一種鐵蛋白輕鏈單克隆抗體及其應用
【專利摘要】本發明涉及一種鐵蛋白輕鏈(Ferritin light chain)的單克隆抗體、分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞株以及所述的抗體的應用。所述單克隆抗體能夠用于檢測腫瘤的診斷、療效等。CGMCC No. 1204320160310
【專利說明】
一種鐵蛋白輕鏈單克隆抗體及其應用
技術領域
[0001 ] 本發明涉及一種鐵蛋白輕鏈(Ferritin light chain)的單克隆抗體、分泌該單克 隆抗體的雜交瘤細胞株以及所述的抗體的應用。
【背景技術】
[0002] 鐵是細胞生存必需的微量元素之一，鐵缺乏導致人體的缺鐵性貧血、兒童發育遲 緩;但細胞內的鐵過多則可誘發自由基增多，進而造成脂質、蛋白質、碳水化合物及核酸等 生物大分子的損傷，最終導致細胞死亡。鐵蛋白對于保持細胞內的鐵平衡至關重要。
[0003] 鐵蛋白（Ferritin，Fer)為機體內一種貝士存鐵的可溶組織蛋白，是一種含24個亞單 位的球形糖蛋白，分子量約為450KD。每個亞單位由Fer輕鏈(Ferritin light chain，肝臟 型)和Fer重鏈(Fer heavy chain，心臟型)兩種亞基復合而成。Fer輕鏈和Fer重鏈的相對分 子質量分別為19KD和21KD。鐵分子以水合氧化鐵的無機形式儲存在Fer內部（lhFer的主要 作用是貯存和調節鐵，當體內鐵增加時，Fer可以將鐵攝入并貯存，這就避免了細胞內高濃 度游離鐵對細胞的毒性作用，當體內需鐵量增加時，Fer可隨時釋放鐵，供機體需要。Fer水 平降低是缺鐵性貧血的表現，水平升高則反映了包括惡性腫瘤、炎癥、肝臟疾病和反復輸血 等諸多因素的影響。近年來研究發現，腫瘤組織可以合成和分泌Fer，F er水平升高可見于肝 癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、白血病等多種惡性腫瘤中（2)。
[0004] 鐵參與腫瘤細胞增殖，鐵與過氧化物反應引起DNA的氧化損傷從而引發腫瘤。體內 鐵存儲量高與癌癥的發生危險呈負相關。Fer水平是反映體內鐵存儲的指標，大多數惡性腫 瘤，特別是有淋巴結、肝臟等轉移時，Fer水平顯著增加。鐵蛋白輕鏈（Ferritin light chain，FTL)是組成細胞內鐵蛋白復合體的重要亞基之一，可加速鐵從亞鐵氧化酶中心向鐵 核內的轉移，提高鐵蛋白結合鐵的能力，對長期儲存鐵非常重要。它大部分位于細胞質中， 極少量位于細胞外如血清和腦脊液中（3)。研究表明當細胞內氧化應激增高時，鐵蛋白輕鏈 能夠與腫瘤抑制基因P53發生相互作用，進而誘導p53的表達（4)。腫瘤壞死因子aUumor necrosis factorya，TNF-a)能夠誘導細胞內FTL蛋白降解，說明FTL參與調節細胞內應激信 號通路(5)。
[0005] Fer作為腫瘤標志物之一，聯合其他腫瘤標志物檢測，可提高診斷的準確度，為腫 瘤的診斷、療效、預防以及是否轉移和多發的判斷指標。
【發明內容】
[0006] 為了克服以上問題，本發明提供了一種雜交瘤細胞系，其特征在于，所述雜交瘤細 胞系的保藏號為CGMCC No.12043。
[0007] 另一方面提供了一種由前述的雜交瘤細胞系分泌的鐵蛋白輕鏈的單克隆抗體，其 特征在于，其能夠特異地結合鐵蛋白輕鏈，優選地，所述單克隆抗體的亞型為IgG2b。
[0008] 另一方面提供了前述的雜交瘤細胞及前述的單克隆抗體在檢測靶結構鐵蛋白輕 鏈中的應用。
[0009] 另一方面提供了前述的雜交瘤細胞和/或前述的單克隆抗體的試劑盒。
