷的抗 衡離子非共價締合的帶正電荷的氮。仲銨鹽包含共價連接到2個碳和2個氫并且與帶負電荷 的抗衡離子非共價締合的帶正電荷的氮。叔銨鹽包含共價連接到3個碳和1個氫并且與帶負 電荷的抗衡離子非共價締合的帶正電荷的氮。
[0097]陽離子型聚胺包含至少一個式（1)的不帶電荷的N-酰化乙烯亞胺單元：
[0099] 其中每個f是基團包含至少一個碳和至少一個醇羥基。
[0100] 陽離子型聚胺進一步包含多個獨立地選自由以下組成的組的乙烯亞胺單元：
[0101] i)式(2a)的質子化伯乙稀亞胺單元：
[0103] ii)式(2b)的非質子化伯乙稀亞胺單元：
[0105] iii)式(3a)的質子化仲乙稀亞胺單元：
[0107] 其中帶星號的氮鍵連接到碳，
[0108] iv)式（3b)的非質子化仲乙條亞胺單元：
[0110]其中帶星號的氮鍵連接到碳，
[0111] v)式(4a)的質子化叔乙稀亞胺單元：
[0113]其中帶星號的氮鍵連接到不同的碳，和 [0114] vi)式(4b)的非質子化叔乙稀亞胺單元：
[0116]其中帶星號的氮鍵連接到不同的碳。超過0%的乙烯亞胺單元以質子化形式存在。 [0117] 在上述結構以及以下結構中的每一個中，X?是通過與標記為1的帶正電荷的氮 非共價相互作用而被結合的帶負電荷的抗衡離子。示例性的帶負電荷的抗衡離子包括鹵離 子(例如，氟離子、氯離子、溴離子、碘離子）、硝酸根、氫氧根、甲磺酸根和羧酸根(例如，乙酸 根、苯甲酸根）。在一個實施方案中，X?是氯離子。陽離子型聚胺包含單獨或組合的xe基 團。
[0118] K'基團包括環狀和非環狀基團、芳香族和非芳香族基團以及其組合，包含一個或 多個醇羥基。在一個實施方案中，f選自由以下組成的組:羥基亞烷基、羥基亞烷氧基、包含 兒茶酚基團的基團和包含單糖基團（糖部分)的基團。單糖基團包括己糖的立體特異性形式 和非立體特異性形式，特別是甘露糖、葡萄糖和半乳糖的那些。這些例示在方案2中。
[0119] 方案 2.

[0122] 單糖部分可通過任何合適的連接基團(包括單鍵)連接到式(1)的羰基。
[0123] 將式(1)的羰基接合到糖部分的連接基團可連接到糖部分的任一個醇羥基。
[0124] *-C( =0)1^基團的非限制性示例包括方案3的那些。
[0125] 方案 3.

[0128] 在上述結構中，帶星號的鍵連接到式（1)的羰基。式（1)的骨架氮可與連接到K'的 羰基完成酰胺基、氨基甲酸酯基或脲基。陽離子型聚胺可包含單獨或組合的f基團。
[0129] 陽離子型聚胺骨架包含以頭接尾排布共價連接的乙烯亞胺單元。這里，〃共價連 接〃意指直接和/或間接共價連接。〃直接共價連接〃意指通過單個共價鍵接合在一起。〃間接 共價連接"意指通過連接基團共價連接。例如，陽離子型聚胺的含有陽離子型聚胺的聚合物 骨架的一個或多個其它乙烯亞胺單元的化學結構的一部分可以是將N-酰化乙烯亞胺單元 共價連接到質子化仲乙烯亞胺單元的連接基團。
[0130]陽離子型聚胺可進一步包含一個或多個式(5)的氧化乙烯亞胺單元：
[0132]陽離子型聚胺可進一步包含一個或多個式(6)的酰胺乙烯亞胺單元：
[0134] 其中V是甲基、乙基、丙基或丁基。
[0135] 質子化和非質子化的叔乙烯亞胺單元用作交叉支鏈的接合點。質子化和非質子化 的伯乙烯亞胺單元用作支鏈端接單元。這里，連接到伯乙烯亞胺單元的氮的氫可以是聚合 物鏈端基。陽離子型聚胺可具有其它聚合物鏈端基。
[0136] 陽離子型聚胺包含至少一個式（1)的N-酰化乙烯亞胺單元和至少一個選自由式 (2a)、式（3a)和式(4a)組成的組的陽離子型乙烯亞胺單元。更具體的陽離子型聚胺包含約 100到約400個乙烯亞胺單元，其中1到約200個乙烯亞胺單元是式（1)的N-酰化乙烯亞胺單 元。仍更具體的陽離子型聚胺包含約200到約300個乙烯亞胺單元，其中1到約170個乙烯亞 胺單元是式（1)的N-酰化乙烯亞胺單元。仍更具體的陽離子型聚胺包含約200到約300個乙 稀亞胺單元，其中1到約50個乙稀亞胺單元是式（1)的N-酰化乙稀亞胺單元。
[0137] 直鏈陽離子型聚胺的端基可以是任何合適的端基，如例如氫、烷基、胺基、羥基烷 基和其組合。
[0138] 直鏈陽離子型聚胺包含1個包含聚乙烯亞胺骨架的聚合物支鏈。更具體的直鏈陽 離子型聚胺包含100到400個乙烯亞胺單元，其中1到約200個是式（1)的N-酰化乙烯亞胺單 元。直鏈陽離子型聚胺的其余乙烯亞胺單元可以是式(3a)和式(3b)的仲乙烯亞胺單元。在 一個實施方案中，直鏈陽離子型聚胺包含1到約50個式(5)的氧化乙烯亞胺單元。在另一實 施方案中，直鏈陽離子型聚胺包含1到約30個式(6)的酰胺乙烯亞胺單元。
[0139] 支鏈陽離子型聚胺包含2個或更多個交叉聚合物支鏈，其中每個支鏈包含聚乙烯 亞胺骨架。更具體的支鏈陽離子型聚胺包含100到400個乙烯亞胺單元，其中1到約170個是 式（1)的N-酰化乙稀亞胺單元。剩余的乙稀亞胺單元包括至少1個叔乙稀亞胺單元和至少1 個仲乙稀亞胺單元。剩余乙稀亞胺單元中的至少一個是式（2a)、式（3a)或式(4a)的帶正電 荷的乙烯亞胺單元。在一個實施方案中，支鏈陽離子型聚胺包含1到約50個式(5)的氧化乙 烯亞胺單元。在另一實施方案中，支鏈陽離子型聚胺包含1到約30個式(6)的酰胺乙烯亞胺 單元。
[0140] 陽離子型聚胺可具有約500到約100000、更特別地約1500到約60000且最特別地約 5000到約60000的數量平均分子量(Mn)。
[0141] 陽離子型聚胺可包含1到約200個、更特別地1到約150個且最特別地約4到約100個 式（1)的乙烯亞胺單元。在一個實施方案中，陽離子型聚胺具有支鏈聚乙烯亞胺骨架結構并 且包含約4到約150個式（1)的乙烯亞胺單元。在另一實施方案中，陽離子型聚胺具有支鏈聚 乙烯亞胺骨架結構并且包含約4到約150個式（1)的乙烯亞胺單元，其中式（1)的f包含甘露 糖部分。在另一實施方案中，陽離子型聚胺具有直鏈聚乙烯亞胺骨架結構并且包含約1到約 70個式(1)的乙烯亞胺單元，其中式(1)的f包含甘露糖部分。
[0142] 直鏈陽離子型聚胺的制備
[0143] 陽離子型聚胺可從聚乙烯亞胺的基礎形式或部分N-酰化的聚乙烯亞胺制備。這些 基礎聚胺包含至少一個式(7)的非質子化乙烯亞胺單元：
[0145] 更特別地，直鏈陽離子型聚胺可從基礎聚胺制備，所述基礎聚胺是部分或完全水 解的聚(2-烷基_唑啉）。聚（2-烷基囉唑啉)可通過2-烷基Rf唑啉的陽離子型開環聚合(方 案4)制備。
[0146] 方案 4.
