一株羽毛降解菌株及應用
【專利摘要】本發明公開了一種芽孢桿菌<i>Bacillus </i>sp. CJPE209及其應用，該菌株已于2015年12月10日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為：CCTCC NO:M 2015734。本發明所選育的菌株可有效解決廢棄羽毛的再生利用，得到可利用的氨基酸和多肽，減少環境污染。CCTCC NO：M 201573420151210
【專利說明】
一株羽毛降解菌株及應用
技術領域
[0001] 本發明屬于微生物技術領域，具體而言涉及一株利用羽毛產角蛋白酶，并降解羽 毛得到氨基酸和多肽的芽孢桿菌及其應用。
【背景技術】
[0002] 角蛋白是一種不溶于水、鹽液、稀酸和稀堿的硬質蛋白。角蛋白來源于外胚層分化 而來的細胞，廣泛存在于發、毛、鱗、羽、甲、蹄、角、爪、喙、絲及其他表皮結構中，是羽毛、毛 發、爪、喙、蹄、角以及腦灰質、脊髓和視網膜神經的蛋白質。羽毛作為家禽飼養和屠宰工業 的副產物每年產量巨大、且蛋白質和氨基酸含量豐富，是潛在的優良蛋白質資源。但是角蛋 白結構中的二硫鍵使其具有抗降解性，不為多數蛋白酶如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白 酶等降解。角蛋白酶為專一性降解角蛋白的一類酶，可由真菌、放線菌和細菌等多種微生物 產生。自然界中羽毛等廢棄物得以降解便是由微生物作用所致。羽毛含有超過90%的蛋白 質，因二硫鍵等存在而不易在自然界降解；另一方面每年世界范圍內幾百萬噸的廢棄羽毛 可導致環境污染的危害，蛋白質資源也存在浪費問題，特別是我國蛋白資源不足，對其加工 利用更有實際意義。
[0003] 現今，利用羽毛生產飼料主要利用高溫高壓處理羽毛，該方式會破壞部分氨基酸、 產品消化率低、耗能高且產品質量不穩定，但使用微生物產角蛋白酶處理羽毛能避免上述 問題的出現。皮革工業中毛皮脫毛也是一項重要的工序，傳統方法是利用硫化鈉、石灰等化 學物質進行脫毛，該過程對環境的污染較大，會產生大量的固體廢物，對水的消耗較大，而 且硫化鈉和石灰等化學物質處理毛皮是會對毛皮本身造成一定程度的損壞，使皮革質量下 降，角蛋白酶可以運用于皮革脫毛，特異性強的角蛋白酶可以較好的完成脫毛工序，其對皮 革本身也不會造成損傷。另外，角蛋白酶加入外用藥物中可以促進藥物吸收，提高療效。因 此角蛋白酶在食品、醫藥、飼料、精化和制革等工業中廣泛應用。
[0004] 角蛋白酶是一種誘導酶，只有當環境中出現誘導子（角蛋白）時才會合成。目前市 面上沒有大量商業角蛋白酶出售，已知的產角蛋白酶的微生物產酶能力大多不高，且大多 無法直接利用未經處理的羽毛。如冀勇良等報道用短小芽孢桿菌液體發酵產酶，酶活最高 為57.14U/mL;Ana Maria Mazotto等用黑曲霉固體發酵產酶降解經氯仿脫脂的雞毛，發酵 周期7天，酶活最高為172.71]/1^;1\^供〇 6111化等利用鏈霉菌21121發酵5.5天降解脫脂處理 雞毛;Ghada E. A. Awad等使用芽孢桿菌利用明膠進行固體發酵產角蛋白酶，周期20天，酶 活僅為730±4.9 U/g。由于這些發酵周期長、降解能力弱、酶活低的菌無法適應工業化生 產，因此篩選一株發酵周期短、降解能力強、酶活力高的菌株十分必要。
【發明內容】
[0005] 針對現有技術的不足，本發明對利用廢棄羽毛產角蛋白酶的菌株進行篩選和優 化，得到一株產角蛋白酶較高的菌株。
[0006] 為了實現本發明的目的，發明人通過大量試驗反復進行菌種選育研究，并最終獲 得了一株產角蛋白酶酶能力較強的菌株Bacillus Sp.CJPE209,該菌株已于2015年12月10 日保藏于中國典型培養物保藏中心(地址：中國?武漢?武漢大學），分類命名為Bacillus sp.CJPE209,保藏編號為：CCTCC NO:M 2015734。
