生物反應器及其攪拌槳和使用其培養cik細胞的方法
【專利摘要】本發明公開了一種生物反應器及其攪拌槳和使用其培養CIK細胞的方法。所述攪拌槳外包裹有減小剪切力的材料,所述生物反應器含有其外包裹減小剪切力材料的攪拌槳,使用該生物反應器培養CIK細胞。本發明使用生物反應器培養CIK細胞,在攪拌槳外包裹可以減小剪切力的材料,可以降低細胞受到的剪切力傷害,有利于細胞大量擴增。本發明培養過程中不停的攪拌,為動態系統,有利于細胞進行氣體交換和為細胞提供均一的培養環境,有利于細胞大量擴增。本發明方法不僅可以大量擴增CIK細胞,而且所得CIK細胞表面抗原表達量較高,對腫瘤細胞的殺傷活性較強。
【專利說明】
生物反應器及其攪拌槳和使用其培養Cl K細胞的方法
技術領域
[0001] 本發明涉及細胞培養領域,尤其涉及一種生物反應器及其攪拌槳和使用其培養 CIK細胞的方法。
【背景技術】
[0002] CIK細胞(cytokine-induced killer,細胞因子誘導的殺傷細胞)是將人外周血單 個核細胞(?811〇在體外用多種細胞因子(抗0^(^、11-2、正^丫、幾-1€ [等)共同培養一段 時間后獲得的一群異質細胞。CIK細胞被稱為NK樣T淋巴細胞,兼具有T淋巴細胞強大的抗瘤 活性和NK細胞的非MHC(主要組織相容性復合體)限制性殺瘤優點,其主要效應細胞是CD3+ ⑶56+細胞。
[0003] CIK細胞能夠通過以下三種途徑殺滅腫瘤細胞和病毒感染細胞:
[0004] ① CIK細胞對腫瘤細胞和病毒感染細胞的直接殺傷:CIK細胞可以通過不同的機制 識別腫瘤細胞,釋放顆粒酶/穿孔素等毒性顆粒,導致腫瘤細胞裂解。
[0005] ②CIK細胞釋放的大量炎性細胞因子具有抑瘤殺瘤活性:體外培養的CIK細胞可以 分泌多種細胞因子,如IFN- y、TNF_a、IL-2等,不僅對腫瘤細胞有直接抑制作用,還可通過 調節機體免疫系統反應性間接殺傷腫瘤細胞。
[0006] ③CIK細胞能夠誘導腫瘤細胞的凋亡:CIK細胞在培養過程中表達FasL( II型跨膜 糖蛋白),FasL通過與腫瘤細胞膜表達的Fas(I型跨膜糖蛋白)結合,誘導腫瘤細胞凋亡。
[0007] 由于CIK細胞具有可以全身性治療腫瘤,并且對人體無明顯副作用,治療無明顯疼 痛感等優勢,CIK細胞治療被廣泛應用于臨床治療,并取得良好效果。CIK細胞治療技術是目 前最有效、最安全的輔助治療方法。如今,很多實驗室和醫院CIK細胞治療中使用的CIK細胞 大多數為小規模培養獲得,具體方法為:從外周血中分離得到單個核細胞,用含l〇v/V%FBS 的RPMI 1640培養基和IFN- y在培養瓶中培養,通過添加IL-2促進CIK細胞在體外大量擴 增,再分裝到多個培養瓶中或者轉入培養袋中擴增培養。現有CIK細胞的培養規模小,操作 復雜,步驟繁瑣,擴增倍數低,所擴增得到的數量不夠用于臨床治療,而且培養密度不能過 高,浪費培養基,不利于節約成本和培養空間。此外表面抗原表達量低,殺傷效果差。
【發明內容】
[0008] 有鑒于此,有必要針對上述的問題,提供一種生物反應器及其攪拌槳和使用其培 養CIK細胞的方法。
[0009] 為了實現上述目的,本發明采用如下技術方案:
[0010] -種使用生物反應器培養CIK細胞的方法,攪拌槳外包裹有減小剪切力的材料。 [0011]優選地,所述使用生物反應器培養CIK細胞的方法,包括以下步驟:
[0012]用X-VIV0 15培養基將PBMC按照1 X 106cells/ml的密度接種于培養瓶中,添加 1% 培養基體積的IFN- y溶液,在37°C、5 %C02條件下培養,第二天各添加 1 %培養基體積的IL-la溶液、IL-2溶液以及0KT-3溶液繼續培養,當培養體系達到一定體積后,轉入生物反應器 中繼續培養至兩周,每2~3天補充適量的培養基和IL-2;
[0013] 所述IFN- y溶液的濃度為100~1000U/ml,IL-la溶液的濃度為500~2000U/ml, IL-2溶液的濃度為100~1000U/ml,0KT-3溶液的濃度為500~2000U/ml。
[0014] 優選地,所述IFN- y溶液的濃度為300U/ml,IL-la溶液的濃度為500U/ml,IL-2溶 液的濃度為200U/ml,0KT-3溶液的濃度為500U/ml。