[0148] 2-烷基Pg唑啉的開環聚合(R0P)可通過陽離子型引發劑E/+引發，陽離子型引發劑 E /+變成第一端基E' ^〃是以第二端基結束的鏈。R通常是烷基，更特別地&-C4烷基。使 用質子酸將聚(2-烷基囉唑啉)部分水解、之后中和水解的聚合物獲得如方案4中所示的部 分水解的非質子化聚(2-烷基曝唑啉），其中a+b = n，且a>0并且b>0。完全水解的聚(2-烷 基廳唑啉)是直鏈聚乙烯亞胺(LPEI)均聚物(a = n并且b = 0)。部分或完全水解的聚(2-烷基 嗯唑啉）的乙烯亞胺單元是頭接尾連接的。在方案2的上述括號符號中，乙烯亞胺單元在方 括號內的垂直疊加表明聚合物鏈的乙烯亞胺單元的隨機分布。部分水解的聚（2-烷基if惡唑 啉）的商業基礎形式是溶血的，而質子化的部分水解的聚（2-烷基_唑啉）可以是較不溶血 的。
[0149] 制備抗病毒直鏈陽離子型聚胺的方法包括形成適于進行N-酰化的包含基礎直鏈 聚乙烯亞胺(基礎LPEI，其可以是部分或完全水解的聚(2-烷基ii惡唑啉））和有機溶劑(例如， 氯仿)的混合物。將所述混合物任選地在升高溫度下加熱足以溶解基礎LPEI的時間段。然后 用一種或多種N-酰化劑處理溶解的基礎LPEI，之后用質子酸(例如，甲醇/HC1)處理，由此形 成含有式（1)的乙烯亞胺單元的直鏈陽離子型聚胺(經改性的LPEI)。
[0150] 式（5)的氧化乙烯亞胺單元可通過用空氣和/或過氧化物處理包含基礎LPEI和有 機溶劑的混合物被引入基礎LPEI中。所述處理可在任何合適的溫度下進行。用N-酰化劑處 理氧化的基礎LPEI、之后進行酸處理得到包含式（1)的乙烯亞胺單元和式(5)的氧化乙烯亞 胺單元的陽離子型聚胺。通過氧化引入的骨架酰胺基也可潛在地改善生物相容性、生物降 解性和/或降低紅細胞毒性。
[0151] 支鏈陽離子型聚胺的制備
[0152] 支鏈陽離子型聚胺優選從支鏈聚乙烯亞胺(支鏈PEI或BPEI)制備，支鏈聚乙烯亞 胺可例如通過氮丙啶的開環聚合形成。支鏈PEI具有2個或更多個包含骨架氮的交叉聚合物 鏈(支鏈），所述骨架氮呈被骨架亞乙基(*-CH 2CH2-*)交替間隔的伯胺氮、仲胺基氮和叔胺氮 的形式。支鏈PEI包含：
[0153] i)l個或多個式(8)的仲乙烯亞胺單元：
[0155] ii)l或多個式(9)的叔乙烯亞胺單元：
[0157] 其用作交叉支鏈的接合點;和
[0158] iii)2或多個式（12)的伯乙烯亞胺單元：
[0160] 其用作支鏈端接末端單元。
[0161] 支鏈PEI在本文中也由式（13)表示：
[0163]其中j、r、s和t表示BPEI大分子的各自獨立官能團的平均數量。下標j具有大于或 等于4的平均值，并且r+s+t具有大于或等于4的平均值。通過式（13)的符號應當理解開始于 方括號□內且終止方括號外的每組圓括號（）包圍了BPEI的獨立官能團，而非聚合物鏈。另 外，具有帶星號鍵的原子表示與在相反括號上具有帶星號鍵的原子的附著點。另外，官能團 的垂直疊加表明疊加的官能團在支鏈PEI中的隨機分布。右方括號上的給定氮的每個帶星 號鍵連接到左方括號上的不同亞乙基，并且左方括號上的亞乙基的每個帶星號鍵連接到右 方括號上的不同氮，這與相鄰乙烯亞胺單元的頭接尾排布一致。
[0164] 在一個實施方案中，j具有約180到約360的平均值，r具有約90到約140的平均值，s 具有約45到約70的平均值，t具有約45到約70的平均值，并且(r+s+t)具有約180到約360的 平均值。在另一實施方案中，支鏈聚乙烯亞胺具有大于1000的重量平均分子量(Mw)。
[0165] 作為示例，商購的支鏈聚乙烯亞胺具有約25，000的重量平均分子量(Mw)、約10， 〇〇〇的數量平均分子量(Mn)，并且基于Mn和等于43的平均乙烯亞胺單元分子量，含有平均 233個亞乙基（j)、116個骨架仲氮(r)、58個骨架叔氮(s)和58個伯胺氮(t)。在這種情況下，j =233，『=116,8 = 58且丨=58。該材料在本文中被稱為8卩￡125。
[0166] 作為另一示例，商購的支鏈聚乙烯亞胺具有約2000的重量平均分子量(Mw)、約 1800的數量平均分子量(Mn)，并且基于Mn和等于43的平均乙烯亞胺單元分子量，含有平均 40個亞乙基（j)、20個骨架仲氮(r)、10個骨架叔氮(s)和10個伯胺氮(t)。在這種情況下，j = 40，r = 20，s = 10且t = 10。該材料在本文中被稱為BPEI1.8。
[0167] 支鏈陽離子型聚胺可通過用能夠引入一個或多個上述N-酰基的N-酰化劑處理支 鏈PEI的基礎形式來制備。用質子酸處理經改性的支鏈PEI提供支鏈陽離子型聚胺。
[0168] 如果期望的話，支鏈PEI和/或經改性的支鏈PEI可如上文所述被氧化以引入式(5) 的氧化乙烯亞胺單元，用于將溶血最小化和/或增強生物降解性。氧化可發生在形成經改性 的支鏈PEI之前、期間和/或之后。
[0169] 用于形成陽離子型聚胺的BPEI可具有約1000到約75,000的數量平均分子量(Mn)。
[0170] 下文進一步的實施例中利用了兩種BPEI，其被命名為BPEI 1.8和BPEI25 APEI1.8 具有約2000的Mw和約1800的數量平均分子量(MnhBPEUS具有約25,000的]\^和約10,000的 Mn〇
[0171] BPEI可具有大量的陽離子電荷和中和胞內體pH的強大能力。經改性的BPEI還可具 有緩沖能力，所述緩沖能力可通過選擇BPEI的分子量和/或官能化的程度和類型來改變。大 量的伯胺基提供了用于眾多種官能團的隨后轉化和安置的位點。以這種方式，可以調節聚 合物/細胞相互作用、聚合物/病毒相互作用和細胞毒性。
[0172] 端基
[0173] 對于陽離子型聚胺端基沒有限制，條件是所述端基不降低所述聚合物的抗病毒性 質。
[0174]直鏈陽離子型聚胺包含連接到乙烯亞胺單元的骨架氮(上文標記為1)的第一端基 f。示例性第一端基包括氫或&-&<)烷基或芳基。直鏈陽離子型聚胺可包含連接到乙烯亞胺 單元的末端碳(上文標記為3)的第二端基E〃。示例性第二端基包括伯胺基(*-NH2)、羥基(*-OH)和其起因于與N-酰化劑的反應的酰化衍生物。支鏈陽離子型聚胺的端基可基本上由式 (9)的伯乙烯亞胺單元和其酰化衍生物組成。直鏈和支鏈陽離子型聚胺可具有其它端基。
[0175]烷基端基通過陽離子型聚胺的以下鏈端接單元來例示：
[0176] i)連接到烷基取代基Re的仲乙烯亞胺單元，其具有式(14):
[0178] 其中Re是d-Cw烷基或芳基，和
[0179] ii)連接到烷基取代基Re的酰化乙烯亞胺單元，其具有式(15):
[0181] 其中RlCrCn)烷基或芳基，并且rIQ-Ckj烷基。在一個實施方案中，Rl甲基或 乙基。
[0182] 羥基端基通過直鏈PEI的以下鏈端接單元來例示：
[0183] i)連接到羥基的質子化仲乙稀亞胺單元：
[0185] ii)連接到羥基的酰化乙稀亞胺單元：
[0187] 氨基端基通過直鏈PEI的以下鏈端接單元來例示：
[0188] i)連接到質子化伯胺基的仲乙條亞胺單元：
[0190] ii)連接到質子化伯胺基的酰化乙稀亞胺單元：
[0192] 其它端基包括烷氧基、巰基(*-SH)以及經取代的質子化仲胺基和經取代的質子化 叔胺基。其它端基包括任何上述基團的衍生物（例如，羥基端基和氨基端基各自的酯和酰 胺）。陽離子型聚胺可包含單獨或組合的端基。
[0193] N-酰化劑
[0194] N-酰化劑是能夠在一個或多個方法步驟中與PEI骨架的伯胺氮或仲胺氮反應以形 成包含側鏈的式(1)的乙稀亞胺單元的化合物，其中f含有至少一個醇基。
[0195] N-酰化劑包含用于偶合到PEI氮的活性基團。用于N-酰化的非限制性活性基團包 括羧酰氯、羧酸酐、活性酯、活性碳酸酯、環狀碳酸酯、內酯、異氰酸酯和活性氨基甲酸酯。
[0196] N-酰化劑可包含受保護的醇基，其可在N-酰化后脫保護。
[0197] N-酰化劑可包含潛在形式的醇基(例如，如環狀碳酸酯的開環中由于N-酰化而形 成的醇基）。
[0198] 基于這些考慮，對于本領域技術人員將顯而易見的是，許多化合物可以得到或可 被容易地制備用于引入*_C( =0)1^側鏈。
[0199] 優選的N-酰化劑包括可在一個步驟中引入醇基的環狀碳酸酯。示例性環狀碳酸酯 包括方案5的那些。
[0200]方案 5.


[0204] 其它優選的環狀碳酸酯包含糖部分或兒茶酚基團的受保護和/或未受保護的醇 基，如例如方案6的那些。
[0205] 方案 6.

[0208] 抗病毒性質
[0209] 對于下文進一步的實施例來說，以下定義可適用。
[0210] EC50被定義為50%的測試哺乳動物細胞在給定的響應時間內不被病毒感染的陽 離子型聚胺的濃度(mg/L)。小EC50值是期望的。
[0211] CC50被定義為在給定的響應時間內殺死50%的測試哺乳動物細胞的陽離子型聚 胺的濃度(mg/L)。高CC50值是期望的。
[0212]病毒選擇性被定義為CC50/EC50。高病毒選擇性值是期望的。
[0213] LD50被定義為在給定的響應時間內殺死50 %的測試群體(例如，小鼠）的劑量(毫 克陽離子型聚胺/千克測試動物）。高LD50值是期望的。
[0214] 抑制病毒的第一方法包括在所述病毒接觸哺乳動物細胞前使所述病毒與陽離子 型聚胺接觸，由此形成包含通過非共價相互作用結合的所述病毒和所述陽離子型聚胺的復 合體，由此抑制所述病毒感染所述細胞。被結合的陽離子型聚胺的緩沖能力也可潛在地阻 礙所述病毒從所述復合體的胞內體釋放，由此抑制病毒復制。非限制性示例性哺乳動物細 胞包括血細胞、肝細胞、鼻細胞、肺細胞和子宮頸細胞。
[0215] 抑制病毒的第二方法包括在哺乳動物細胞接觸病毒前使所述細胞的膜與陽離子 型聚胺接觸，由此形成包含通過非共價相互作用結合到所述細胞膜的所述陽離子型聚胺的 復合體，其中所述復合體抑制和/或阻斷所述病毒進入所述細胞中。在一個實施方案中，陽 離子型聚胺結合到細胞膜的TIM受體。
[0216] 還公開了治療患有由病毒引起的疾病的患者的方法，其包括向所述患者施用治療 有效量的所公開的陽離子型聚胺，由此抑制和/或治愈所述疾病。在一個實施方案中，所述 陽離子型聚胺通過注射被施用。在另一實施方案中，所述陽離子型聚胺作為呈鼻噴霧或吸 入噴霧形式的溶液被施用。在另一實施方案中，所述陽離子型聚胺被口服施用。
[0217] 進一步公開了治療和/或預防由病毒引起的醫學病況的方法，所述方法通過使所 述病毒與所公開的陽離子型聚胺接觸、由此抑制所述病毒在哺乳動物細胞中進行感染和/ 或復制而進行。
[0218] 還公開了用于預防和/或治療病毒感染的醫學組合物，其包含一種或多種上述陽 離子型聚胺。所述醫學組合物可以是藥物。對所述藥物的施用方式沒有限制。藥物可具有溶 液、凝膠、粉末、丸劑、糊劑或軟膏的形式。藥物可包含水。藥物可作為可攝入固體(例如，丸 劑）、可攝入液體(例如，飲料）、作為沖洗溶液(例如，漱口液、其它衛生沖洗液）、作為靜脈內 注射、作為噴霧(例如，鼻噴霧）、作為吸入劑、作為皮膚貼劑、作為液滴(例如，滴眼劑)和/或 作為局部施用的軟膏(例如，洗劑)被施用。
[0219]陽離子型聚胺的低平均質量、高抗病毒活性和低體內毒性（即，通過靜脈內注射的 小鼠中的高LD50)使得這些材料作為用于各種各樣的醫學用途(包括治療和/或預防病毒感 染)的廣譜抗病毒劑是有吸引力的。
[0220]以下實施例顯示抗病毒陽離子型聚胺的制備和性質。發現了病毒表面蛋白質與甘 露糖官能化的支鏈聚乙烯亞胺的非共價相互作用。關于病毒的結合和病毒攝取的預防的相 互作用似乎普遍適用于眾多種病毒。其它相互作用如形成病毒/聚合物復合體所需的氫鍵 數量可以是病毒特異性的。超分子聚合物-病毒相互作用提供了具有高選擇性的廣譜活性。 該氫鍵合病毒/聚合物復合體的一般性似乎不受隨后的病毒突變影響，這有助于預防病毒 抗性的發生。因此，所述聚合物/病毒復合體可用于預防病毒感染。
[0221 ]實施例
[0222] 用于以下實施例中的材料列于表1中。
[0223] 表1.

