配合淋巴細胞培養基快速誘導大量dc-cik、nk細胞的試劑盒及其使用方法
【專利摘要】本發明公開了一種配合淋巴細胞培養基快速誘導大量DC?CIK、NK細胞的試劑盒及其使用方法，包括DC套盒：10ug干粉DC?A、5ug干粉DC?B；CIK套盒：6支干粉CIK?A(30ug/支)、10ug干粉CIK?B、20ug干粉CIK?C；NK套盒：5支干粉NK?A(50ug/支)、10ug干粉NK?B、5ug干粉NK?C。本發明利用DC?CIK、NK細胞誘導試劑盒能夠配合淋巴細胞培養基在最短的時間內誘導擴增出5*109以上的淋巴細胞，其中CIK細胞(CD3+CD56+)比例達到25％以上，NK細胞(CD3?CD56+)比例達到50％以上。為體外大規模擴增DC?CIK、NK細胞提供便利的方法，為相關研究及臨床實驗提供便利。
【專利說明】
配合淋巴細胞培養基快速誘導大量DC-CIK、NK細胞的試劑盒及其使用方法
技術領域
[0001]本發明涉及一種誘導DC-CIK、NK細胞的試劑盒及其使用方法，尤其是一種配合淋巴細胞培養基快速誘導大量DC-CIK、NK細胞的試劑盒及其使用方法。
【背景技術】
[0002]當前免疫細胞因其高效的腫瘤細胞殺傷活性，其無任何副作用的優勢已經逐漸被醫學界認可。DC-CIK、NK(Cytokine induced killer)細胞作為免疫細胞中最具代表性的兩種細胞，其誘導和擴增的方法各不相同，且誘導出的細胞數量和質量也參差不齊。沒有一套簡單、高效、穩定的誘導試劑盒。
【發明內容】
[0003]本發明所要解決的技術問題是，提供一套簡單、高效、穩定的配合淋巴細胞培養基快速誘導大量DC-CIK、NK細胞的試劑盒及其使用方法。
[0004]為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是:一種配合淋巴細胞培養基快速誘導大量DC-CIK、NK細胞的試劑盒，包括DC套盒:1ug干粉DC-A、5ug干粉DC-B; CIK套盒:6支干粉CIK-A(30ug/支)、1ug干粉CIK-B、20ug干粉CIK-C; NK套盒:5支干粉NK-A(50ug/支)、1ug干粉NK-B、5ug干粉NK-C，按質量百分比，各種組分的成分如下:
[0005]DC 套盒:
[0006]干粉DC-A: 30 %-50 %白細胞介素_4(4000IU/ug)、50 % -70 %粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(25000IU/ug);
[0007]干粉DC-B:100 % 腫瘤壞死因子-α (16000IU/ug)；
[0008]CIK 套盒:
[0009]干粉CIK-A:60%-75% 白細胞介素_2(15000IU/ug)、25%-40%氨基酸；
[0010]干粉CIK-B:60%-80%CD3單抗、20%-40%干擾素-伽馬(28000IU/ug)；
[0011 ]干粉 CIK-C: 20 % -30 % CD3 單抗、70 % -80 % CD28 單抗；
[0012]NK 套盒:
[0013]干粉爾4:30%-40%白細胞介素-2(1500011]/叫)、20%-30%白細胞介素-12(7000IU/ug)、30%-50% 白細胞介素-15(7000IU/ug)；
[0014]干粉NK-B:70%-80%CD16單抗、20%-30%干擾素-伽馬(40000IU/ug)；
[0015]干粉NK-C:100%CD16 單抗。
[0016]優選，按質量百分比，DC套盒:干粉DC-A:40%白細胞介素_4(IL-4)、60%粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF);干粉DC-B:100%腫瘤壞死因子-a(TNF_a);CIK套盒:干粉CIK-A: 70 %白細胞介素-2、30 %氨基酸;干粉CIK-B: 70 % CD3單抗、30 %干擾素-伽馬(IFN-γ );干粉CIK-C: 25 %CD3單抗、75 %CD28單抗;NK套盒:干粉NK-A: 40 %白細胞介素-2、30 %白細胞介素-12(IL-12)、30%白細胞介素-15(IL-15);干粉NK-B:70%CD16單抗、30%干擾素-伽馬(IFN- γ );干粉 NK-C:100% CD 16 單抗。
[0017]上述的配合淋巴細胞培養基快速誘導出大量DC_CIK、NK細胞的試劑盒的使用方法，包括以下步驟:
[0018](I)配置細胞誘導培養基備用
[0019]DC細胞誘導培養基:150ml淋巴細胞培養基中添加干粉DC-A;