[0015]優選地,在生物反應器中培養CIK細胞的條件為:溶氧量為50%,pH7.2,攪拌速度 為45rpm〇
[0016]優選地,當培養體系大于500ml時,轉入2L生物反應器中繼續培養。
[0017] 優選地,所述PBMC通過以下方法獲得:
[0018]外周血和生理鹽水按體積比1:1進行稀釋得到血液稀釋液,將其加至二分之一倍 體積的淋巴細胞分離液上方,升降速調為0,800g離心30min,取單個核細胞層,用RPMI1640 培養基清洗兩次,用X-VIV0-15培養基重懸細胞即得PBMC。
[0019] -種生物反應器攪拌槳,所述攪拌槳外包裹減小剪切力的材料。
[0020] -種生物反應器,所述生物反應器的攪拌槳外包裹減小剪切力的材料。
[0021] 優選地,所述減小剪切力的材料為醫用硅膠管或食用橡膠管。
[0022] 與現有技術相比,本發明具有如下有益效果:
[0023] 1、本發明使用生物反應器培養CIK細胞,在攪拌槳外包裹可以減小剪切力的材料, 可以降低細胞受到的剪切力傷害,有利于細胞大量擴增。
[0024] 2、本發明使用生物反應器培養CIK細胞,在培養過程中不停的攪拌,為動態系統, 有利于細胞進行氣體交換和為細胞提供均一的培養環境,有利于細胞大量擴增。
[0025] 3、本發明使用生物反應器培養CIK細胞,在保證細胞質量的前提下,能夠顯著提高 細胞培養密度,有利于節約培養基和培養空間。
[0026] 4、本發明使用生物反應器培養CIK細胞,更接近人體內三維生長環境,與使用培養 瓶、培養袋等細胞貼壁生長的培養方式相比,更利于細胞大量擴增,可以大規模培養CIK細 胞,而且所得CIK細胞表面抗原表達量較高,對腫瘤細胞的殺傷活性較強。
【附圖說明】
[0027] 圖1為實施例1培養的CIK細胞的流式檢測結果。
[0028] 圖2為對比例1培養的CIK細胞的流式檢測結果。
[0029] 圖3為對比例2培養的CIK細胞的流式檢測結果。
[0030] 圖4為CIK細胞對K562細胞的殺傷活性結果。
【具體實施方式】
[0031]為了更好的說明本發明,下面結合附圖和具體實施例做進一步說明。本發明中所 用試劑或儀器均可由市場購得,使用的檢測方法等都是本領域所熟知的,在此不再贅述。 [0032] CIK細胞是PBMC在體外用多種細胞因子共同培養一段時間后獲得的一群異質細 胞,其主要效應細胞是⑶3+⑶56+細胞。PBMC可以使用現有任何方法獲得,本發明中PBMC通過 以下方法制備:
[0033] 把60ml外周血轉移至離心管中,用生理鹽水按體積比1:1進行稀釋,得到血液稀釋 液;在一新離心管中加入淋巴細胞分離液,把血液稀釋液緩慢添加至淋巴細胞液層上方,形 成明顯的分界線,其中,淋巴細胞分離液與血液稀釋液的體積比為1:2;升降速調為0,800g 離心30min,離心結束后,用巴氏吸管小心抽取單個核細胞層至另一新離心管中,往該離心 管中添加RPMI1640培養基清洗細胞,300g離心5min,棄上清,再次添加RPMI1640培養基清洗 細胞,300g離心5min,棄上清;用X-VIVO-15培養基重懸細胞得到PBMC懸液。取20yl PBMC懸 液用臺盼藍染色法(臺盼藍與PBMC懸液體積比為1:1)進行計數。
[0034] 實施例1
[0035]自2L生物反應器(購自北京元唐盛興科技有限公司,美國BELLC0)中取出攪拌槳, 在攪拌槳外套上醫用硅膠管,紫外照射滅菌后,重新將攪拌槳裝回生物反應器內。使用該生 物反應器培養CIK的方法如下:
[0036] 取2 X 107個PBMC,按照1 X 106cells/ml的密度用X-VIV0 15培養基接種于T75培養 瓶中,并添加1 %培養基體積的IFN- y溶液,在37°C、5%C02條件下培養,第二天添加IL-la 溶液、IL-2溶液以及0KT-3溶液繼續培養,IL-la溶液、IL-2溶液以及0KT-3溶液的添加量為 培養基體積的1%。根據細胞的擴增情況,進行分瓶培養,當培養體系總量大于500ml時,將 其轉入2L生物反應器中,按照溫度37 °C,C02通氣量為5 %,溶氧量為50 %,pH為7.2,攪拌速 度為45rpm的條件繼續培養至兩周,培養基為含1~10U/ml IL-2的X-VIV0 15培養基。