[0226] 這里，Mn是數量平均分子量，Mw是重量平均分子量，并且MW是一個分子的分子量。
[0227] 固體支鏈聚乙烯亞胺(8?6125，1111 10,000，？012.5)在使用前被冷凍干燥。
[0228] 外周血單核細胞(PBMC)和巨噬細胞從來自知情同意后的健康成年個體的人血獲 得。
[0229] 使用活化的氧化鋁柱將無水溶劑干燥并且儲存在分子篩P 上。
[0230] 在Bruker Avance 400儀器上于400MHz獲得1H NMR譜。使用裝配有4個以增加的孔 徑（100埃、1000埃、105埃和 106埃）串聯連接的5微米Waters柱(300mmX7 ? 7mm)、Waters 410 差示折射計和996光電二極管陣列檢測器的Waters系統在四氫呋喃(THF)中進行凝膠滲透 色譜分析(GPC)。使用聚苯乙烯標準物對所述系統進行校準。還使用裝配有兩個串聯連接的 Agilent PolyPore柱（300mmX 7 ? 5mm)、Waters 410差不折射計的Waters系統在慘加有 0.01M LiBr的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中進行GPC分析。利用聚（甲基丙烯酸甲酯)標準物對 所述系統進行校準。
[0231] 環狀碳酸酯的制備
[0232] MTC-〇H(MW 160.1)的制備.
[0234] MTC-OH可通過R? C? Pratt等人，Chemical Communications，2008，114-116的方法 制備。
[0235] MTC-C6F5(MW 326.2)的制備.
[0237]向 100mL 圓底燒瓶中裝入雙 _10^，（7)，（5.0(^，37111111〇1，麗134.1)、雙-(五氟苯基） 碳酸酯(？卩(：，31.0(^，78111111〇1，麗 394.1)和08卩(2.58，16.4111111〇1)，用701111四氫呋喃（1'冊)沖 洗。起初反應是多相的，但1小時后形成澄清的均相溶液，將其攪拌20小時。在真空中去除溶 劑并且將殘余物再溶解于二氯甲烷中。將溶液靜置大約10分鐘，此時五氟苯酚副產物沉淀 并且可以被定量地回收。該五氟苯酚副產物顯示如下特征:在五氟苯酚的 19F NMR中的3個特 征峰和在GCMS中的質量為184的單峰。用碳酸氫鈉水溶液萃取濾液并且用MgSCk干燥。在真 空中蒸發溶劑并且使產物再結晶（乙酸乙酯/己烷混合物），得到呈白色結晶粉末的MTC-〇6?5 <^1^具有質量為3268/111〇1的單峰。(：121^30 5的計算分子量與所指派的結構一致。111-NMR(400MHz，在CDC13中）：S4.85(d，J= 10.8Hz，2H，CHaHb)，4.85(d，J= 10.8Hz，2H，CHaHb)， 1.55(s，3H，CCH3)〇
[0238]實施例1.受保護的甘露糖官能化的環狀碳酸酯(MTC-IPMAN)的合成.
[0240] 5-甲基-5-羧基_1，3_二嗯烷-2-酮(MTC-OH)和單體MTC-ipman制備如下。將草酰氯 的無水四氫呋喃(THF)溶液(2.481^，19.0臟〇1，5〇11^)逐滴添加到5-甲基-5-羧基-1，3-二囉 烷-2-酮(MTC-OH)的無水THF溶液（2.75g，17.2mmol，50mL)中。然后在氮氣氛下經30min添加 催化量(3滴)的無水二甲基甲酰胺(DMF)，并且將反應混合物攪拌1小時，同時使氮鼓泡通過 該混合物以去除揮發物。在真空下蒸發溶劑后，將固體殘余物（中間產物MTC-C1)溶解于 50mL的無水氯仿中，并且在室溫下經30分鐘將2，3 ; 5，6-二-0-異亞丙基-D-呋喃甘露糖 (IPMAN，4 ? 13g，15 ? 8mmo 1)和三乙胺（2 ? 8mL，20 ? 6mmo 1)于50mL無水氯仿中的混合物逐滴滴 加到所述溶液中。將反應混合物加熱到40 °C并且攪拌48小時。將所得到的溶液冷卻到室溫， 濃縮，用THF(lOOmL)處理以使三乙胺鹽沉淀，并且過濾。在蒸發濾液后，將粗制產物通過硅 膠柱，通過乙酸乙酯和己烷(20/80到50/50)的梯度洗脫，提供呈粘性無色油的產物，其緩慢 凝固成白色固體（S.SSgjS^hiH-NMRGOOMHz^DChJSDJeJSbd^H-ahtSWdd， lH，H-b)，4.72(d，2H，H-c)，4.66(m，2H，H-c)，4.41(m，lH，H-d)，4.22(m，2H，H-e)，4.11(dd，， 2H，H-e)，4?03(m，2H，Hf+H-g)，1?50-1?33(5s，15H，H-h+H-i)。
[0241] MTC-兒茶酚的制備.
[0243] 將3，4-雙（芐氧基）苯甲酸2-羥乙酯（HEBB，2 ? 81 g，7 ? 42mmo 1)、MTC-C6F5 (2 ? 54g， 7 ? 79mmol)和質子海綿（1 ? 59g，7 ? 42mmol)溶解于THF( lOmL)中并且在室溫下攪拌過夜。在完 成反應后，添加二乙醚和己烷的混合物，并且將所述溶液在-40°C靜置幾小時。獲得白色晶 體并且用二乙醚和己烷洗滌。產率:2.(^(71%)。 111匪1?(40010^，0)(：13,22°(：):87.64((1，211， 苯甲酸酯的 H)，7.43(111，10H，-0CH2PhH)，6.97(d，lH，苯甲酸酯的 H)，5.24(d，4H，-0CH2PhH)， 4 ? 68 (d，2H，-CH20⑶0-)，4 ? 54 (s，4H，-COOCH2CH2O-)，4 ? 19 (d，2H，-CH20C00-)，1 ? 32 (s，3H，-CH3)〇
[0244] BPEI25和BPEI1.8綴合物的制備
[0245] 在以下實施例中，BPEI25和BPEI1.8的結構由以下符號表示：
[0247] 下標q表示仲胺基(pKa 8.6)的數量。對于8?￡125來說，9=116。下標8表示叔胺基 (pKa 7.5)的數量。對于BPEI25來說，s = 58。下標t表示伯胺基（pKa 9.6)的數量。對于 BPEI25來說，t = 58。下標j表示亞乙基的數量。對于BPEI25來說，j = 233。因此，BPEI25是每 摩爾具有平均233個亞乙基、58個伯胺基、116個仲胺基、58個叔胺基的超支鏈聚合物。對于 下面的反應來說，1摩爾= l〇〇〇〇g=Mn。
[0248] BPEI1.8每摩爾具有平均40個亞乙基、10個伯胺基、20個仲胺基和10個叔胺基。對 于下面的反應來說，1摩爾= 1800g=Mn。
[0249] 應當理解，右括號的給定氮的每個帶星號鍵連接到左括號的不同亞乙基，并且左 括號上的給定亞乙基的每個帶星號鍵連接到右括號上的不同氮。因此，BPEI骨架包含交替 的胺氮和亞乙基（即，相鄰乙烯亞胺單元以頭接尾排布連接）。叔胺基、仲胺基和伯胺基隨機 分布于BPEI中，如通過右側方括號上的胺基的垂直疊加所表明的。BPEI可含有于叔胺位點 交叉的許多支鏈。取決于BPEI的形成方法，外周端基(懸掛端基)可以是伯胺基、烷基或另一 &-&()部分。在下面的實施例中，支鏈于外周端端接伯胺基。在上文的符號中，所有外周端基 (懸掛端基)都是伯胺基。
[0250]用經甘露糖取代的環狀碳酸酯MTC-IPMAN對BPEI25上的所選數量的伯胺基和/或 仲胺基進行改性。開環反應生成含有氨基甲酸酯側鏈的側鏈，所述氨基甲酸酯側鏈含有受 保護的甘露糖官能團。受保護的甘露糖基團的脫保護獲得帶有甘露糖基團的側鏈。這一改 性的額外益處是經改性的BPEI25的毒性相比于未經改性的BPEI25顯著降低。
[0251] 實施例2到7.通過用MTC-IPMAN對BPEI25(Mn 10,000 = 1摩爾)進行改性來制備B1-B6。下文說明了對BPEI25的改性用于制備B3(實施例4)。對于B3來說，MTC-IPMAN的使用超過 BPEI25的伯胺基。在這些條件下，MTC-IPMAN不經歷開環聚合。用1開環分子的MTC-IPMAN對 約100%的BPEI25伯胺基和約6%的BPEI25仲胺基位點進行改性。隨后異亞丙基縮酮保護基 團的酸催化水解得到含有65個甘露糖單元的經改性的BPEI25,所述甘露糖單元通過各自的 氨基甲酸酯連接基團連接到PEI骨架。
[0253]在手套箱中，將[01?獻~(0.3028,0.7511111101，麗=402.158)添加到8?￡125(0.1 8， O.Olmmol，基于 1 摩爾= 10,000g=Mn)于 2mL 二氯甲烷(DCM)中的溶液中。BPEI25:MTC-IPMAN 進料質量比是1:3，摩爾比是1:75。將反應溶液攪拌1小時。添加1 OmL甲醇和1 OmL 1M HC1 (含 水）。將所得到的反應混合物在回流下加熱2小時，然后冷卻到室溫。最后，通過在Vivaspin 20濃縮器(MWC0 = 5000,Sartorius AG，Goettingen，Germany)中超濾將上述混合物純化，用 去離子(DI)水洗滌3次，并且冷凍干燥(0.19g，48% )。咕-匪以400MHz，D20，22°C): S4.11 (s， 130H，H-d和H-e)，2?56-3?70(br，m，1190H，H-e，H-f，H-g和BPEI的H)，1?10(s，195H，H-i)。
[0254] 在B3的上述結構中，s'表示質子化叔胺基的數量，q'表示呈質子化鹽形式的剩余 仲胺基的數量，V表示呈質子化鹽形式的剩余伯胺端基的數量，u表示帶有部分M'的經改性 仲胺基的數量，并且v表示帶有部分,的經改性伯胺基的數量。對于B3來說，q' ilOls'= 58，t7 =0，u = 7，v = 58^iiu+v = 65〇
[0255] 使用1H-NMR對B3的胺改性水平進行監測和定量（圖1)。例如，比較h-NMR譜中的寬 峰(2.56-3.70ppm)的相對積分強度(其歸屬于BPEI25亞甲基的質子以及甘露糖部分的H-e、 H-f?和H-g)和MTC甲基信號（1.10ppm)的相對積分強度以確定甘露糖基團的數量。B4-B6中的 更多仲胺基位點被改性，其中所引入的甘露糖基團的數量分別是86個、104個和143個。
[0256] 依照用于B3(實施例4)的上述一般程序，通過BPEI25(0?2g，0?02mmol)與MTC-IPMAN(201mg，0.5mmol)在二氯甲烷中的反應制備Bl(實施例2)。引入了總共28個甘露糖基 團（BPEI25:MTC-IPMAN摩爾比：1:28)。對于B1 來說，q' =116,8' =58，t' =30，u = 0，v = 28， 并且 u+v = 28。
[0257] 依照用于B3 (實施例4)的上述一般程序，通過BPE I25(0.12g，0.012mmo 1)與階0 IPMAN(280mg，0.7mmol)在二氯甲烷中的反應制備B2(實施例3)。引入了總共51個甘露糖基 團（BPEI25:MTC-IPMAN摩爾比：1:51)。對于B2來說，q' =116，s/ =58，t' =7，u = 0，v = 51，并 且 u+v = 51 〇
[0258] 隨著改性程度的增加，開環反應愈加受到空間位阻影響，需要更強制的條件以在 更高改性水平下獲得期望水平的經改性胺基。