[0007] 本發明涉及的高產角蛋白酶的Bacillus sp. CJPE209,具有如下生物學特征： 形態學特征:菌落大，表面粗糙，扁平，不規則，芽孢圓形或柱形，中生或近中生。
[0008] 生理特性:利用蔗糖、葡萄糖、果糖等碳源產角蛋白酶。
[0009] 代謝特性:代謝過程能產角蛋白酶。
[0010] 本發明有如下優勢：相對與其他菌株來說，材料處理簡單，發酵周期較短（如下 表）。降低工業生產的成本，減少環境污染。并且該菌能以羽毛為唯一碳氮源發酵，在較短時 間內降解羽毛并產酶，且為液體通風發酵，工業化生產對設備要求較低。
【附圖說明】
[0011] 圖1為Bacillus sp. CJPE209發酵培養48h對羽毛的降解效果圖。
[0012] 圖2為發酵周期對酶活的影響曲線圖。
[0013] 圖3為發酵溫度對酶活的影響柱形圖。
[0014] 圖4為搖床轉速對酶活的影響柱形圖。
[0015] 圖5為裝液量對酶活的影響柱形圖。
[0016] 圖6為初始pH對酶活的影響柱形圖。
【具體實施方式】
[0017] 以下通過實施例形式對本發明的上述內容再作進一步的詳細說明，但不應將此理 解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實施例，凡基于本發明上述內容所實現的技術均 屬于本發明的范圍。
[0018] 實施例1:菌種的選育 (1)試驗中所用的培養基及溶液： 每1000富集培養基含有:葡糖糖10g、NaCl 5g、牛肉膏5g、蛋白胨10g，余量為水、pH自 夕犬. JWS ， 每 1000g篩選培養基含有：羽毛粉 10g、NaCl 58、1(2冊0418、1012?040.58、]\%30418、余量 為水、pH自然； 每1000g所述選擇性分離培養基含有:干酪素4g、CaC123g、NaCl 5g、牛肉膏5g、瓊脂粉 16g、余量為水、pH自然； 每1000g搖瓶上子培養基含有:NaCl 5g、牛肉膏5g、蛋白胨10g、余量為水、pH自然； 每1000g固體斜面培養基含有:NaCl 5g、牛肉膏5g、蛋白胨10g、余量為水，pH自然； 每1000g搖瓶復篩發酵培養基含有：羽毛10g、NaCl 5g、K2HP041g、KH2P040.5g、 MgS041g、余量為水、pH自然 無菌生理鹽水:取8.5g氯化鈉溶于1L的蒸餾水中溶解，0.1 MPa滅菌20min。
[0019] (2)實驗步驟 從養雞場采集土樣4份，腐爛雞毛2份。首先從每份樣品中取一定樣品，用無菌生理鹽水 將樣品打散;再用富集培養基37°C培養Id;接著取2mL富集菌液接種到篩選培養基中37°C 培養2d，取篩選培養基中的菌液再次接種到篩選培養基37 °C培養2d，依次重復接種3次;之 后再用生理鹽水將第三次篩選培養基上的菌液稀釋成不同濃度的菌懸液，取〇.2mL涂布于 選擇性分離平板置37°C條件下，培養2-4 d，挑取透明圈大且明顯的菌株作為初篩菌株； 挑出平板上的單菌落，接入斜面固體培養基保藏備用。
[0020]最后通過搖瓶發酵試驗驗證，獲得一株可以直接利用未處理羽毛作為碳、氮源的 菌株Bacillus sp. CJPE209。
[0021]實施例2:產酶菌種的培養條件優化 (1) 菌株:實施例1篩選出的菌株Bacillus sp. CJPE209 (2) 方法步驟： 采用單因素試驗考察菌株的發酵溫度、發酵周期、接種量、搖床轉速、初始pH對角蛋白 酶產量的影響。搖瓶初始發酵條件為：菌株Bacillus sp. CJPE209的接種量2%(v/v)，搖瓶 復篩發酵培養基裝液量100mL/250mL，37°C，160r/min搖瓶發酵48h。