[0020]CIK細胞誘導培養基:每500ml淋巴細胞培養基中添加I支干粉CIK-A;
[0021]NK細胞誘導培養基:每500ml淋巴細胞培養基中添加I支干粉NK-A;
[0022](2)使用6毫升淋巴細胞培養基充分溶解試劑盒中的干粉CIK-B，并利用0.22微米孔徑的濾膜過濾溶液，在I個T-17 5培養瓶中分別加入5毫升過濾后的溶液，在CO2培養箱中孵育2小時;再使用6毫升淋巴細胞培養基充分溶解試劑盒中的干粉NK-B，并利用0.22微米孔徑的濾膜過濾溶液，在I個T-17 5培養瓶中分別加入5毫升過濾后的溶液，在CO2培養箱中孵育2小時；
[0023](3)分離獲得的PBMC取(5-10)*107個細胞接種至一個T-175細胞培養瓶中，加入50ml淋巴細胞培養基孵育l-2h后將未貼壁的細胞吸出，貼壁的細胞中加入50ml DC細胞誘導培養基，誘導DC細胞；
[0024](4)將步驟(3)中的未貼壁的細胞加入到未使用的I3BMC中，按照細胞數量比1:1的比例將所有細胞平均加入到分別提前2小時CIK-B預包被T-175細胞培養瓶，以及NK-B預包被的T-175細胞培養瓶中；在預包被CIK-B的培養瓶中加入70ml CIK細胞誘導培養基誘導CIK細胞;在預包被NK-B的培養瓶中加入70ml NK細胞誘導培養基以及終濃度誘導NK細胞；將細胞培養液混合均勻后放置在二氧化碳培養箱中培養；
[0025](5)培養的第3天，用5ml淋巴細胞培養基溶解I支CIK-A，并取出
[0026]Iml補加到CIK細胞誘導體系中繼續培養，其余4ml廢棄；
[0027](6)培養的第4天，在DC細胞誘導體系中加入50ml DC細胞誘導培養基，混合均勻后培養;同時NK細胞誘導體系中加入100ml NK細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養；
[0028](7)培養第5天，在CIK細胞誘導體系中加入10mlCIK細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養；
[0029](8)培養第6天，在DC細胞誘導體系中加入用500ul淋巴細胞培養基溶解的干粉DC-B，混合均勻后繼續培養；
[0030](9)第7天，將CIK細胞誘導體系中的全部細胞懸液轉移到一個1.8升容量的細胞培養袋中并在培養體系中，補加200ml CIK細胞誘導培養基;與此同時將誘導DC細胞誘導體系中的細胞全部收獲后加入到上述細胞培養袋中與CIK細胞共培養，并且補加用500ul淋巴細胞培養基溶解的干粉CIK-C;同時，將NK細胞誘導體系中的細胞懸液加入到另一個1.8升容量細胞培養袋中，在培養體系中加入400ml的NK細胞誘導培養，并補加用500ul淋巴細胞培養基溶解的干粉NK-C，混合均勻后繼續培養；
[0031](10)培養的第9天，在DC-CIK細胞的培養袋中加入400mlCIK細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養；
[0032](I I)培養的第11天，在DC-CIK細胞共培養的培養袋中加入800ml CIK細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養;與此同時在NK細胞的培養袋中加入100ml的NK細胞誘導培養基，混合均勾后繼續培養；
[0033](12)培養的第14天，在DC-CIK細胞培養體系中取出800-1000ml的DC-CIK細胞懸液收獲細胞，并加入600ml的CIK細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養;與此同時在NK細胞培養體系中取出800-1000ml的NK細胞懸液收獲細胞，加入600ml的NK細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養并離心并回收細胞。
[0034](13)第17天，將DC-CIK細胞共培養的培養袋及NK細胞的培養袋中的所有細胞收獲，離心并回收細胞，計算細胞總數并通過流式細胞檢測方法確定其中CIK細胞的比例和NK細胞的比例。
[0035]所述步驟(13)中，所述CIK細胞(CD3+CD56+)的比例達到25%以上，NK細胞(CD3—⑶56+)比例達到50%以上。
[0036]本發明的有益效果是:配合多種細胞因子及聯合培養技術對DC、CIK及NK分別進行誘導培養，并在一定時間點能夠穩定的獲得一定數量和質量的CIK細胞，細胞總量在5*109以上的淋巴細胞，其中CIK細胞(CD3+CD56+)比例達到25%以上，NK細胞(CD3—CD56+)比例達到50%以上。