[0259] 除了在環境溫度下將反應攪拌2.5小時之外，依照用于B3(實施例4)的上述一般程 序，通過BPEI25 (58mg，0.0058mmo 1)與MTC-IPMAN( 280mg，0.7mmo 1)在二氯甲烷中的反應制 備B4(實施例5)。引入了總共86個甘露糖基團（BPEI25:MTC-IPMAN摩爾比：1:86)。對于B4來 說，q' =88，s' =58，t' =0，11 = 28，￥ = 58，并且11+￥ = 86〇
[0260]除了在40°C將反應攪拌3小時之外，依照用于B3(實施例4)的上述一般程序，通過 BPEI 25 (70mg，0 ? 007mmo 1)與MTC-IPMAN( 338mg，0 ? 84mmol)在二氯甲烷中的反應制備B5 (實 施例6)。引入了總共104個甘露糖基團（BPEI25:MTC-IPMAN摩爾比：1:104)。對于B5來說，q' =70,8 7 =58，t7 =0，11 = 46，￥ = 58，并且11+￥ = 104〇
[0261] 除了在40°C將反應攪拌3小時之外，依照用于B3(實施例4)的上述一般程序，通過 BPEI 25 (50mg，0.005mmo 1)與MTC-IPMAN( 362mg，0.9mmo 1)在二氯甲烷中的反應制備B6 (實施 例7)。引入了總共143個甘露糖基團（BPEI25:MTC-IPMAN摩爾比：1:143)。對于B6來說，q'= 3US' =58，i/ =0，11 = 85，￥ = 58，并且11+￥ = 143。
[0262] 實施例8和9.通過用三亞甲基碳酸酯(TMC)對BPEI25進行改性來制備B7和B8。其中 引入25個TMC單元的B7的制備示于以下反應圖中。
[0264] 依照用于B3(實施例4)的上述一般程序，通過8?￡125(0.258,0.025111111〇1)與丁1^ (641^，0.63臟〇1)在二氯甲烷中的反應制備87(實施例8)。引入總共25個了11(：基團。對于87來 說，q' =116，s/ =58,1/ =33，11 = 0，￥ = 25，并且11+￥ = 25。
[0265] 依照用于B3(實施例4)的一般程序，通過8?￡125(0.258,0.025臟〇1)與11^(19111^， 1.87mmol)在二氯甲烷中的反應制備B8(實施例9)。引入總共75個TMC基團。對于B8來說，q' = 99，s7 =58，t7 =33，11 = 17，￥ = 58，并且11+￥ = 75〇
[0266] 實施例10到12.通過用MTC-兒茶酚對BPEI25進行改性來制備B9到BIUBW實施例 10)的制備是代表性的，其中引入5個MTC-兒茶酚基團。受保護的兒茶酚基團的氫還原可在 最終產物中留下0個或多個受保護的兒茶酚基團。
[0268] 根據實施例2在二氯甲烷中用MTC-兒茶酚（62.411^，0.12111111〇1)處理8?￡125(0.3 8， 0.03mmol)。引入總共5個受保護的兒茶酚基團。將所得到的產物在真空中干燥。將受保護的 綴合物（362mg)、Me0H(7 ? 5mL)、THF(7 ? 5mL)和Pd-C(10%w/w，0 ? 2g)的混合物在H2(7個大氣 壓)下渦旋過夜。在抽空氫氣氛后，通過注射器將混合物過濾并且將濾液濃縮到干燥。然后， 依序添加MeOH(lOmL)和1M HC1 (10mL)并且將反應溶液攪拌2到3小時。在酸化后，通過離心 過濾(MWC0 = 3，000)將溶液純化并且用去離子(DI)水洗滌二次重復三次。最后，將離心管中 的濃縮溶液冷凍干燥，獲得脫保護且酸化的BPEI-兒茶酚綴合物B9(0.43g，53 % )。匪R (400MHz，D20，22。(：）： 匪R(400MHz，D 20，22。(：）：祕? 70-7 ? 60 (br，m，15H，PhH)，3 ? 90-4 ? 40 (1^，111，1011，-〇12(^00)，2.50-3.70(1^，111，95011，-〇12〇120(：(0)?11和8?￡125的11)，1.03(111， 15H，-CH3)〇
[0269] 對于B9來說，q' = 116，s' =58，1/ =53，u = 0，!/ =0，v>0，v' 2 =0，并且u+u'+v+ v7 = 5〇
[0270] 依照實施例 10 的一般程序，通過 8?￡125(0.38,0.03111111〇1)與[(：-兒茶酚（124.81^， 0.24mmol)在二氯甲烷中的反應制備B10(實施例11)。引入總共12個兒茶酚基團。對于B10來 說，q' =116，s/ =58,1/ 二斗已，!!：。，!/ =0，v>0，v/ 2 =0,并且u+u'+v+v' =12。
[0271] 依照實施例10的一般程序，通過BPEI25(0.2g，0.02mmol)與MTC-兒茶酚（167mg， 0.32mmol)在二氯甲烷中的反應制備Bll(實施例12)。引入總共20個兒茶酚基團。圖2A是氫 解前于MeOD中獲取的1H匪R譜。圖2B是B11在氫解和酸化后于D20中獲取的1H匪R譜。對于 B11 來說，q' =116，s/ =58，i/ =38，u = 0，u/ 2 =0,并且u+u'+v+v' =20。
[0272] BPEI1.8綴合物的制備
[0273] BPE1.8具有Mw 2000和Mn ISOCLBPEIl.S具有q = 20個仲胺基、s = 10個叔胺基、t = 10個伯胺基和j = 40個亞乙基。對于下面的計算來說，1摩爾BPEI1.8 = 1800g。
[0274] 實施例13到15.通過用MTC-IPMAN對BPEI1.8(Mn 1800 = 1摩爾)進行改性來分別制 備B12到價4。812(實施例13)的制備示于以下反應圖中，其中引入4個甘露糖基團。
[0276] 依照用于 B3(實施例 4)的一般程序，通過 8?￡11.8(0.1988,0.11!11111〇1)與]\0'(：-1?]\^~ (1991^，0.495謹〇1)在二氯甲烷中的反應制備812(實施例13)。引入總共4個甘露糖基團。
[0277] 在B12的上述結構中，Y表示質子化叔胺基的數量，Y表示呈質子化鹽形式的剩余 仲胺基的數量，V表示呈質子化鹽形式的剩余伯胺端基的數量，u表示帶有部分M'的經改性 仲胺基的數量，并且v表示帶有部分，的經改性伯胺基的數量。對于B12來說，q' =20, Y = 10，i/ =6，u = 0,且 v = 4,并且 u+v = 4〇
[0278] 依照用于 B3(實施例 4)的一般程序，通過 8?￡11.8(0.1088,0.06111111〇1)與]\0'(：-1?]\^~ (32611^，0.81111111〇1)在二氯甲烷中的反應制備813(實施例14)。引入總共9個甘露糖基團。對 于 B13 來說，q' =20，s/ =10,1/ =l，u = 0,且 v = 9,并且 u+v = 9。
[0279] 依照用于 B3(實施例 4)的一般程序，通過 8?￡11.8(0.0728,0.04111111〇1)與]\0'(：-1?]\^~ (34811^，0.864111111〇1)在二氯甲烷中的反應制備814(實施例15)。引入總共17個甘露糖基團。 對于B13來說，q'=10,1/ =0，u = 7,且v = 10,并且u+v = 17。
[0280] LPEI25綴合物的制備
[0281] LPEI25是由以下符號表示的直鏈聚乙烯亞胺，其具有Mw = 25000、Mn = 10950、PDI 1.16; 0個伯胺端基、247個仲胺基(x)和8個酰化的仲胺基(y)。
[0283] 在方括號內重復單元的垂直疊加表示重復單元的隨機分布。端基E'是甲基并且端 基E〃是0ILE'和E〃并不限于這些端基。對于以下實施例來說，1摩爾LPEI25 = 10950克。
[0284] 實施例16到18.經甘露糖改性的LPEI25聚合物L1到L3(聚合物t到v)的分別制備。 L1的制備是代表性的，其中引入8個甘露糖基團。
[0286] 在真空中將^^125(0.358,0.032臟〇1)在燒瓶中在65°(：加熱3小時。當燒瓶冷卻到 室溫時，將二H惡烷(30mL)添加到所述燒瓶中。然后，將燒瓶中與冷凝器安裝在一起并且加熱 到85°C。在將所有LPEI25溶解于二fl惡烷中并且獲得均勻溶液后，添加MTC-IPMAN(50mg， 0.12mmo 1)于1 OmL二SI惡烷中的溶液。將反應混合物在85 °C與空氣接觸攪拌過夜。將燒瓶冷卻 到室溫，并且通過旋轉蒸發去除溶劑。將所得到的產物在真空中干燥。對于L1來說，Y = 239,7 = 8并且2 = 8。
[0287] 將上述綴合物溶解于MeOH(lOmL)和1M HCl(lOmL)中。將所述溶液在回流下加熱2 小時并且冷卻到室溫。將所得到的溶液通過離心過濾純化(MW⑶=2，000)并且用去離子 (DI)水洗滌三次。最后，將離心管中的濃縮溶液冷凍干燥，獲得酸化的LPEI-Man綴合物L1 (0.47g，80%) c/H-NMRGOOMHzj〗。，〗〗！：）：S3.00-4.00(111，1059H，LPEI和甘露糖的H)，2.37 (m，16H，CH3CH2CONH-)，1 ? 06 (m，24H，CH3CH2CONH-)，0 ? 96 (m，24H，-CH3)。
[0288] 依照實施例 16 的一般程序，通過 1^^125(0.38,0.027111111〇1)與]\11'(：-1?]\^~(10011^， 0.25mmol)的反應制備L2。引入總共15個甘露糖基團。對于L2來說，X' =232，y = 8并且z = 15。
[0289] 依照實施例 16 的一般程序，通過 1^^125(0.28,0.018111111〇1)與]\11'(：-1?]\^~(20011^， 0.5mmol)的反應制備L3。引入總共26個甘露糖基團。對于L3來說，X' =221，y = 8并且z = 26。
[0290] 表2匯總了實施例2-18的經改性的BPEI25和LPEI25聚合物的制備。
[0291] 表2.

[0294] 3從咕NMR獲得?
[0295] 滴定實驗
[0296] B1到B6的經甘露糖改性的胺基的數量分別是28個、51個、65個、86個、104個和143 個。對聚合物B1到B6進行酸堿滴定實驗以評估它們的相對pH中和能力(緩沖能力）。
[0297] 首先將給定的聚合物(O.lmmol的所有胺，不包括與甘露糖官能化的環狀碳酸酯反 應的那些)溶解于NaC 1溶液(7.5mL，150mM)中。添加HC1溶液(22.5mL，0.01N)以使pH降到2， 然后使用自動滴定器（Spectralab Instruments)用0.01N NaOH將該溶液滴定到pH 10。使 用未經改性的8?￡125(1^101^&)作為對照。緩沖能力被定義為聚合物的在5.0到7.4的口11 內被質子化的胺基的百分比，并且通過以下公式來計算:緩沖能力（％) = l〇〇X( AVNa0HX 0.01 X 40)/W，其中A VNaQH是將pH從5.0增加到7.4所需的NaOH(0.0IN，MW 40)的體積，并且W 是所述聚合物的重量(毫克）。
[0298] 表3列出了 BPEI25和B1到B6的的緩沖能力。
[0299] 表3.