[0010] 另一方面提供了前述的雜交瘤細胞及前述的單克隆抗體在檢測癌細胞的試劑盒 中的應用，所述癌細胞優選為肝癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、白血病。
[0011] 另一方面提供了前述的雜交瘤細胞及前述的單克隆抗體在用于腫瘤的診斷、療 效、預防的試劑盒中的應用。
[0012] 本發明還提供了前述雜交瘤和單克隆抗體的制備方法：
[0013] 1 ?抗原制備
[0014] (1)獲得目的基因
[0015] 從北京義翹神州生物技術有限公購買鐵蛋白輕鏈基因的cDNA模板，貨號： HG16460-G，并以cDNA為模板PCR擴增Ferritin light chain基因。
[0016] (2)構建重組表達載體
[0017]將步驟（1)獲得的PCR產物雙酶切后回收，在T4DNA連接酶作用下連接入表達載體 pET41a，構建重組質粒pET41a-Ferr it in light chain。載體經過酶切和測序鑒定后用于轉 化表達細菌。
[0018] (3)獲得含重組表達質粒的表達菌種
[0019]將步驟(2)獲得的重組質粒轉化大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態細胞，用含有硫酸 卡那霉素的LB固體培養基篩選，挑取單克隆用于抗原表達。
[0020] (4)誘導表達和純化
[0021]將含有表達質粒的R〇setta(DE3)細菌單克隆接種于10ml含有硫酸卡那霉素的LB 液體培養基中，37度，220rpm培養10hr。將菌液按1:100稀釋倍數接種于200ml新鮮的LB培養 基，培養至0D值為0.6，加入0.1 mM IPTG誘導表達，20度5hr，收集菌液超聲破碎，從上清中純 化重組抗原Ferritin light chain。
[0022] 2.單克隆抗體的制備和純化 [0023] (1)免疫動物
[0024] 一般使用6-8周齡雌性BALB/c小鼠，按照預先制定的免疫方法進行三次免疫注射。 [0025] 第一次免疫用2ML注射器每只小鼠腹股溝皮下注射0.2ml乳化液（100ul純化的重 組蛋白Ferritin light chain(用1XPBS稀釋)+100ul弗氏完全佐劑，含100ug抗原）。
[0026] 第二次免疫間隔兩周，用2ML注射器每只小鼠腹腔注射0.2ml乳化液（100ul純化的 重組蛋白Ferritin light chain(用1 XPBS稀釋)+100ul弗氏不完全佐劑，含100ug抗原）。 [0027]第三次免疫間隔兩周，用2ML注射器每只小鼠腹股溝皮下注射注射0.2ml乳化液 (100ul純化的重組蛋白Ferritin light chain(用1 XPBS稀釋)+100ul弗氏不完全佐劑，含 l〇〇ug抗原）。
[0028]測效價根據融合時間安排，第三次免疫7-10天后取血檢測，用常規的western法檢 測效價，選擇效價達到1:1000的小鼠用于融合。
[0029]加強免疫融合前3天，向待取脾小鼠進行加強免疫，小鼠腹腔注射200ul液體（含 60ug抗原，溶劑為1 X PBS，pH7 ? 4)。
[0030] (2)細胞融合
[0031] 采用眼球摘除放血法處死小鼠，無菌操作取出脾臟，放入帶200目不銹鋼網的平皿 中研磨，制備細胞懸液。將準備好的同系骨髓瘤細胞SP2/0與小鼠脾細胞按一定比例混合 (1:5-1:10)，并加入促融合劑聚乙二醇（50% )。采用HAT選擇培養基，進行雜交瘤細胞的選 擇性培養和篩選。