【附圖說明】
[0037]圖1培養第7天的CIK、NK、DC細胞圖。
[0038]圖2培養第7天的DC細胞的流式檢測結果圖(成熟DC細胞的表面標志物CD1A、CD83、CD86的陽性率分別為75 %、79 %、89 % )。
[0039]圖3誘導第17天CIK及NK細胞誘導結果圖(在各自的培養體系中CIK細胞的比例為26.8% ;NK細胞的比例為52.2%，左圖為CIK細胞流式檢測結果，右圖為NK細胞流式檢測結果)。
【具體實施方式】
[0040]下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明作進一步詳細說明:
[0041 ]本發明的配合淋巴細胞培養基快速誘導大量DC-CIK、NK細胞的試劑盒，包括DC套盒:10ug 干粉 DC-A、5ug 干粉 DC-B;CIK 套盒:6 支干粉 CIK-A(30ug/支)、10ug 干粉 CIK-B、20ug干粉CIK-C; NK套盒:5支干粉NK-A(50ug/支)、1ug干粉NK-B、5ug干粉NK-C，按質量百分比，各種組分的成分如下:
[0042]DC 套盒:
[0043]干粉DC-A:30%-50%白細胞介素-4(4000IU/ug)、50%-70%粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(25000IU/ug);
[0044]干粉DC-B:100 % 腫瘤壞死因子-α (16000IU/ug)；
[0045]CIK 套盒:
[0046]干粉CIK-A:60%-75% 白細胞介素_2(15000IU/ug)、25%-40%氨基酸；
[0047]干粉CIK-B:60%-80%CD3單抗、20%-40%干擾素-伽馬(28000IU/ug)；
[0048]干粉CIK-C: 20 % -30 % CD3 單抗、70 % -80 % CD28 單抗；
[0049]NK 套盒:
[0050]干粉NK-A:30%-40%白細胞介素-2(15000IU/ug)、20%-30% 白細胞介素-12(7000IU/ug)、30%-50% 白細胞介素-15(7000IU/ug)；[0051 ]干粉NK-B:70%-80%CD16單抗、20%-30%干擾素-伽馬(40000IU/ug)；
[0052]干粉NK-C:100%CD16 單抗。
[0053]優選，按質量百分比，DC套盒:DC套盒:干粉DC-A:40 %白細胞介素_4(IL-4)、60 %粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF);干粉DC-B: 100%腫瘤壞死因子-a(TNF-a) ;CIK套盒:干粉CIK-A: 70 %白細胞介素-2、30 %氨基酸;干粉CIK-B: 70 %⑶3單抗、30 %干擾素-伽馬(IFN- γ )；干粉CIK-C: 25 % CD3單抗、75 % CD28單抗;NK套盒:干粉NK-A: 40 %白細胞介素-
2、30% 白細胞介素-12(IL-12)、30% 白細胞介素-15(IL-15);干粉NK-B:70%CD16單抗、30%干擾素-伽馬(IFN-γ );干粉NK-C: 100%CD16單抗。
[0054]上述的配合淋巴細胞培養基快速誘導出大量DC_CIK、NK細胞的試劑盒的使用方法，包括以下步驟:
[0055](I)配置細胞誘導培養基備用
[0056]DC細胞誘導培養基:150ml淋巴細胞培養基中添加干粉DC-A;
[0057]CIK細胞誘導培養基:每500ml淋巴細胞培養基中添加I支干粉CIK-A;
[0058]NK細胞誘導培養基:每500ml淋巴細胞培養基中添加I支干粉NK-A;
[0059](2)使用6毫升淋巴細胞培養基充分溶解試劑盒中的干粉CIK-B，并利用0.22微米孔徑的濾膜過濾溶液，在I個T-17 5培養瓶中分別加入5毫升過濾后的溶液，在CO2培養箱中孵育2小時;再使用6毫升淋巴細胞培養基充分溶解試劑盒中的干粉NK-B，并利用0.22微米孔徑的濾膜過濾溶液，在I個T-17 5培養瓶中分別加入5毫升過濾后的溶液，在CO2培養箱中孵育2小時；
[0060](3)分離獲得的PBMC取(5-10)*107個細胞接種至一個T-175細胞培養瓶中，加入50ml淋巴細胞培養基孵育l-2h后將未貼壁的細胞吸出，貼壁的細胞中加入50ml DC細胞誘導培養基，誘導DC細胞；