[0301]如上文所示的，在聚合物的相同重量濃度下，由于叔胺的數量減少和/或分子量增 加，因此從5.0到7.4的胞內體pH的中和能力隨著甘露糖含量的增加而降低，分子量增加降 低了所述聚合物的每單位質量的叔胺含量。
[0302]抗病毒活性 [0303] 細胞
[0304]在 37°C 在 5%C〇2 中在補充有 10% 胎牛血清（FBS，Invitrogen，Carlsbad，CA)、100 單位/mL青霉素和100微克/mL鏈霉素的伊格爾氏最低必需培養基(EMEM，Sigma-Aldrich， 3七丄〇1118，]\?))中培養1^(：-11(2細胞(猴腎細胞）。
[0305] 將白紋伊蚊C6/36細胞維持在具有HEPES(4-(2-羥乙基）-1_哌嗪乙磺酸，25mM)且 補充有10%FBS(胎牛血清）、100U/mL青霉素和100微克/mL鏈霉素的羅斯韋爾公園紀念研究 所(RPMI)培養基 RPMI-1640(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，并且在 28°C 在 5%C〇2 中培育。
[0306] 在37°C在5%⑶2中使A549復制子細胞（含有DENV-2NS基因）、Vero細胞系（猴腎上 皮）、MDCK細胞系（狗腎上皮）和RD細胞系（人肌梭細胞、橫紋肌肉瘤）在補充有10%FBS、 100U/mL青霉素和100微克/mL鏈霉素的達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(DMEM)中生長。
[0307] 病毒
[0308] DENV-1和DENV-4的臨床樣品以及DENV-2的新幾內亞C(New Guinea C)(NGC)實驗 室適應株由Justin JH Chu博士(新加坡國立大學，新加坡)友好提供。通過Low等人，〃Early Dengue Infection and Outcome Study(EDEN)-Study Design and Preliminary Findings"，Annals Academy of Medicine Singapore 2006,35,第783-789頁的方法分離 DENV-3株EDEN8630K1。使所述病毒在如下文(表5)進一步所述的各種細胞系中繁殖。將來自 受感染細胞的上清液離心以去除細胞碎片，然后等分并儲存在_80°C。
[0309] 基于細胞毒性測定的抗病毒活性
[0310] 通過用DENV(即，0￡附-1、0￡附-2、0￡附-3或0￡附-4)感染讓(：-]\?2細胞來監測聚合 物在所述細胞中的抗登革熱病毒活性和細胞毒性。使受感染(感染復數(M0I):0.5)細胞和 未受感染細胞暴露于一定范圍的濃度的聚合物(在96孔板中的細胞播種密度:2000個/孔）， 并且使其增殖5天。通過3-[4,5_二甲基噻唑-2-基]_2,5_二苯基溴化四唑輸(10'1')(318111 &-Aldrich，St. Louis，MO)測定對活細胞數量進行定量以獲得EC50(來自受感染細胞)和CC50 (來自未受感染細胞）。
[0311] 噬斑形成測定
[0312] 對于聚合物的EC50確定來說，將病毒以lOOpfu/孔的M0I與各種濃度的聚合物添加 到6孔板(細胞播種密度:3X10 5個）中的LLC-MK2細胞中，并且在4°C培育90min。然后去除培 養基，并且用冷PBS(pH 7.4)洗滌所述細胞，然后用含有相應濃度的聚合物的培養基在37°C 培育所述細胞。在接種后5天，在室溫下用PBS(pH 7.4)中的4%多聚甲醛將所述細胞固定20 分鐘。接下來，用水將細胞洗滌20分鐘，然后添加lmL 1%結晶紫，室溫下保持20分鐘。將板 洗滌并干燥，并且對每毫升的噬斑形成單位(pfu/mL)進行計數和計算以獲得EC50。
[0313]添加時間實驗
[0314]將LLC-MK2細胞以30X 104個細胞/孔播種于6孔板中。在搖動平臺上將所述細胞與 DENV-2(100pfu/孔)在4°C培育90min。然后用冷PBS將所述細胞洗滌3次并且將板轉移到37 °C培育器并培養。在預定時間點（-1.5小時、0小時、1小時、2小時、3小時、4小時和5小時)將 含有50mg/L B3或100mg/L肝素(MP Biomedicals，Solon，OH)的培養基添加到所述細胞中。 在37°C培育5天后，通過噬斑測定來研究病毒抑制活性。一式三份進行實驗并且相對于對照 計算平均抑制百分比，對照是在沒有聚合物的相同條件下進行的。
[0315]病毒結合測定
[0316] 將DENV-2與PBS(pH 7.4)或含有83(5〇11^/1)的？83在4°(：培育1小時以使所述聚合 物結合到所述病毒上。然后6000 Xg通過Vivaspin 500(1001^&分子量截止值）（6￡ Healthcare Buckinghamshire，UK)以過濾15分鐘來去除未結合的聚合物分子。使病毒經受 如上文所述的斑測定以確定效價。
[0317]細胞結合測定
[0318] 在37 °C用B3 (50mg/L)將LLC-MK2細胞處理2小時、1小時、30分鐘和15分鐘，并且用 PBS洗滌。然后使所述細胞被DENV-2感染90分鐘，并且在噬斑減少測定前在37°C接種5天。將 無聚合物的對照感染設定為100%。將數據表示為三次單獨實驗的平均值±30(標準偏差）。 [0319]細胞融合抑制測定
[0320]本測定用于檢測聚合物在低pH下對細胞融合的抑制。在測定前一天將C6/36細胞 以1.0 X 106個細胞/孔的細胞密度播種于6孔板中。在4°C將DENV-2以感染復數(M0I )0.03連 同50mg/L B3、100mg/L肝素或培養基一起接種到被播種的C6/36細胞上，保持90分鐘。然后 用PBS將板洗滌3次。將含有所述聚合物/肝素的新鮮培養基添加到板中，并且將所述細胞在 28°C培育2天。此后，通過添加50微升的0.5M 2-(N-嗎啉）乙磺酸(1^3)化115.0)(318111&-八1(14(^，3丨丄〇1118，110)，將所述培養基酸化以誘導融合，之后在28°(：培育2天。然后根據制 造商方案用吉姆薩(Giemsa)染料改良溶液(Sigma-Aldri Ch，St.L〇uis，M0)將融合細胞染 色。在光學顯微鏡(CKX 31顯微鏡，Olympus，Tokyo,Japan)下分析被染色的板。在另一組實 驗中，將病毒和細胞在4°C培育90分鐘，然后添加所述聚合物或肝素。
[0321] 藥物抗性的評估
[0322] 通過在EC50的B3存在下將DENV-2在LLC-MK2細胞上傳代來研究藥物抗性。在EC50 的B3存在下使6孔板中的細胞(3X105個/孔)被DENV-2(從先前傳代獲得）以0.1的MOI感染。 通過如上文所述的噬班形成測定來確定每次傳代的EC50。
[0323]通過注射進行的體內毒性研究
[0324] 根據由新加坡生物研究中心（Singapore Biological Research Center)(BRC)的 公共機構動物護理和使用委員會（Institutional Animal Care and Use Committee)和 IBM的動物護理和使用委員會批準的方案進行動物研究。在用于研究LD50和對主要器官肝 臟和腎臟的毒性以及血液中的電解質平衡的所有實驗中均使用雌性Balb/c小鼠（6-7周， 18-22g)〇
[0325] 根據OECD化學品測試導則（OECD Guidelines for the Testing of Chemicals) (OEO) 425)中所述的上下法(Up-and-Down-Procedure)來確定LD50(對于給定的測定持續 時間，殺死一半小鼠群體所需的劑量）。將20只小鼠觀察7天并且隨機標記以允許個體識別。 將B2或B3溶解于PBS (pH 7 ? 4)中，并且通過以設計劑量（即，56 ? 0mg/kg、175mg/kg、560mg/kg 和1750mg/kg，0.1mL)進行尾靜脈注射給予小鼠。在處理后將死亡率監測14天，并且使用最 大似然法確定LD50。
[0326] 對急性毒性的評估來說，每組各10只小鼠的兩個組接受在100微升滅菌鹽水中的 60mg/kg B3的靜脈內注射。于48小時將10只小鼠處死并且于14天將剩余小鼠處死以收集血 液樣品用于分析ALT、AST、總膽紅素(TBIL)、肌酸酐、脲氮、鈉離子和鉀離子水平。
[0327] 結果
[0328] 經改性PEI聚合物的抗病毒活性和選擇性
[0329] 通過常規的MTT測定使用被DENV-2(登革熱病毒-2)感染的LLC-MK2細胞研究未經 改性的PEI聚合物和經改性的PEI聚合物(支鏈和直鏈）的抗病毒活性。表4列出了當同時培 育所述病毒、細胞和聚合物時獲得的8?￡125、8?￡11.8、81-814和11-13的￡050、0：50和選擇 性（CC50/EC50)。
[0330] 表4.

[0333] aEC50是所述聚合物保護50%的細胞免受病毒感染的有效濃度。低EC50值是期望 的。
[0334] bCC50是殺死50%的細胞的細胞毒性聚合物濃度。高0：50值是期望的。
[0335] 。選擇性被定義為CC50/EC50。高選擇性是期望的。
[0336] d從1H NMR獲得。
[0337] 所述聚合物以劑量依賴方式抑制DENV-2復制，具有0.01mg/L到50.5mg/L范圍的低 EC50值。未經改性的BPEI25(對照樣品）是針對登革熱病毒感染的最強效聚合物，具有最低 EC50(0.01mg/L)。未經改性的BPEI25還是細胞毒性最高的，具有5.44mg/L的CC50。盡管甘露 糖取代降低了抗病毒能力（即，增加了 EC50)，但這種方法有效地減輕了PEI細胞毒性（即， CC50隨著甘露糖改性的增加而增加）。例如，當甘露糖基團的數量從28個增加到65個(分別 為B1-B3)時，CC50從26.7mg/L增加到高于1000mg/L。在所有聚合物中，具有65個甘露糖殘基 的B3具有3333的最高選擇性指數(SI，即CC50/EC50)。高選擇性是期望的。
[0338]在臨床上相關的人原代外周血單核細胞(PBMC，圖3,圖表)和巨噬細胞（圖4,圖表） 中進一步評估B3針對DENV-2的抗病毒活性。在圖3中，在病毒感染后，峰移位到更高的PE-A (藻紅蛋白（PE)綴合的抗小鼠IgG)。從2mg/L或1 Omg/L的B3處理獲得的樣品的峰未移位，而 是與無病毒感染的對照樣品的峰幾乎重疊，表明B3處理有效地預防人原代外周血單核細胞 被DENV-2感染。在圖4中，在病毒感染后，峰移位到略高的PE-A。從2mg/L或10mg/L的B3處理 獲得的樣品的峰未移位，而是與無病毒感染的對照樣品的峰幾乎重疊，表明B3處理有效地 預防巨噬細胞被DENV-2感染。這些結果顯示B3有效地預防了細胞被DENV-2感染。PBMC和巨 噬細胞兩者均表達介導DENV-2感染的甘露糖受體。經改性的PEI聚合物的甘露糖基團與 DENV-2競爭結合甘露糖受體，由此抑制病毒感染。
[0339]廣譜抗病毒活性
[0340] 針對廣譜病毒(包括登革熱病毒的其它血清型(DENV-UDENV-3和DENV-4)、HSV-1、 HSV-2、CHIKV、SARS Co-V和EV 71)進一步評估甘露糖改性的BPEI25聚合物B2和B3的抗病毒 活性。結果列于表5中。
[0341] 表5.