[0037] 所述IFN- y溶液的濃度為100~1000U/ml,IL-la溶液的濃度為500~2000U/ml, IL-2溶液的濃度為100~1000U/ml,0KT-3溶液的濃度為500~2000U/ml。本實施例中IFN-y 溶液的濃度為300U/ml,IL-la溶液的濃度為500U/ml,IL-2溶液的濃度為200U/ml,0KT-3溶 液的濃度為500U/ml。
[0038] 整個培養過程中觀察并記錄細胞生長情況,每2~3天進行細胞計數并補充適量的 培養基和IL-2,培養體系中IL-2的濃度為1~10U/ml。
[0039] 對比例1
[0040] 取2 X 107個PBMC,按照1 X 106cells/ml的密度用X-VIV0 15培養基接種于T75培養 瓶中,并添加1 %培養基體積的IFN- y溶液,在37°C、5%C02條件下培養,第二天添加IL-la 溶液、IL-2溶液以及0KT-3溶液繼續培養,IL-la溶液、IL-2溶液以及0KT-3溶液的添加量為 培養基體積的1%。根據細胞的擴增情況,進行分瓶培養,當培養體系總量大于500ml時,將 其轉入2L培養袋中繼續培養至兩周,培養條件與實施例1相同。
[0041] 所述IFN-y溶液的濃度為100~1000U/ml,IL-la溶液的濃度為500~2000U/ml, IL-2溶液的濃度為100~1000U/ml,0KT-3溶液的濃度為500~2000U/ml。本實施例中IFN-y 溶液的濃度為300U/ml,IL-la溶液的濃度為500U/ml,IL-2溶液的濃度為200U/ml,0KT-3溶 液的濃度為500U/ml。
[0042] 整個培養過程中觀察并記錄細胞生長情況,每2~3天進行細胞計數并補充適量的 培養基和IL-2,使細胞密度為1 X 106cells/ml,培養體系中IL-2的濃度為1~10U/ml。
[0043] 對比例2
[0044] 取2 X 107個PBMC,按照1 X 106cells/ml的密度用X-VIV0 15培養基接種于T75培養 瓶中,并添加1 %培養基體積的IFN- y溶液,在37°C、5%C02條件下培養,第二天添加IL-la 溶液、IL-2溶液以及0KT-3溶液繼續培養,IL-la溶液、IL-2溶液以及0KT-3溶液的添加量為 培養基體積的1%。根據細胞的擴增情況,進行分瓶培養,當培養體系總量大于200ml時,則 進行分瓶培養,每瓶培養體積不超過200ml,培養至兩周。
[0045] 所述IFN- y溶液的濃度為100~1000U/ml,IL-la溶液的濃度為500~2000U/ml, IL-2溶液的濃度為100~1000U/ml,0KT-3溶液的濃度為500~2000U/ml。本實施例中IFN-y 溶液的濃度為300U/ml,IL-la溶液的濃度為500U/ml,IL-2溶液的濃度為200U/ml,0KT-3溶 液的濃度為500U/ml。
[0046] 整個培養過程中觀察并記錄細胞生長情況,每2~3天進行細胞計數并補充適量的 培養基和IL-2,使細胞密度為1 X 106cells/ml,培養體系中IL-2的濃度為1~10U/ml。
[0047]效果實施例1
[0048]在各實施例、對比例培養結束后收集CIK細胞,采用臺盼藍染色法進行細胞計數, 計算細胞的擴增倍數,結果如表1所示。
[0049]表1、CIK細胞擴增倍數、活力、培養體積以及細胞密度表
[00511由表1可知,使用實施例1方法培養CIK細胞,擴增倍數高達503倍,是對比例1擴增 倍數的近2倍,是對比例2擴增倍數的近5倍。所以,使用本發明方法培養CIK細胞可以大大提 高CIK細胞的擴增倍數,細胞密度大,而且保持較高的細胞活力。
[0052]效果實施例2
[0053] 在各實施例、對比例培養結束后收集CIK細胞,采用常規方法進行流式檢測,考察 CIK細胞的表面抗原⑶3、⑶56的表達情況,結果如表2和圖1-3所示。
[0054] 表2、⑶3+⑶56+表達量表