[0061 ] (4)將步驟(3)中的未貼壁的細胞加入到未使用的I3BMC中，按照細胞數量比1:1的比例將所有細胞平均加入到分別提前2小時CIK-B預包被T-175細胞培養瓶，以及NK-B預包被的T-175細胞培養瓶中；在預包被CIK-B的培養瓶中加入70ml CIK細胞誘導培養基誘導CIK細胞;在預包被NK-B的培養瓶中加入70ml NK細胞誘導培養基以及終濃度誘導NK細胞；將細胞培養液混合均勻后放置在二氧化碳培養箱中培養；
[0062](5)培養的第3天，用5ml淋巴細胞培養基溶解I支CIK-A，并取出Iml補加到CIK細胞誘導體系中繼續培養，其余4ml廢棄；
[0063](6)培養的第4天，在DC細胞誘導體系中加入50ml DC細胞誘導培養基，混合均勻后培養;同時NK細胞誘導體系中加入100ml NK細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養；
[0064](7)培養第5天，在CIK細胞誘導體系中加入10mlCIK細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養；
[0065](8)培養第6天，在DC細胞誘導體系中加入用500ul淋巴細胞培養基溶解的干粉DC-B，混合均勻后繼續培養；
[0066](9)第7天，將CIK細胞誘導體系中的全部細胞懸液轉移到一個1.8升容量的細胞培養袋中并在培養體系中，補加200ml CIK細胞誘導培養基;與此同時將誘導DC細胞誘導體系中的細胞全部收獲后加入到上述細胞培養袋中與CIK細胞共培養，并且補加用500ul淋巴細胞培養基溶解的干粉CIK-C;同時，將NK細胞誘導體系中的細胞懸液加入到另一個1.8升容量細胞培養袋中，在培養體系中加入400ml的NK細胞誘導培養，并補加用500ul淋巴細胞培養基溶解的干粉NK-C，混合均勻后繼續培養；
[0067](10)培養的第9天，在DC-CIK細胞的培養袋中加入400mlCIK細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養；
[0068](I I)培養的第11天，在DC-CIK細胞共培養的培養袋中加入800ml CIK細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養;與此同時在NK細胞的培養袋中加入100ml的NK細胞誘導培養基，混合均勾后繼續培養；
[0069](12)培養的第14天，在DC-CIK細胞培養體系中取出800-1000ml的DC-CIK細胞懸液收獲細胞，并加入600ml的CIK細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養;與此同時在NK細胞培養體系中取出800-1000ml的NK細胞懸液收獲細胞，加入600ml的NK細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養并離心并回收細胞。
[0070](13)第17天，將DC-CIK細胞共培養的培養袋及NK細胞的培養袋中的所有細胞收獲，離心并回收細胞，計算細胞總數并通過流式細胞檢測方法確定其中CIK細胞的比例和NK細胞的比例。
[0071 ] 所述步驟(I3)中，所述CIK細胞的比例是指⑶3+⑶56+的比例，NK細胞的比例是指CD3—CD56+的比例。
[0072]實施例1
[0073]如圖1、2、3所示，本發明的DC-CIK、NK細胞的試劑盒，包括DC套盒:10ug干粉DC-A、5ug干粉DC-B; CIK套盒:6支干粉CIK-A( 30ug/支)、1ug干粉CIK-B、20ug干粉CIK-C ； NK套盒:5支干粉NK-A( 50ug/支)、1ug干粉NK-B、5ug干粉NK-C，按質量百分比，各種組分的成分如下:
[0074]DC 套盒:
[0075]干粉DC_A:40%白細胞介素_4(4000IU/ug)、60%粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(25000IU/ug)；
[0076]干粉DC-B:100 % 腫瘤壞死因子-α (16000IU/ug)；
[0077]CIK 套盒:
[0078]干粉CIK-A:70% 白細胞介素_2(15000IU/ug)、30%氨基酸；
[0079]干粉CIK-B:70%CD3單抗、30%干擾素-伽馬(28000IU/ug)；
[0080]干粉CIK-C: 25 % CD3 單抗、75 % CD28 單抗；
[0081]NK 套盒:
[0082]干粉NK-A:40%白細胞介素-2(15000IU/ug)、30% 白細胞介素-12(7000IU/ug)、30% 白細胞介素-15(7000IU/ug);
[0083]干粉NK-B:70%CD16單抗、30%干擾素-伽馬(40000IU/ug)；
[0084]干粉NK-C:100%CD16 單抗。
[0085]具體實施方案:
[0086](I)配置細胞誘導培養基備用
[0087]DC細胞誘導培養基:150ml淋巴細胞培養基中添加干粉DC-A;
[0088]CIK細胞誘導培養基:每500ml淋巴細胞培養基中添加I支干粉CIK-A;
[0089]NK細胞誘導培養基:每500ml淋巴細胞培養基中添加I支干粉NK-A;
[0090](2)使用6毫升淋巴細胞培養基充分溶解試劑盒中的干粉CIK-B，并利用0.22微米孔徑的濾膜過濾溶液，在I個T-17 5培養瓶中分別加入5毫升過濾后的溶液，在CO2培養箱中孵育2小時;再使用6毫升淋巴細胞培養基充分溶解試劑盒中的干粉NK-B，并利用0.22微米孔徑的濾膜過濾溶液，在I個T-17 5培養瓶中分別加入5毫升過濾后的溶液，在CO2培養箱中孵育2小時；
[0091](3)分離獲得的PBMC取(5-10)*107個細胞接種至一個T-175細胞培養瓶中，加入50ml淋巴細胞培養基孵育l-2h后將未貼壁的細胞吸出，貼壁的細胞中加入50ml DC細胞誘導培養基，誘導DC細胞；
[0092](4)將步驟(3)中的未貼壁的細胞加入到未使用的I3BMC中，按照細胞數量比1:1的比例將所有細胞平均加入到分別提前2小時CIK-B預包被T-175細胞培養瓶，以及NK-B預包被的T-175細胞培養瓶中；在預包被CIK-B的培養瓶中加入70ml CIK細胞誘導培養基誘導CIK細胞;在預包被NK-B的培養瓶中加入70ml NK細胞誘導培養基以及終濃度誘導NK細胞；將細胞培養液混合均勻后放置在二氧化碳培養箱中培養；
[0093](5)培養的第3天，用5ml淋巴細胞培養基溶解I支CIK-A，并取出
[0094]Iml補加到CIK細胞誘導體系中繼續培養，其余4ml廢棄；
[0095](6)培養的第4天，在DC細胞誘導體系中加入50ml DC細胞誘導培養基，混合均勻后培養;同時NK細胞誘導體系中加入100ml NK細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養；
[0096](7)培養第5天，在CIK細胞誘導體系中加入10mlCIK細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養；
[0097](8)培養第6天，在DC細胞誘導體系中加入用500ul淋巴細胞培養基溶解的干粉DC-B，混合均勻后繼續培養；
[0098](9)第7天，將CIK細胞誘導體系中的全部細胞懸液轉移到一個1.8升容量的細胞培養袋中并在培養體系中，補加200ml CIK細胞誘導培養基;與此同時將誘導DC細胞誘導體系中的細胞全部收獲后加入到上述細胞培養袋中與CIK細胞共培養，并且補加用500ul淋巴細胞培養基溶解的干粉CIK-C;同時，將NK細胞誘導體系中的細胞懸液加入到另一個1.8升容量細胞培養袋中，在培養體系中加入400ml的NK細胞誘導培養，并補加用500ul淋巴細胞培養基溶解的干粉NK-C，混合均勻后繼續培養；
[0099](10)培養的第9天，在DC-CIK細胞的培養袋中加入400mlCIK細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養；
[0100](11)培養的第11天，在DC-CIK細胞共培養的培養袋中加入800ml CIK細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養;與此同時在NK細胞的培養袋中加入100ml的NK細胞誘導培養基，混合均勾后繼續培養；
[0101](12)培養的第14天，在DC-CIK細胞培養體系中取出800-1000ml的DC-CIK細胞懸液收獲細胞，并加入600ml的CIK細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養;與此同時在NK細胞培養體系中取出800-1000ml的NK細胞懸液收獲細胞，加入600ml的NK細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養并離心并回收細胞。
[0102](13)第17天，將DC-CIK細胞共培養的培養袋及NK細胞的培養袋中的所有細胞收獲，離心并回收細胞，計算細胞總數為60.2*108，并通過流式細胞檢測方法確定其中CIK細胞(CD3+CD56+)的比例為26.8 %，NK細胞(CD3—CD56+)的比例為52.2 %。