[0032]用ELISA方法檢測雜交瘤細胞培養上清:將抗原用包被液(pH 9.6、0.05M碳酸鹽緩 沖液)稀釋為8ug/ml加入96孔酶標板中，50ul/孔，放入4 °C冰柜中包被過夜。棄去包被液，用 PBST (磷酸鹽緩沖液，pH7.4)洗板三次，加入封閉液3 % BSA-roST (加入3 %牛血清白蛋白的 磷酸鹽緩沖液），l〇〇ul/孔，37 °C孵育1小時。棄去封閉液，PBST(磷酸鹽緩沖液，pH7.4)洗板 一次，甩干板子。將雜交瘤細胞培養上清加入酶標板lOOul/well，同時加入PBST(磷酸鹽緩 沖液)作為陰性對照。37°C孵育1小時。棄上清，用洗板機PBST洗板三次，加入稀釋好的anti-mouse IgG/HRP，100ul/well，37°C孵育1小時。棄上清，用洗板機PBST洗板三次，加底物 TMB100ul/well，RT，避光37°C，10_15min后加入50ul終止液（2mol/L硫酸）。使用酶標儀測 定，酶標儀設置為:450nm比色。和陰性對照相比，如果是0D值2.5倍之上就是陽性。最后篩選 得到一株效價最好的抗Ferritin light chain的雜交瘤細胞株，命名為1A2,亞型鑒定為 IgG2b。
[0033]將篩選出的陽性雜交瘤細胞株1A2進行單克隆篩選(有限稀釋法），獲得能產生高 效價（間接ELISA稀釋比>1:5，000)單克隆抗體的雜交瘤細胞克隆。將雜交瘤細胞株擴大培 養，并凍存保種。所述的陽性雜交瘤細胞為抗人Ferritin light chain雜交瘤細胞系1A2， 該細胞系已保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.12043。
[0034] (3)單克隆抗體的制備與純化
[0035]將步驟(2)獲得的細胞株1A2接種至BALB/c小鼠腹腔，制備腹水，然后從腹水中純 化抗體(所獲抗體命名為anti-Ferritin light chain)。
[0036] 抗Ferritin light chain單克隆抗體的純化:使用Protein G親和純化法。將用PB 溶液平衡好的Protein G填料裝入純化柱中，加入經PB溶液稀釋的單克隆抗體anti-Ferritin light chain的腹水過柱。上樣結束后，用PB溶液洗柱子至流穿液0D值〈0.01。然 后用0.1M pH3.0的甘氨酸-鹽酸溶液洗脫，收集整個洗脫峰的溶液。洗脫液經過透析濃縮并 更換為?83溶液。505^^6￡結果顯示，純化后抗體純度在95%以上(參見圖1)。
[0037]本發明的小鼠雜交瘤細胞株，其保藏編號為CGMCC No. 12043,保藏單位為中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址是北京市朝陽區北辰西路1號院3 號中國科學院微生物研究所;保藏日期為2016年3月10日。
【附圖說明】
[0038] 圖l、Ferritin light chain抗體十二烷基硫酸鈉聚丙稀酰胺凝膠電泳法（SDS-PAGE)檢測。
[0039]圖2、Ferritin light chain抗體的酶聯免疫吸附試驗（間接法）。
[0040] 圖3、Ferritin light chain抗體的酶聯免疫吸附試驗(夾心法）。
[0041 ] 圖4、Ferritin light chain抗體夾心ELISA檢測人血清中鐵蛋白。
【具體實施方式】
[0042]下述實施例中所用方法如無特別說明均為常施方法。
[0043] 試劑、酶、載體及細胞株：
[0044] (1)細胞株:HeLa (ATCC? CCL-2?)、大腸桿菌Rosetta (DE3) (Novagen)、骨髓瘤細 胞 SP2/0( ATCC?CRL-1581?)