[0056]由表2和圖1-3可知,使用實施例1方法培養得到的CIK細胞,其⑶3+⑶56+表達量為 27.2%,而使用對比例1方法培養得到的CIK細胞的⑶3+⑶56+表達量為24.8%,用對比例2方 法培養得到的CIK細胞的CD3+CD56+表達量為11.5% .所以,本發明方法培養得到的CIK細胞 的表面抗原表達量較高。
[0057]效果實施例3
[0058]在各實施例、對比例培養結束后收集CIK細胞,采用乳酸脫氫酶釋放法進行其對 K562細胞的殺傷活性檢測,結果如表3和圖4所示。
[0059] 表3、CIK細胞殺傷活性表
[0061 ]由表3和圖4可知,效靶比為40 :1時,實施例1中CIK細胞對K562細胞的殺傷活性為 58%,對比例1和對比例2中CIK細胞對K562細胞的殺傷活性分別為46%、39%;效靶比為20: 1時,實施例1中CIK細胞對K562細胞的殺傷活性為42%,對比例1和對比例2中CIK細胞對 K562細胞的殺傷活性分別為31 %、22% ;效靶比為10:1時,實施例1中CIK細胞對K562細胞的 殺傷活性為17%,對比例1和對比例2中CIK細胞對K562細胞的殺傷活性分別為12%、10%。 因此,本發明方法培養得到的CIK細胞對K562細胞的殺傷活性較高。
[0062]以上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式,其描述較為具體和詳細,但并 不能因此而理解為對本發明專利范圍的限制。應當指出的是,對于本領域的普通技術人員 來說,在不脫離本發明構思的前提下,還可以做出若干變形和改進,這些都屬于本發明的保 護范圍。因此,本發明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。
【主權項】
1. 一種使用生物反應器培養CIK細胞的方法,其特征在于,攪拌槳外包裹有減小剪切力 的材料。2. 根據權利要求1所述的使用生物反應器培養CIK細胞的方法,其特征在于,包括以下 步驟: 用X-VIVO 15培養基將PBMC按照1 X 106cells/ml的密度接種于培養瓶中,添加1%培養 基體積的IFN- γ溶液,在37°C、5%C02條件下培養,第二天各添加1 %培養基體積的IL-la溶 液、IL-2溶液以及0KT-3溶液繼續培養,當培養體系達到一定體積后,轉入生物反應器中繼 續培養至兩周,每2~3天補充適量的培養基和IL-2; 所述IFN- γ溶液的濃度為100~1000U/ml,IL-la溶液的濃度為500~2000U/ml,IL-2溶 液的濃度為100~l〇〇〇U/ml,0KT-3溶液的濃度為500~2000U/ml。3. 根據權利要求1所述的使用生物反應器培養CIK細胞的方法,其特征在于,所述減小 剪切力的材料為醫用硅膠管或食用橡膠管。4. 根據權利要求2所述的使用生物反應器培養CIK細胞的方法,其特征在于,所述IFN-γ溶液的濃度為300U/ml,IL-la溶液的濃度為500U/ml,IL-2溶液的濃度為200U/ml,0KT-3 溶液的濃度為500U/ml。5. 根據權利要求2所述的使用生物反應器培養CIK細胞的方法,其特征在于,當培養體 系大于500ml時,轉入2L生物反應器中繼續培養。6. 根據權利要求2所述的使用生物反應器培養CIK細胞的方法,其特征在于,在生物反 應器中培養CIK細胞的條件為:溶氧量為50%,pH7.2,攪拌速度為45rpm。7. -種生物反應器攪拌槳,其特征在于,所述攪拌槳外包裹減小剪切力的材料。8. 根據權利要求7所述的生物反應器攪拌槳,其特征在于,所述減小剪切力的材料為醫 用硅膠管或食用橡膠管。9. 一種生物反應器,其特征在于,所述生物反應器的攪拌槳外包裹減小剪切力的材料。10. 根據權利要求9所述的使用生物反應器,其特征在于,所述減小剪切力的材料為醫 用硅膠管或食用橡膠管。
【文檔編號】C12N5/0783GK105821000SQ201610141283
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年3月11日
【發明人】王飛, 王一飛, 陳海佳, 葛嘯虎, 曾維杰
【申請人】廣州賽萊拉干細胞科技股份有限公司