[0103]實施例2
[0104]本發明的DC-CIK、NK細胞的試劑盒，包括DC套盒:10呢干粉0(:4、51^干粉0(:-8 ； CIK套盒:6支干粉CIK-A(30ug/支)、1ug干粉CIK-B、20ug干粉CIK-C ； NK套盒:5支干粉NK-A(50ug/支)、1ug干粉NK-B、5ug干粉NK-C，按質量百分比，各種組分的成分如下:
[0105]DC 套盒:
[0106]干粉DC-A:50%白細胞介素-4(4000IU/ug)、50%粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(25000IU/ug)；
[0107]干粉DC_B:100% 腫瘤壞死因子-a(16000IU/ug);
[0108]CIK 套盒:
[0109]干粉CIK-A:75%白細胞介素-2(15000IU/ug)、25%氨基酸；
[0110]干粉CIK-B:80%CD3單抗、20%干擾素-伽馬(28000IU/ug)；
[0111]干粉CIK-C: 30 % CD3 單抗、70 % CD28 單抗；
[0112]NK 套盒:
[0113]干粉NK-A:40%白細胞介素-2(15000IU/ug)、30% 白細胞介素-12(7000IU/ug)、30% 白細胞介素-15(7000IU/ug);
[0114]干粉NK-B:80%CD16 單抗、20% 干擾素-伽馬(40000IU/ug);
[0115]干粉NK-C:100%CD16 單抗。
[0116]具體實施方案:
[0117](I)配置細胞誘導培養基備用
[0118]DC細胞誘導培養基:150ml淋巴細胞培養基中添加干粉DC-A;
[0119]CIK細胞誘導培養基:每500ml淋巴細胞培養基中添加I支干粉CIK-A;
[0120]NK細胞誘導培養基:每500ml淋巴細胞培養基中添加I支干粉NK-A;
[0121](2)使用6毫升淋巴細胞培養基充分溶解試劑盒中的干粉CIK-B，并利用0.22微米孔徑的濾膜過濾溶液，在I個T-17 5培養瓶中分別加入5毫升過濾后的溶液，在CO2培養箱中孵育2小時;再使用6毫升淋巴細胞培養基充分溶解試劑盒中的干粉NK-B，并利用0.22微米孔徑的濾膜過濾溶液，在I個T-17 5培養瓶中分別加入5毫升過濾后的溶液，在CO2培養箱中孵育2小時；
[0122](3)分離獲得的PBMC取(5-10)*107個細胞接種至一個T-175細胞培養瓶中，加入50ml淋巴細胞培養基孵育l-2h后將未貼壁的細胞吸出，貼壁的細胞中加入50ml DC細胞誘導培養基，誘導DC細胞；
[0123](4)將步驟(3)中的未貼壁的細胞加入到未使用的I3BMC中，按照細胞數量比1:1的比例將所有細胞平均加入到分別提前2小時CIK-B預包被T-175細胞培養瓶，以及NK-B預包被的T-175細胞培養瓶中；在預包被CIK-B的培養瓶中加入70ml CIK細胞誘導培養基誘導CIK細胞;在預包被NK-B的培養瓶中加入70ml NK細胞誘導培養基以及終濃度誘導NK細胞；將細胞培養液混合均勻后放置在二氧化碳培養箱中培養；
[0124](5)培養的第3天，用5ml淋巴細胞培養基溶解I支CIK-A，并取出Iml補加到CIK細胞誘導體系中繼續培養，其余4ml廢棄；
[0125](6)培養的第4天，在DC細胞誘導體系中加入50ml DC細胞誘導培養基，混合均勻后培養;同時NK細胞誘導體系中加入100ml NK細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養；
[0126](7)培養第5天，在CIK細胞誘導體系中加入10mlCIK細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養；
[0127](8)培養第6天，在DC細胞誘導體系中加入用500ul淋巴細胞培養基溶解的干粉DC-B，混合均勻后繼續培養；
[0128](9)第7天，將CIK細胞誘導體系中的全部細胞懸液轉移到一個1.8升容量的細胞培養袋中并在培養體系中，補加200ml CIK細胞誘導培養基;與此同時將誘導DC細胞誘導體系中的細胞全部收獲后加入到上述細胞培養袋中與CIK細胞共培養，并且補加用500ul淋巴細胞培養基溶解的干粉CIK-C;同時，將NK細胞誘導體系中的細胞懸液加入到另一個1.8升容量細胞培養袋中，在培養體系中加入400ml的NK細胞誘導培養，并補加用500ul淋巴細胞培養基溶解的干粉NK-C，混合均勻后繼續培養；