[0045] (2)實驗動物:雌性BALB/c小鼠（湖南斯萊克景達實驗動物有限公司）；
[0046] (3)載體：pET41a(Novagen)
[0047] (4)酶及抗體試劑:構建載體過程和PCR過程的各種酶購自Fermentas，ELISA實驗 所用抗體anti-mouse IgG/HRP(Jackson ImmunoResearch)，ELISA底物TMB(Sigma)、逆轉錄 試劑盒(Fermentas)，BSA購自（北京元亨金馬生物科技有限公司）
[0048] (5)其他試劑如無特別說明為國產分析純。
[0049] 實施例1:雜交瘤細胞株1A2及其產生的單克隆抗體的獲得
[0050] 1.抗原制備
[0051] (1)獲得目的基因
[0052]從北京義翹神州生物技術有限公購買鐵蛋白輕鏈基因的cDNA模板，貨號： HG16460-G，并以cDNA為模板PCR擴增Ferritin light chain基因。
[0053] (2)構建重組表達載體
[0054]將步驟（1)獲得的PCR產物雙酶切后回收，在T4DNA連接酶作用下連接入表達載體 pET41a，構建重組質粒pET41a-Ferr it in light chain。載體經過酶切和測序鑒定后用于轉 化表達細菌。
[0055] (3)獲得含重組表達質粒的表達菌種
[0056]將步驟(2)獲得的重組質粒轉化大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態細胞，用含有硫酸 卡那霉素的LB固體培養基篩選，挑取單克隆用于抗原表達。
[0057] (4)誘導表達和純化
[0058]將含有表達質粒的Rosetta(DE3)細菌單克隆接種于10ml含有硫酸卡那霉素的LB 液體培養基中，37度，220rpm培養10hr。將菌液按1:100稀釋倍數接種于200ml新鮮的LB培養 基，培養至0D值為0.6，加入0.1 mM IPTG誘導表達，20度5hr，收集菌液超聲破碎，從上清中純 化重組抗原Ferritin light chain。
[0059] 2.單克隆抗體的制備和純化
[0060] (1)免疫動物
[0061] 一般使用6-8周齡雌性BALB/c小鼠，按照預先制定的免疫方法進行三次免疫注射。 [0062] 第一次免疫用2ML注射器每只小鼠腹股溝皮下注射0.2ml乳化液（100ul純化的重 組蛋白Ferritin light chain(用1XPBS稀釋)+100ul弗氏完全佐劑，含100ug抗原）。
[0063] 第二次免疫間隔兩周，用2ML注射器每只小鼠腹腔注射0.2ml乳化液（100ul純化的 重組蛋白Ferritin light chain(用1 XPBS稀釋)+100ul弗氏不完全佐劑，含100ug抗原）。 [0064]第三次免疫間隔兩周，用2ML注射器每只小鼠腹股溝皮下注射注射0.2ml乳化液 (100ul純化的重組蛋白Ferritin light chain(用1 XPBS稀釋)+100ul弗氏不完全佐劑，含 l〇〇ug抗原）。
[0065]測效價根據融合時間安排，第三次免疫7-10天后取血檢測，用常規的western法檢 測效價，選擇效價達到1:1000的小鼠用于融合。
[0066]加強免疫融合前3天，向待取脾小鼠進行加強免疫，小鼠腹腔注射200ul液體（含 60ug抗原，溶劑為1 X PBS，pH7 ? 4)。
[0067] (2)細胞融合
[0068] 采用眼球摘除放血法處死小鼠，無菌操作取出脾臟，放入帶200目不銹鋼網的平皿 中研磨，制備細胞懸液。將準備好的同系骨髓瘤細胞SP2/0與小鼠脾細胞按一定比例混合 (1:5-1:10)，并加入促融合劑聚乙二醇（50% )。采用HAT選擇培養基，進行雜交瘤細胞的選 擇性培養和篩選。
[0069]用ELISA方法檢測雜交瘤細胞培養上清:將抗原用包被液(pH 9.6、0.05M碳酸鹽緩 沖液)稀釋為8ug/ml加入96孔酶標板中，50ul/孔，放入4 °C冰柜中包被過夜。棄去包被液，用 PBST (磷酸鹽緩沖液，pH7.4)洗板三次，加入封閉液3 % BSA-roST (加入3 %牛血清白蛋白的 磷酸鹽緩沖液），1 〇〇ul/孔，37°C孵育1小時。棄去封閉液，PBST(磷酸鹽緩沖液，pH7.4)洗板 一次，甩干板子。將雜交瘤細胞培養上清加入酶標板lOOul/well，同時加入PBST(磷酸鹽緩 沖液)作為陰性對照。37°C孵育1小時。棄上清，用洗板機PBST洗板三次，加入稀釋好的anti-mouse IgG/HRP，100ul/well，37°C孵育1小時。棄上清，用洗板機PBST洗板三次，加底物 TMB100ul/well，RT，避光37°C，10_15min后加入50ul終止液（2mol/L硫酸）。使用酶標儀測 定，酶標儀設置為:450nm比色。和陰性對照相比，如果是0D值2.5倍之上就是陽性。最后篩選 得到一株效價最好的抗Ferritin light chain的雜交瘤細胞株，命名為1A2,亞型鑒定為 IgG2b。