[0344] aEC50是所述聚合物保護50%細胞免受病毒感染的有效濃度。低EC50值是期望的。
[0345] bCC50是殺死50%的細胞的細胞毒性聚合物濃度。高0：50值是期望的。
[0346] 。選擇性被定義為CC50/EC50。高選擇性是期望的。
[0347] B3對 DENV-1、DENV-2 和 DENV-4 具有活性，分別具有0 ? 20mg/L、0 ? 32mg/L和0 ? 31mg/L 的EC50值。B3對DENV-3具有低活性，具有479mg/L的EC50值。然而，具有較少甘露糖取代和較 高電荷的B2對DENV-3具有活性，具有0.80mg/L的EC50。值得注意地，B3有效地抑制DNA病毒 HSV-1和HSV-2以及RNA病毒CHIKV、SARS Co-V和EV 71(無包膜的）對各自靶細胞的感染。B3 對流感感染無效，具有> l〇〇〇mg/L的EC50，而B2有效地預防流感病毒的感染，具有< 0.012mg/L的低EC50值。這些發現證實所述聚合物的廣譜抗病毒活性。重要地，在其中所述 聚合物預防100%細胞發生感染的濃度下沒有顯著的細胞毒性。
[0348] 對表達有T頂_ 1和T頂-3受體的細胞中的病毒感染的抑制
[0349] TIM受體通過與病毒包膜上的磷脂酰絲氨酸(PS)直接相互作用來促進病毒進入。 建立穩定表達TIM-1或TIM-3蛋白質的293T細胞，如Tahara-Hanaoka S等人〃Lentiviral vector-mediated transduction of murine CD34-hematopoietic stem cells"， Experimental Hematology，（2002)，30,第11-17頁）中所述生成慢病毒載體。用帶有期望的 0RF(開放讀碼框，即不含有終止密碼子的讀碼框)的假病毒轉染293T細胞。通過殺稻瘟菌素 (InvivoGen，Toulouse，France)選擇表達 TIM-1 或TIM-3 的細胞。293T 細胞由于整合了 TIM-1 或TIM-3表達基因而穩定表達TIM-1或TIM-3。
[0350] 用CHIKV以感染復數(M.O.I)O.l攻擊親本293T細胞（具有空載體）、表達TM-1和 TIM-3的293T細胞，同時添加B3(50mg/L)。感染后48小時收集上清液。通過噬斑測定來確定 病毒效價并且將其表示為三個重復的每ml的平均噬斑形成單位(pfu/mL)±SD。
[0351] HM-1和HM-3受體在293T細胞中的表達顯著增強了CHIK感染（圖5，條形圖，HM1-293T和HM3-293T相對于空載體-293T細胞）。圖6是顯示B3在預防空載體293T細胞（即，不表 達HM-1或TM-3受體）的CHIKV感染方面的作用的條形圖，其中EC50是2.6mg/L。圖7是顯示 B3在預防HM1-293T細胞中的CHIKV感染方面的作用的條形圖，其中EC50是2.9mg/L。圖8是 顯示B3在預防HM3-293T細胞中的CHIKV感染方面的作用的條形圖，其中EC50是2.7mg/L。對 于預防表達TM-1和TM-3的細胞中的CHIKV感染的選擇性(CC50/EC50)是高的（分別>345 和 >370)。
[0352] B3還有效地抑制天然表達TM-1受體的A549細胞的DENV-2感染（圖9,條形圖）。在 這種情況下，EC50是6.8mg/L，CC50 > lOOOmg/L，且選擇性指數> 147，如通過噬斑減少測定 所測量的。這些發現表明所述聚合物能夠抑制磷脂酰絲氨酸(PS)/TIM受體結合，這可能通 過聚合物與TM-1/TIM-3受體之間的氫鍵合相互作用（參見下文的圖34-37)和/或所述聚 合物上的陽離子電荷與PS上的負電荷之間的靜電相互作用，因此預防具有HM-1或HM-3受 體表達的細胞的病毒感染。
[0353] 抗病毒機理
[0354] 病毒進入的抑制
[0355] 病毒粒子通過其表面蛋白質與細胞膜上的受體(包括蛋白質、甘露糖受體(也被免 疫細胞靶向）、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(被DENV、HSV、EV 71、SARS-CoV靶向）和唾液酸(流感 病毒、EV 71))的特異性相互作用、之后進行胞吞內在化來感染細胞。病毒在細胞間傳播病 毒基因組和感染。為了研究所述聚合物是在病毒生命周期的早期還是晚期施加其抗病毒作 用，在熒光素酶_復制子轉染的A459細胞中研究所述大分子對僅編碼非結構病毒蛋白質的 DENV-2亞基因組復制子的復制的作用。
[0356]復制子熒光素酶測定.將含有DENV-2的熒光素酶-報告復制子的A549細胞(人男性 肺癌）以25x 104個細胞/孔的細胞密度播種于6孔板中。用50mg/L B3聚合物c、100mg/L NITD008或具有DMS0的培養基處理所述細胞。NITD008不溶于水，并且使用少量DMS0(二甲亞 砜）來促進其在細胞培養基中的溶解。在培育48小時后，使用海腎熒光素酶測定系統 (Pr 〇mega，MadiS〇n，WI)測量熒光素酶活性。通過蛋白質的量將結果歸一化。
[0357] 圖10是比較無B3(標記為DMS0)、有B3和有強效抗病毒的腺苷核苷類似物NITD008 (2尺，31?，41?，51〇-2-(4-氨基吡咯并[2,3-(1]嘧啶-7-基)-3-乙炔基-5-(羥甲基)氧雜環戊烷-3,4_二醇情況下，A459細胞的熒光素酶活性的條形圖。結果顯示，在抑制DENV-2亞基因組復 制子的復制方面，NITD008是有效的，而B3是無效的。該發現證實抗病毒聚合物在DENV-2生 命周期的晚期未發揮功能。
[0358] 為了檢查所述聚合物是阻斷LLC-MK2細胞中的初始附著步驟還是阻斷病毒進入過 程中的下游事件，在4°C將B3連同DENV-2-起添加到所述細胞中保持90分鐘。然后通過roS 洗滌(3次)去除未結合的聚合物分子，然后將所述細胞在37°C培育5天。在該添加時間(-1.5 小時），B3聚合物完全抑制DENV-2感染。對其它添加時間進行評估。圖11是顯示B3(和肝素） 的添加時間對LLC-MK2細胞中的DENV-2的抑制的作用的一組圖表。頂部圖表顯示B3和肝素 的添加時間。底部圖表描繪了每個添加時間獲得的抑制％。僅在時間-1.5小時將病毒和聚 合物B3(或肝素)一起添加到細胞中。在所有其它時間，起初在4°C在沒有聚合物B3或肝素的 情況下培育病毒和細胞，之后升溫到37°C，之后在所示時間添加B3或肝素。結果顯示，當在 將所述細胞和病毒在4°C培育90分鐘并且升溫到37°C之后立即將所述聚合物添加到所述細 胞中時(對應于時間=0小時），病毒感染被有效地預防。然而，當在將所述細胞和DENV-2在 37°C培育1小時之后將所述聚合物添加到所述細胞中時，抑制被顯著降低。當在所述細胞在 37°C被所述病毒感染2-5小時之后引入所述聚合物時未觀察到明顯抑制。這些結果證實，當 在病毒附著步驟期間或附著步驟后的早期添加時，所述聚合物在預防病毒感染方面是有效 的，從而確認了DENV進入/膜融合處的作用點。
[0359] 為了進一步理解抗病毒機理，將DENV-2與50mg/L B3在4°C培育1小時以實現結合， 然后進行噬斑測定以測量病毒效價。病毒與所述聚合物結合將病毒效價降低了超過40%， 表明所述聚合物結合了所述病毒，并且預防了感染(圖12,條形圖）。在細胞培養基(pH 7.4) 中，大部分伯胺和仲胺被質子化，使得所述聚合物高度帶電。
[0360] 除了特異性的病毒蛋白質/聚合物相互作用之外，所述聚合物的陽離子電荷還可 通過靜電相互作用與病毒的包膜上的陰離子電荷相互作用。這可掩蔽所述病毒，從而預防 所述細胞發生病毒感染。
[0361] 另一方面，當將聚合物B3連同所述病毒一起添加到所述細胞中時，在50mg/L的聚 合物B3產生了對病毒感染的完全抑制。在相同濃度下的聚合物結合后，病毒效價的不完全 抑制暗示存在促成病毒感染的抑制的其它因素，如所述聚合物與細胞膜上的陰離子型組分 (陰離子型硫酸肝素蛋白聚糖)之間的結合和胞內體pH的中和。盡管所有伯胺基均被甘露糖 基取代，但B3在pH 7.4下帶有陽離子電荷，因為大部分仲胺基(pKa: 8.6)和約50%的叔胺 (pKa:7.5)可被質子化。實際上，使用50mg/L B3預處理細胞2小時或甚至15分鐘有效地預防 DENV-2感染（圖13,條形圖）。當在添加所述病毒之前將所述細胞與B3預培育1小時時，B3針 對DENV-2感染的EC50值是6.0mg/L。該值高于當將所述聚合物、細胞和病毒同時培育時 (EC50:0.30mg/L，表4)。對Vero細胞和RD細胞的預處理對CHIKV、HSV-1和EV 71也是高度有 效的，EC50值分別為23.5mg/L、1.8mg/L和0.80mg/L。這些發現表明B3結合到細胞膜上是阻 斷病毒進入的重要因素。
[0362] 另外，PEI聚合物的未質子化的仲胺和叔胺能夠在胞內體環境(pH 5.0-6.5)中被 質子化，由此中和胞內體pH。已知對胞內體pH的中和抑制pH依賴性病毒感染，如DENV、 CHIKV、流感病毒、HSV和EV 71。為了證明所述聚合物能夠抑制低pH誘導的病毒-細胞膜融 合，對低pH誘導的病毒感染的細胞融合的預防進行了研究。病毒感染的細胞融合被報道歸 因于感染后細胞表面上表達的成融病毒蛋白質。在有B3(50mg/L)和無B3(50mg/L)的情況下 將C6/36白紋伊蚊細胞與DENV-2在4°C培育90分鐘，之后在28°C培育2天以允許感染并且在 用MES(2-(N-嗎啉代）乙磺酸）酸化到pH 5.0后再培育2天。圖14是顯示B3和肝素對C6/36細 胞的被病毒感染的細胞融合的作用的一組顯微照片和相應的程序圖解。在4°C(標記為〃4°C +〃的圖像)或在28°C(標記為〃4°C_〃的圖像)添加抗病毒劑。標記為〃培養基〃的樣品僅含有 細胞和病毒(無抗病毒劑）。標記為"模擬"的樣品僅含有細胞(無病毒或抗病毒劑）。在含有 B3的樣品中未發現融合細胞。不同于無任何處理的對照組，在含有B3的樣品中未發現融合 細胞。甚至當在病毒感染點（即，在28°C培育)添加所述聚合物時，所述聚合物也抑制合胞體 形成，表明所述聚合物確實上能夠預防低pH誘導的病毒-細胞膜融合和病毒感染。
[0363]總之，通常對于DENV的處理來說，具有較高水平的甘露糖的陽離子型聚合物具有 較低的中和胞內體pH的能力和較低的陽離子電荷，這降低了抗病毒活性。不受限于理論，聚 合物-病毒結合、聚合物-細胞膜相互作用和對胞內體pH的中和一起作用可解釋對病毒感染 的預防。
[0364] 對藥物抗性的預防.