[0129](10)培養的第9天，在DC-CIK細胞的培養袋中加入400mlCIK細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養；
[0130](I I)培養的第11天，在DC-CIK細胞共培養的培養袋中加入800ml CIK細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養;與此同時在NK細胞的培養袋中加入100ml的NK細胞誘導培養基，混合均勾后繼續培養；
[0131](12)培養的第14天，在DC-CIK細胞培養體系中取出800-1000ml的DC-CIK細胞懸液收獲細胞，并加入600ml的CIK細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養;與此同時在NK細胞培養體系中取出800-1000ml的NK細胞懸液收獲細胞，加入600ml的NK細胞誘導培養基，混合均勾后繼續培養并尚;L1、并回收細胞；
[0132](13)第17天，將DC-CIK細胞共培養的培養袋及NK細胞的培養袋中的所有細胞收獲，離心并回收細胞，計算細胞總數為59.6*108，并通過流式細胞檢測方法確定其中CIK細胞(CD3+CD56+)的比例為25.6%，爾細胞(0)3—0)56+)的比例為51.7%。
[0133]本發明立足于免疫細胞DC-CIK、NK細胞的體外大規模誘導方法，由于其在臨床上巨大的應用前景。本發明涉及的試劑盒必將為有需求的人員提供一種高效、便捷的DC-CIK、NK細胞獲得方法。
[0134]綜上所述，本發明的內容并不局限在上述的實施例中，相同領域內的有識之士可以在本發明的技術指導思想之內可以輕易提出其他的實施例，但這種實施例都包括在本發明的范圍之內。
【主權項】
1.一種配合淋巴細胞培養基快速誘導大量DC-CIK、NK細胞的試劑盒，其特征在于，包括DC套盒:1ug干粉DC-A，5ug干粉DC-B ； CIK套盒:6支干粉CIK-A、30ug/支，1ug干粉CIK-B，20ug 干粉 CIK-C ； NK 套盒:5 支干粉 NK-A、50ug/支，I Oug 干粉 NK-B，5ug 干粉 NK-C ； 按質量百分比，各種組分的成分如下: DC套盒: 干粉 DC-A: 4000 IU/ug 白細胞介素-430 % -50 % 25000IU/ug粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子50%-70% 干粉DC-B: 16000IU/ug腫瘤壞死因子-α CIK套盒: 干粉CIK-A: 15000IU/ug白細胞介素-2 60%-75%氨基酸25%-40% 干粉 CIK-B:CD3 單抗60%-80% 28000 IU/ug 干擾素-伽馬20%-40% 干粉 CIK-C:CD3 單抗20%-30% CD28 單抗70%-80% NK套盒: 干粉NK-A: 15000IU/ug 白細胞介素_2 30 % -40 % 7000IU/ug 白細胞介素-1220%~30% 7000IU/ug 白細胞介素-1530%~50% 干粉 NK-B:CD16 單抗70%-80% 40000 IU/ug 干擾素-伽馬20%-30% 干粉NK-C:CD16單抗。2.根據權利要求1所述的配合淋巴細胞培養基快速誘導大量DC-CIK、NK細胞的試劑盒，其特征在于，按質量百分比，DC套盒:干粉DC-A:40%白細胞介素_4、60%粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子;干粉DC-B:100%腫瘤壞死因子-a ；CIK套盒:干粉CIK-A:70%白細胞介素_2、30 %氨基酸；干粉CIK-B: 70 % CD3單抗、30 %干擾素-伽馬；干粉CIK-C: 25 %CD3單抗、75 %⑶28單抗;NK套盒:干粉NK-A: 40%白細胞介素_2、30 %白細胞介素-12、30 %白細胞介素-15；干粉NK-B: 70%CDl6單抗、30%干擾素-伽馬；干粉NK-C:100%CDl6單抗。3.