[0070]將篩選出的陽性雜交瘤細胞株1A2進行單克隆篩選(有限稀釋法），獲得能產生高 效價（間接ELISA稀釋比>1:5，000)單克隆抗體的雜交瘤細胞克隆。將雜交瘤細胞株擴大培 養，并凍存保種。所述的陽性雜交瘤細胞為抗人Ferritin light chain雜交瘤細胞系1A2， 該細胞系已保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.12043。
[0071] (3)單克隆抗體的制備與純化
[0072]將步驟(2)獲得的細胞株1A2接種至BALB/c小鼠腹腔，制備腹水，然后從腹水中純 化抗體(所獲抗體命名為anti-Ferritin light chain)。
[0073] 抗Ferritin light chain單克隆抗體的純化:使用Protein G親和純化法。將用PB 溶液平衡好的Protein G填料裝入純化柱中，加入經PB溶液稀釋的單克隆抗體anti-Ferritin light chain的腹水過柱。上樣結束后，用PB溶液洗柱子至流穿液0D值〈0.01。然 后用0.1M pH3.0的甘氨酸-鹽酸溶液洗脫，收集整個洗脫峰的溶液。洗脫液經過透析濃縮并 更換為?83溶液。505^^6￡結果顯示，純化后抗體純度在95%以上(參見圖1)。
[0074]實施例2:單克隆抗體鑒定及應用
[0075] 1 ?小鼠抗Ferritin light chain單克隆抗體(anti-Ferritin light chain)的間 接ELISA檢測鑒定
[0076]用ELISA方法檢測雜交瘤細胞培養上清:將抗原用包被液(pH 9.6、0.05M碳酸鹽緩 沖液)稀釋為lug/ml加入96孔酶標板中，100ul/孔，放入4°C冰箱中包被過夜。棄去包被液， 用TOST (磷酸鹽緩沖液，pH7.4)洗板三次，加入封閉液3 % BSA-PBST (加入3 %牛血清白蛋白 的磷酸鹽緩沖液），l〇〇ul/孔，37°C孵育1小時。棄去封閉液，PBST(磷酸鹽緩沖液，pH7.4)洗 板一次，甩干板子。將anti-Ferritin light chain按照不同的稀釋比稀釋后加入酶標板 lOOul/we 11，同時加入PBST(磷酸鹽緩沖液)作為陰性對照。37 °C孵育1小時。棄上清，用洗板 機PBST洗板三次，加入稀釋好的anti-mouse IgG/HRP，100ul/well，37°C孵育1小時。棄上 清，用洗板機PBST洗板三次，加底物了1?10〇111/?611，1^，避光37°(：，1〇-15111111后加入5〇111終 止液(2mol/L硫酸）。使用酶標儀測定，酶標儀設置為：450nm比色。
[0077]將不同抗體濃度下檢測的0D值繪制成抗體ELISA滴定曲線，如圖2所示，anti-Ferritin light chain的抗體效價可以達到0.17ng/ml〇
[0078] 2?小鼠抗Ferritin light chain單克隆抗體(anti-Ferritin light chain)的夾 心ELISA檢測鑒定
[0079] 將anti-Ferritin light chain抗體用包被液(pH 9.6、0.05M碳酸鹽緩沖液)稀釋 為lug/ml加入96孔酶標板中，100ul/孔，放入4°C冰箱中包被過夜。棄去包被液，用TOST(磷 酸鹽緩沖液，PH7.4)洗板三次，加入封閉液3 % BSA-PBST (加入3 %牛血清白蛋白的磷酸鹽緩 沖液），100ul/孔，37°C孵育1小時。棄去封閉液，PBST(磷酸鹽緩沖液，pH7.4)洗板一次，甩干 板子。將Ferritin light chain抗原按照不同的濃度加入酶標板100u 1 /we 11，濃度范圍從 0. l-100ng/ml，同時加入PBST(磷酸鹽緩沖液)作為陰性對照。37 °C孵育1小時。棄上清，用洗 板機TOST洗板三次，加入稀釋好的anti-Ferritin兔多抗，lOOul/wel 1，37°C孵育1小時。棄 上清，用洗板機PBST洗板三次，加入稀釋好的anti-rabbit IgG/HRP，100ul/Well，37°C孵育 1小時。棄上清，用洗板機PBST洗板三次，加底物TMBlOOul/wel 1，RT，避光37°C，10_15min后 加入50ul終止液(2mol/L硫酸）。使用酶標儀測定，酶標儀設置為:450nm比色。