[0365] 盡管存在可用于一些病毒感染如流感的抗病毒藥物，但病毒能夠通過突變產生藥 物抗性。例如，自2003年以來，在流行的流感株中頻繁地發現了金剛烷抗性(例如，對M2蛋白 質抑制劑的抗性）。對抗金剛烷的流感病毒有效并且被美國疾病控制中心（C e n t e r f 〇 r Disease Control，USA) (Q)C)推薦用于治療和預防流感感染的奧塞米韋（Oseltamivir)和 扎那米韋（zanamivir)(神經氨酸酶抑制劑)也被發現在少量流感病毒中的有效性降低。抗 性與M2或神經氨酸酶蛋白質中的單個氨基酸變化相關。為了研究由所述聚合物通過多種機 理介導的抗病毒活性是否充分地預防藥物抗性的產生，將暴露于亞致死劑量的B3(0.31mg/ L)的DENV-2傳代并且用于確定最多5次傳代的EC50值。EC50值保持類似(0.31-0.35mg/L)。 另外，在第5次傳代后，用100mg/L的聚合物處理病毒，這完全抑制了DENV-2感染。這些結果 表明用B3重復處理并未介導DENV-2的抗性。
[0366] 體內毒性
[0367] 為了證實陽離子型聚胺用于體內應用的潛力，對B2和B3的體內毒性水平進行研 究。B2和B3的通過靜脈內注射的LD50值(在兩周時期內殺死一半小鼠的致死劑量)分別被確 定為313mg/kg和463mg/kg，表明陽離子型聚胺具有低毒性。
[0368]為了評估B3對主要器官(肝臟和腎臟)和血液的急性毒性，測量了在取自靜脈內注 射后48小時的B3-處理小鼠的血液樣品中的丙氨酸轉氨酶(ALT)、天冬氨酸轉氨酶(AST)、總 膽紅素(TBIL)、肌酸酐、脲氮、鈉離子和鉀離子水平。表6列出了結果。所述數據表示為基于 從10只小鼠（ri = l〇)獲得的值的平均值+標準偏差。使用學生氏（Student's)t-檢驗進行統 計學分析。概率P<〇.05的差異被認為是統計學顯著的。使用以下縮寫:ALT =丙氨酸轉氨 酶;AST =天冬氨酸轉氨酶;TBIL =總膽紅素;單位=國際單位。
[0369]表6.
[0371 ]在對照組與接受遠高于B3的有效濃度（劑量：60mg/kg ;在血液中的估計濃度： 1200mg/L，假定小鼠的血液體積是約lmL)的濃度的B3的靜脈內注射的組之間在任何測量參 數中沒有顯著差異，表明所述聚合物處理既不導致任何急性肝臟損傷或腎臟損傷，也不干 擾血液中的電解質平衡。另外，甚至在注射后14天，肝臟和腎臟的功能、鉀離子和鈉離子的 濃度相比于對照仍然保持不變。此外，聚合物處理未誘導血清或尿液樣品中的任何異常的 顏色變化，或未導致小鼠的死亡。這些結果證明聚合物處理在測試時期期間對小鼠無毒。
[0372] 經改性的PEI和未經改性的PEI與病毒蛋白質的盲對接(blind docking)研究
[0373] 盲對接研究提供了對聚合物與病毒蛋白質之間的結合相互作用的了解。
[0374] 從蛋白質數據庫檢索DENV-2E糖蛋白的晶體結構(PDB ID: 10KE)。所述晶體結構詳 細呈現了呈二聚體預融合構象的E蛋白質。還從PDB檢索了DENV-3 (PDB ID: 1UZG)、HSV-1 (PDB ID:1JMA)、HSV-2(PDB ID:4MYW)、流感病毒（PDB ID:4KVN)和HM1(PDB ID:20R8)的晶 體結構。從國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information) (NCBI，USA)下載CHIKV(ID:ACT35081.1)和EV 71(ID:ACS12925)的氨基酸序列并且使用I-Tasser在線服務器對所述蛋白質結構建模。使用Marvin Sketch軟件構建支鏈PEI的模型大 分子的二維結構（圖15)并且使用OpenBabel軟件將其轉化為三維結構。用于對接研究中的 模型支鏈PEI以及模型陽離子型聚胺B3和B2并非意在表示上述實施例的支鏈PEI和B3材料 的完整結構。模型B3材料具有3個甘露糖基團，而模型B2材料具有2個甘露糖基團。MVD (Molegro Virtual Docker)用于識別B3和未經改性的支鏈PEI在病毒蛋白質中的潛在結合 位點以進行分子對接分析。空腔檢測算法用于檢測空腔以縮小結合位點。通過MVD準備蛋白 質和配體(模型支鏈PEI或模型陽離子型聚胺B3的1單位大分子）的結構。如果缺失的話，則 指派鍵、氫和鍵序。指派配體中的電荷和柔性扭轉。基于網格的MolDock評分函數用于定義 能量項以對潛在結合位點分級。30人半徑的網格被用作蛋白質上的搜索空間。選擇群體大 小為100的MolDock單形進化算法。進行單形最小化程序并且將能量閾值設定為100用于位 姿生成（pose generation)。
[0375] 通過柔性配體對接研究分析蛋白質-聚合物相互作用。當配體以最小能量結合到 蛋白質的特定結合位點時，所述配體與所述蛋白質之間的相互作用被定義為特異性的，而 當所述配體以相同范圍的能量結合到所述蛋白質的不同位點時，相互作用被定義為非特異 性的。從柔性對接獲得每個網格中的5種結合位姿，并且通過對所述位姿的Moldock評分和 再分級評分進行分級，認為具有最小評分的位姿是最好的對接位姿。預測最好的位姿存在 于通過MVD軟件檢測到的5個空腔中的一個中。
[0376] DENV-2E蛋白質（包膜蛋白質）具有5個空腔。利用4個網格進行DENV-2E蛋白質的 MVD對接研究。圖16是DENV-2E蛋白質的MVD三維計算機繪圖，其中突顯的斑點區域表示4個 網格中以相等結合能量結合的模型支鏈PEI的4種位姿。氫鍵是估計的。
[0377] 預測模型陽離子型聚胺B3與DENV-2E蛋白質的特異性結合位點在E蛋白質二聚體 的結構域II和結構域III的界面處并且靠近E蛋白質單體的融合環。圖17是顯示DENV-2E蛋 白質（包膜蛋白質）的與模型陽離子型聚胺B3結構形成氫鍵的8個氨基酸基團的計算機繪 圖：Thr 70、Thr 115、Asp 154、Gln 248、Gly 266、Ala 267、Thr 268和Leu 277。圖 18是模型 陽離子型聚胺B3與DENV-2E蛋白質的最有利結合的三維計算機繪圖。結合位點還位于襯于 疏水空腔中的柔性'kl'環上方的空穴(pocket)中，所述空穴被先前研究稱為B0G結合空穴。
[0378]圖19是顯示EV 71VP1蛋白質的與模型陽離子型聚胺B3形成氫鍵的7個氨基酸基團 的使用MVD軟件的計算機繪圖：Gin 269、Arg 267、Glu 124、Asn 228、Ser 275、Ala 224和 Gly 223〇
[0379]圖20是顯示模型陽離子型聚胺B3與EV 71VP1蛋白質的最有利結合的使用MVD軟件 的三維計算機繪圖。
[0380]圖21是顯示HSV-1⑶蛋白質的與模型陽離子型聚胺B3形成氫鍵的7個氨基酸基團 的使用MVD軟件的計算機繪圖：Asp 13、Asn 15、Arg 18、Leu 22、Val 24、Gln 27、Ser 8〇
[0381] 圖22是顯示模型陽離子型聚胺B3與HSV-1⑶蛋白質的最有利結合相互作用的使用 MVD軟件的三維計算機繪圖。
[0382] 圖23是顯示DENV-3E蛋白質的與模型陽離子型聚胺B3形成氫鍵的7個氨基酸殘基 的使用MVD軟件的計算機繪圖：Thr 155(B)、Lys 47(B)、Thr 274(B)、Ser 271(B)、Asn 8(B) 和Asp 98(A)、His 27(B)。
[0383] DENV-3E蛋白質具有通過MVD軟件檢測到的5個空腔。圖24是DENV-3E蛋白質中的5 個空腔的使用MVD軟件的三維計算機繪圖。
[0384] 圖25是顯示模型陽離子型聚胺B3與DENV-3E蛋白質的最有利結合相互作用的使用 MVD軟件的三維計算機繪圖。
[0385] 圖26是顯示CHIKV E1蛋白質的通過氫鍵合與模型陽離子型聚胺B3相互作用的7個 氨基酸殘基的使用MVD軟件的計算機繪圖：Gin 373、Gln 368、Thr 17、Gly 12、Glu 32、Thr 338和His 394。
[0386] 圖27是模型陽離子型聚胺B3與CHIKV El蛋白質的最有利結合相互作用的使用MVD 軟件的三維計算機繪圖。
[0387] 圖28是顯示流感病毒HA蛋白質的與模型陽離子型聚胺B3形成氫鍵的4個氨基酸殘 基的使用MVD軟件的計算機繪圖：Arg 285、Ser 282、Ser 130和Phe 415。
[0388]圖29是HA蛋白質中的4個空腔的使用MVD軟件的三維計算機繪圖。
[0389]圖30是顯示模型陽離子型聚胺B3與HA蛋白質的最有利結合的使用MVD軟件的三維 計算機繪圖。
[0390]圖31是顯示HSV-2⑶蛋白質的與模型陽離子型聚胺B3形成氫鍵的9個氨基酸殘基 的使用MVD軟件的計算機繪圖：Asp 139、Arg 222、Ser 140、Asp 26、Asn 227、Thr 230、Lys 237、Val 24和Gin 27。
[0391]圖32是⑶蛋白質中的4個空腔的使用MVD軟件的三維計算機繪圖。
[0392]圖33是顯示模型陽離子型聚胺B3與⑶蛋白質的最有利結合相互作用的使用MVD軟 件的三維計算機繪圖。
[0393]圖34是顯示TM-1蛋白質的與模型陽離子型聚胺B3形成氫鍵的8個氨基酸殘基的 使用MVD軟件的計算機繪圖：Lys 102(B)、Ser 3(B)、Thr 20(A)、Thr 20(B)、Ser 22(A)、Gln 101(A)、Asp 100(A)和Glu 6(B)。
[0394]圖35是顯示模型陽離子型聚胺B3與TIM-1蛋白質的最有利結合相互作用的使用 MVD軟件的三維計算機繪圖。
[0395]圖36是顯示TM-3蛋白質的與模型陽離子型聚胺B3形成氫鍵的5個氨基酸殘基的 使用MVD軟件的計算機繪圖:Glu 106(A)、Cys 39(A)、Lys 103(A)、Ser 20(A)和Tyr 7(A)。
[0396] 圖37是顯示模型陽離子型聚胺B3與TM-3的最有利結合的使用MVD軟件的三維計 算機繪圖。
[0397] 圖38是顯示DENV-3E蛋白質的與模型陽離子型聚胺B3結構形成氫鍵的3個氨基酸 殘基的使用MVD軟件的計算機繪圖:Glu 13(A)、Ala 35(A)和Phe 335(A)。
[0398] 圖39是顯示模型陽離子型聚胺B3與DENV-3E蛋白質的最有利結合相互作用的使用 MVD軟件的三維計算機繪圖。
[0399]圖40是顯示流感HA蛋白質的與模型陽離子型聚胺B2形成氫鍵的5個氨基酸殘基的 使用MVD軟件的計算機繪圖：Arg 285、Glu 430、Ser 282、Ile 283和Asp 287。
[0400] 圖41是顯示模型陽離子型聚胺B2與流感HA蛋白質的最有利結合的使用MVD軟件的 三維計算機繪圖。
[0401] 另外，對接結果顯示未經改性的PEI-病毒蛋白質相互作用是非特異性的。
[0402]表7匯總了使用MVD軟件獲得的模型陽離子型聚胺B3與多種病毒蛋白質的Moldock 評分、再分級評分和形成氫鍵相互作用氨基酸的計算數量。
[0403]表7.