[0022] a.發酵周期的優選試驗 其它發酵條件為初始發酵條件，每隔12h取樣測量角蛋白酶酶活，確定菌株產角蛋白酶 的最優發酵周期。由圖2可知，當發酵到48h時酶活最高，為297.4U/ml，故選擇發酵周期為 48h〇
[0023] b.發酵溫度的優選試驗 發酵時間取上述試驗確定的最優結果，其它發酵條件為初始發酵條件，分別在33°C、35 °C、37 °C、39 °C和41°C搖床中進行發酵培養后測定角蛋白酶酶活，考察溫度對菌種產角蛋白 酶的影響。由圖3可知，當發酵溫度為37°C時，酶活最高為312.8U/ml，故選擇發酵溫度為37 r。
[0024] c.搖床轉速的優選實驗 發酵時間和發酵溫度取上述試驗確定的最優結果，其它發酵條件為初始發酵條件，搖 床轉速分別為 120r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min、220 r/min和240 r/min，考察搖床轉速對菌種產角蛋白酶的影響，由圖4知，當搖床轉速為220r/min時，酶活 最高為337.6 U/ml，故選擇搖床轉速為220r/min。
[0025] d.發酵搖瓶裝液量的優選試驗 發酵時間、溫度、和搖床轉速取上述試驗確定的最優結果，其它發酵條件為初始發酵條 件，采用250 ml搖瓶裝液，搖瓶裝液量分別為25 ml、50ml、75 ml、100 ml和125 ml。由圖5可 知，當搖瓶裝液量為25ml (搖瓶體積250ml)時，酶活最高為332U/ml，故選擇裝液量為25mL (搖瓶體積250ml)。
[0026] e.初始pH的優選試驗 發酵時間、溫度、搖床轉速和pH試驗確定的最優結果，其它發酵條件為初始發酵條件， 調整初始pH分別為5、6、7、8、9和10，，考察pH對菌株產角蛋白酶的影響。
[0027]由圖6知，當發酵初始pH為7.0時，酶活最高為312.8U/mL，故選擇初始pH為7.0。 [0028]實施例3:羽毛降解實驗 將CJPE209以2%(v/v)的接種量接入選擇性培養基，使用優化后的最佳培養條件培養， 發酵觀察羽毛降解現象，由于培養基無除羽毛外的碳氮源，培養基呈透明澄清狀。發酵12h 左右時，羽毛主梗上的細小毛絨脫落，培養基漸漸渾濁;發酵進行到40h時，培養基渾濁，不 透光，羽毛大部分被降解，僅余部分主梗;48h后，培養基中羽毛主梗也被降解，見圖1。
[0029]實施例4:與其它降解羽毛微生物的比較 CJPE209與枯草芽孢桿菌、黑曲霉從發酵類型、發酵周期等方面進行比較，具體結果見 下表： 通過對比試驗可知，使用CJPE209降解羽
毛時，只需要對需要進行常規的去污處理，不-需要經過高溫或脫脂處理，同時發酵的周期也大大縮短，因此CJPE209降解羽毛的效果及使 用方法等方面都優于其它降解羽毛的微生物。
【主權項】
1. 一株羽毛降解菌株Bacillus sp.CJPE209,其特征在于：該菌株Bacillus sp .CJPE209已于2015年12月10日保藏于中國典型培養物包藏中心，分類命名為Bacillus sp.CJPE209,保藏編號為：CCTCC NO:M 2015734。2. -株羽毛降解菌株Bacillus sp.CJPE209的應用，其特征在于:該菌株可直接利用未 經過處理的羽毛。
【文檔編號】C12P21/06GK105820979SQ201610259401
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年4月25日
【發明人】蔡俊, 蔣彪, 王常高, 杜馨, 林建國
【申請人】湖北工業大學