[0080] 將不同的抗原濃度檢測的0D值繪制成濃度檢測曲線，如圖3所示，anti-Ferritin light chain抗體檢測鐵蛋白抗原的靈敏度可以達到0.5ng/ml。
[0081]隨機挑選2種正常人的血清，并稀釋成不同的濃度，采用上述的夾心ELISA方法檢 測人血清中的Ferritin蛋白。從圖4所示，anti-Ferritin light chain抗體能夠很好的識 別人血清中的Ferritin蛋白，并且將人血清樣品稀釋64倍后也能夠檢測到明顯的信號。表 明anti-Ferritin light chain抗體能夠應用于臨床檢測人血清中Ferritin蛋白含量。 [0082] 參考文獻
[0083] l.ffang ff,Knovich MA,Coffman LG.(2010)Serum ferritin:Past,Present and future[J].Biochim biophys Acta,1800(8):760-769
[0084] 2.Shpyleva SI,Tryndyak VP,Kovalchuk 0.(2011)Role of ferritin alterations in human breast cancer cells[J].Breast cancer res treat,126(1): 63-71
[0085] 3.Paolo Arosio,Rosaria Ingrassia,Patrizia Cavadini.(2009)A family of molecules for iron storage,antioxidation and more[J].Biochimica et Biophysica Acta,1790(7):589-599
[0086] 4.Lee JH,Jang H,Cho EJ,Youn HD.(2009)Ferritin binds and activates p53under oxidative stress[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,389(3):399-404
[0087] 5.Stefania Recalcati,Pietro Invernizzi,Paolo Arosio,et al.(2008)New functions for an iron storage protein:the role of ferritin in immunity and autoimmunity[J].Journal of Autoimmunity,30(1-2):84-89。
【主權項】
1. 一種分泌的鐵蛋白輕鏈的單克隆抗體的雜交瘤細胞系，其特征在于，所述雜交瘤細 胞系的保藏號為CGMCC No.12043。2. -種由權利要求1所述的雜交瘤細胞系分泌的鐵蛋白輕鏈的單克隆抗體，其特征在 于，其能夠特異地結合鐵蛋白輕鏈，優選地，所述單克隆抗體的亞型為IgG2b。3. 權利要求1所述的雜交瘤細胞及權利要求2所述的單克隆抗體在檢測靶結構鐵蛋白 輕鏈的應用。4. 一種包含權利要求1所述的雜交瘤細胞和/或權利要求2所述的單克隆抗體的試劑 盒。5. 權利要求1所述的雜交瘤細胞及權利要求2所述的單克隆抗體在檢測癌細胞的試劑 盒中的應用，所述癌細胞優選為肝癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、白血病。6. 權利要求1所述的雜交瘤細胞及權利要求2所述的單克隆抗體在用于腫瘤的診斷、療 效、預防的試劑盒中的應用。
【文檔編號】G01N33/574GK105821004SQ201610257559
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年4月22日
【發明人】聶子梅, 邱俊康, 張泰川, 蔣洪嬌
【申請人】成都正能生物技術有限責任公司