[0405] 表8匯總了使用MVD軟件獲得的模型陽離子型聚胺B2與DENV-3E蛋白質和流感HA蛋 白質的Moldock評分、再分級評分和形成氫鍵相互作用氨基酸的計算數量。
[0406]表8.
[0408] 結論
[0409] 在與甘露糖官能化的環狀碳酸酯單體的快速且易行的親核加成反應中對直鏈PEI 和支鏈PEI進行改性。所得到的陽離子型聚胺展示了強抗病毒活性、可忽略的毒性和對病毒 粒子優于對哺乳動物細胞的高選擇性。上述數據顯示抗病毒活性隨著經改性的BPEI25的甘 露糖含量的增加而降低(EC50增加）（表5，B1-B6)。抵消EC50的該趨勢的是更快速降低的細 胞毒性(增加的CC50)，導致選擇性(增加的CC50)隨著甘露糖含量的增加而增加(表5，B1-B6)。甘露糖殘基的并入降低了 PEI毒性并且允許靶向免疫細胞上的甘露糖受體。經甘露糖 改性的PE I特異性地結合到病毒表面蛋白質。經改性的聚合物具有廣譜抗病毒活性，對DNA 病毒感染、RNA病毒感染、包膜病毒感染和無包膜病毒感染有效，所述病毒感染包括DENV、 HSV-1、HSV-2、CHIKV、SARS Co-V和EV 71。陽離子型聚胺通過與病毒表面和細胞表面結合、 抑制病毒進入/膜融合和中和胞內體pH(減輕膜融合)來預防病毒感染。陽離子型聚胺還對 表達TM-1或HM-3的細胞的病毒感染有效。重要地，通過靶向病毒蛋白質和宿主-病毒相互 作用兩者，抗病毒聚合物可減輕藥物抗性。經甘露糖-氨基甲酸酯改性的PEI在其有效濃度 下具有廣譜抗病毒活性并且沒有體內毒性，從而產生用于預防和治療各種病毒感染的巨大 潛力。
[0410] 本文所用的術語僅僅為了描述特定實施方案的目的，而并非意在限制本發明。除 非上下文另有明確指示，否則如本文所用的單數形式〃a/an( -)〃和〃所述〃意在也包括復數 形式。應當進一步理解，術語"包括"和/或"包含"在用于本說明書中時，指定存在所述特征、 整數、步驟、操作、元件和/或部件，但并不排除存在或增加一個或多個其它特征、整數、步 驟、操作、元件、部件和/或它們的組。當使用范圍來表示使用兩個數值極限X和Y的可能值 (例如，X ppm到Y ppm的濃度)時，除非另有說明，否則所述值可以是X、Y或X到Y的任何數字。
[0411] 已經出于說明和描述的目的給出了對本發明的描述，但該描述并非意在窮舉或將 本發明限于所公開的形式。在不脫離本發明的精神和范圍的情況下，許多修改和改變對于 本領域技術人員將顯而易見。對實施方案加以選擇和描述以最好地解釋本發明的原理和它 們的實際應用，并且使得本領域其他技術人員能夠理解本發明。
【主權項】
1. 一種方法，其包括： 用陽離子型聚胺處理病毒，由此形成包含通過非共價相互作用結合到所述病毒的所述 陽離子型聚胺的經處理的病毒； 其中： i) 所述經處理的病毒相比于未經處理的病毒進入活的哺乳動物細胞中的能力和/或在 活的哺乳動物細胞內的復制的能力變弱， ii) 所述陽離子型聚胺包含： 多個式(1)的不帶電荷的N-酰化乙稀亞胺單元：其中每個f包含至少一個碳和至少一個醇羥基，和 多個式(3a)的帶正電荷的仲乙稀亞胺單元：其中氮的帶星號鍵連接到碳，且ΧΘ是通過非共價締合與帶正電荷的氮結的8個氨基酸 殘基的使用MVD軟件的計算機繪圖：Thr 268(A)、Gly 266(A)、Ala 267(A)、Thr 70(B)、Thr 115(B)、Gln 248(B)、Leu 277(A)和Asp 154(A)。模型陽離子型聚胺B3結構并非意在表示實 施例中制備的B3的完整結構。模型B3材料具有3個甘露糖基團。 圖18是模型陽離子型聚胺B3與DENV-2E蛋白質的有利結合相互作用的使用MVD軟件的 三維計算機繪圖。 圖19是顯示EV 71 VP1蛋白質的與模型陽離子型聚胺B3形成氫鍵的7個氨基酸基團的 使用MVD軟件的計算機繪圖：Gin 269、Arg 267、Glu 124、Asn 228、Ser 275、Ala 224和Gly 223〇 圖20是顯示模型陽離子型聚胺B3與EV 71 VP1蛋白質的有利結合相互作用的使用MVD 軟件的三維計算機繪圖。 圖21是顯示HSV-1 GD蛋白質的與模型陽離子型聚胺B3形成氫鍵的7個氨基酸基團的使 用MVD軟件的計算機繪圖：Asp 13、Asn 15、Arg 18、Leu 22、Val 24、Gln 27、Ser 8〇 圖22是顯示模型陽離子型聚胺B3與HSV-1⑶蛋白質的最有利結合相互作用的使用MVD 軟件的三維計算機繪圖。 圖23是顯示DENV-3 E蛋白質的與模型陽離子型聚胺B3形成氫鍵的7個氨基酸殘基的使 用MVD軟件的計算機繪圖：Thr 155(B)、Lys 47(B)、Thr 274(B)、Ser 271(B)、Asn 8(B)和 Asp 98(A)、His 27(B)。 合的帶負電荷的抗衡離子，并且 iii) 所述陽離子型聚胺包含以隨機分布排布且頭接尾共價連接的N-酰化乙烯亞胺單 元和仲乙稀亞胺單元，其中給定乙稀亞胺單元的氮1連接到不同乙稀亞胺單元的碳3。2. 根據權利要求1所述的方法，其中每個f包含單價單糖部分。3. 根據權利要求2所述的方法，其中所述單糖部分選自由葡萄糖基、半乳糖基和甘露糖 基組成的組。4. 根據權利要求2所述的方法，其中所述單糖部分選自由以下組成的組5. 根據權利要求1所述的方法，其中每個f包含兒茶酚基團。6. 根據權利要求1所述的方法，其中所述陽離子型聚胺的每個^(:(=0)1^是選自由以 下組成的組的獨立單價基團：7. 根據權利要求1所述的方法，其中所述陽離子型聚胺具有一個基本上由所述N-酰化 乙烯亞胺單元、所述仲乙烯亞胺單元和聚合物鏈端基組成的聚合物支鏈。8. 根據權利要求1所述的方法，其中所述陽離子型聚胺進一步包含具有以下結構的氧 化乙稀亞胺單元：9. 根據權利要求1所述的方法，其中所述病毒是登革熱病毒。10. 根據權利要求1所述的方法，其中所述陽離子型聚胺具有多個包含所述N-酰化乙烯 亞胺單元、所述仲乙稀亞胺單元和具有以下結構的叔乙稀亞胺單元的聚合物支鏈其中ΧΘ是通過非共價締合與帶正電荷的氮結合的帶負電荷的抗衡離子。11. 根據權利要求10所述的方法，其中所述陽離子型聚胺在如下過程中形成:所述過程 包括用包含f和/或f的受保護形式的酰化劑處理支鏈化聚乙烯亞胺。12. 根據權利要求11所述的方法，其中所述支鏈化聚乙稀亞胺具有大于1000的數均分 子量(Μη)。13. -種方法，其包括： 用陽離子型聚胺處理活的哺乳動物細胞，由此形成包含通過非共價相互作用結合的所 述陽離子型聚胺和所述細胞的經處理的細胞;其中： i) 所述經處理的細胞相比于未經處理的細胞對病毒進入所述經處理的細胞中和/或病 毒在所述經處理的細胞內復制具有更高抗性， ii) 所述陽離子型聚胺包含： 多個式(1)的不帶電荷的N-酰化乙稀亞胺單元：其中每個f包含至少一個碳和至少一個醇羥基，和 多個式(3a)的帶正電荷的仲乙稀亞胺單元：其中氮的帶星號鍵連接到碳，且是通過非共價締合與帶正電荷的氮結合的帶負電 荷的抗衡離子，并且 iii) 所述陽離子型聚胺包含以隨機分布排布且頭接尾共價連接的Ν-酰化乙烯亞胺單 元和仲乙稀亞胺單元，其中給定乙稀亞胺單元的氮1連接到不同乙稀亞胺單元的碳3。14. 根據權利要求13所述的方法，其中所述病毒選自由登革熱病毒、SARS冠狀病毒、基 孔肯雅病毒、腸道病毒、流感病毒、單純皰疹病毒和其組合組成的組。15. 根據權利要求13所述的方法，其中所述陽離子型聚胺通過干擾所述病毒的胞內體 釋放來抑制所述病毒進入所述哺乳動物細胞中。16. 根據權利要求13所述的方法，其中所述哺乳動物細胞選自由血細胞、肝細胞、鼻細 胞、肺細胞和子宮頸細胞組成的組。17. -種方法，其包括： 向被病毒感染的患者施用治療有效量的陽離子型聚胺，由此抑制和/或阻止所述病毒 的復制； 其中： i)所述陽離子型聚胺包含： 多個式(1)的不帶電荷的N-酰化乙稀亞胺單元：其中每個f包含至少一個碳和至少一個醇羥基，和 多個式(3a)的帶正電荷的仲乙稀亞胺單元：其中氮的帶星號鍵連接到碳，且χβ是通過非共價締合與帶正電荷的氮結合的帶負電 荷的抗衡離子，并且 ii)所述陽離子型聚胺包含以隨機分布排布且頭接尾共價連接的Ν-酰化乙烯亞胺單元 和仲乙稀亞胺單元，其中給定乙稀亞胺單元的氮1連接到不同乙稀亞胺單元的碳3。18. 根據權利要求17所述的方法，其中所述陽離子型聚胺作為含水混合物被施用。19. 根據權利要求18所述的方法，其中所述含水混合物通過注射被施用。20. 根據權利要求17所述的方法，其中所述陽離子型聚胺非共價結合到所述病毒，由此 阻礙所述病毒進入所述患者的細胞中。21. 根據權利要求17所述的方法，其中所述陽離子型聚胺非共價結合到所述患者的細 胞，由此阻礙所述病毒進入所述患者的所述細胞中。22. 根據權利要求17所述的方法，其中所述陽離子型聚胺在治療有效劑量下是非細胞 毒性的。
【文檔編號】C12N5/071GK105821005SQ201610055363
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年1月26日
【發明人】楊義燕, 楊川, J·L·海德里克, 市山浩二, 山本直樹
【申請人】新加坡科技研究局, 國際商業機器公司, 新加坡國立大學