如權利要求1中所述的配合淋巴細胞培養基快速誘導出大量DC-CIK、NK細胞的試劑盒的使用方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)配置細胞誘導培養基備用 DC細胞誘導培養基:150ml淋巴細胞培養基中添加干粉DC-A; CIK細胞誘導培養基:每500ml淋巴細胞培養基中添加I支干粉CIK-A; NK細胞誘導培養基:每500ml淋巴細胞培養基中添加I支干粉NK-A; (2)使用6毫升淋巴細胞培養基充分溶解試劑盒中的干粉CIK-B，并利用0.22微米孔徑的濾膜過濾溶液，在I個T-175培養瓶中分別加入5毫升過濾后的溶液，在CO2培養箱中孵育2小時;再使用6毫升淋巴細胞培養基充分溶解試劑盒中的干粉NK-B，并利用0.22微米孔徑的濾膜過濾溶液，在I個T-175培養瓶中分別加入5毫升過濾后的溶液，在CO2培養箱中孵育2小時； (3)分離獲得的PBMC取(5-10)*107個細胞接種至一個T-175細胞培養瓶中，加入50ml淋巴細胞培養基孵育l_2h后將未貼壁的細胞吸出，貼壁的細胞中加入50ml DC細胞誘導培養基，誘導DC細胞； (4)將步驟(3)中的未貼壁的細胞加入到未使用的I3BMC中，按照細胞數量比1:1的比例將所有細胞平均加入到分別提前2小時CIK-B預包被T-175細胞培養瓶，以及NK-B預包被的T-175細胞培養瓶中；在預包被CIK-B的培養瓶中加入70ml CIK細胞誘導培養基誘導CIK細胞;在預包被NK-B的培養瓶中加入70ml NK細胞誘導培養基以及終濃度誘導NK細胞;將細胞培養液混合均勻后放置在二氧化碳培養箱中培養； (5)培養的第3天，用5ml淋巴細胞培養基溶解I支CIK-A，并取出Iml補加到CIK細胞誘導體系中繼續培養，其余4ml廢棄； (6)培養的第4天，在DC細胞誘導體系中加入50mlDC細胞誘導培養基，混合均勻后培養;同時NK細胞誘導體系中加入100ml NK細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養； (7)培養第5天，在CIK細胞誘導體系中加入10mlCIK細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養； (8)培養第6天，在DC細胞誘導體系中加入用500ul淋巴細胞培養基溶解的干粉DC-B，混合均勻后繼續培養； (9)第7天，將CIK細胞誘導體系中的全部細胞懸液轉移到一個1.8升容量的細胞培養袋中并在培養體系中，補加200ml CIK細胞誘導培養基;與此同時將誘導DC細胞誘導體系中的細胞全部收獲后加入到上述細胞培養袋中與CIK細胞共培養，并且補加用500ul淋巴細胞培養基溶解的干粉CIK-C;同時，將NK細胞誘導體系中的細胞懸液加入到另一個1.8升容量細胞培養袋中，在培養體系中加入400ml的NK細胞誘導培養，并補加用500ul淋巴細胞培養基溶解的干粉NK-C，混合均勻后繼續培養； (10)培養的第9天，在DC-CIK細胞的培養袋中加入400mlCIK細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養； (11)培養的第11天，在DC-CIK細胞共培養的培養袋中加入800mlCIK細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養;與此同時在NK細胞的培養袋中加入100ml的NK細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養； (12)培養的第14天，在DC-CIK細胞培養體系中取出800-1OOOml的DC-CIK細胞懸液收獲細胞，并加入600ml的CIK細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養;與此同時在NK細胞培養體系中取出800-1000ml的NK細胞懸液收獲細胞，加入600ml的NK細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養并離心并回收細胞。 (13)第17天，將DC-CIK細胞共培養的培養袋及NK細胞的培養袋中的所有細胞收獲，離心并回收細胞，計算細胞總數并通過流式細胞檢測方法確定其中CIK細胞的比例和NK細胞的比例。4.根據權利要求3所述的配合淋巴細胞培養基快速誘導大量DC-CIK、NK細胞的試劑盒的使用方法，其特征在于，所述步驟(13)中，所述CIK細胞的比例是指CD3+CD56+達到25%以上，NK細胞的比例是指⑶3—CD56+達到50%以上。
【文檔編號】C12N5/0784GK105821001SQ201610278809
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年4月27日
【發明人】秦臻, 魯振宇, 韓洪起, 張冰晶, 劉俊江, 徐悅
【申請人】天津普瑞賽爾生物科技有限公司