硫酸化透明質酰脂肪烴胺的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種新型藥物載體硫酸化透明質酰脂肪烴胺及其應用。它是在透明質酸(HA)骨架上引入疏水性基團脂肪烴胺以及親水性基團硫酸根而形成的，具有兩親性，在水中可自組裝形成聚合物膠束，包載難溶性藥物、蛋白質藥物、基因類藥物。該硫酸化透明質酰脂肪烴胺具有抑制腫瘤生長，易形成載藥聚合物納米粒，穩定性好，包封率高，制備工藝簡單，易于大規模生產等特點。
【專利說明】
硫酸化透明質酰脂肪烴胺
技術領域
[0001] 本發明涉及高分子材料技術領域、藥用輔料或藥物制劑領域，特別涉及一種硫酸 化透明質酰脂肪烴胺和其制備方法以及作為藥物載體的應用。
【背景技術】
[0002] 聚合物膠束是由兩親性聚合物在選擇性溶劑(通常是水）中自組裝形成的一種核 殼超分子結構。聚合物膠束的形成是一個自發的過程，在水溶液中，當兩親性聚合物的濃度 達到或超過某個臨界值（即臨界膠束濃度)時，聚合物的疏水端由于受到水分子的排斥等作 用纏繞形成疏水性內核，而親水段則會分布在疏水性內核周圍形成親水性外殼。聚合物膠 束具有較大的藥物增溶空間，顯著提高包埋藥物的水溶解度，增加藥物的穩定性，改善藥物 體內生物藥劑學的特性，通過聚合物表面的修飾，可提高腫瘤藥物的主動靶向功能，增強藥 物活性，降低毒性，但是許多全合成聚合物膠束材料安全性有待研究。
[0003] 透明質酸(Hyaluronan，HA)是一種由N-乙酰-D-葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸經e-l，4 糖苷鍵連接而成的線性多糖，人體內天然HA的相對分子質量分布廣泛，由1000到1000萬不 等，因HA水溶性好，生物可降解，生物相容性好，無毒，無免疫原性，容易進行化學修飾等特 點，HA作為藥物載體被廣泛應用。HA通過與細胞表面HA受體CD44和RHAM結合，調節細胞的生 長，增殖和迀移，尤其在腫瘤細胞的侵襲和轉移中發揮重要的作用。其中CD44是癌細胞表面 過量表達的最重要的HA受體，是與HA結合的主要部位，研究HA納米粒在腫瘤主動靶向方面 具有重要的意義。但是HA和HA納米材料本身對腫瘤細胞的增殖和轉移的影響值得關注和研 究。
[0004] 對多糖進行硫酸化改性，如硫酸化肝素、皮膚素、軟骨素、殼聚糖、香菇多糖顯示具 有多種生物活性，如抗凝血活性、抗病毒活性，特別是抗艾滋病病毒(HIV)等。由于它們的毒 副作用小，有的已經應用于臨床，顯示了廣泛的應用前景和深遠意義。
[0005] Anaid Benitez等發現硫酸化透明質酸一方面通過下調Bcl_2、磷酸化-Bad水平， 誘導依賴caspase-8型凋亡，另一方面通過下調HA受體的水平，從而抑制前列腺癌細胞如 LNCaP，LNCaP-A 1，DU 145，LAPC-4的生長。動物模型實驗中也顯示，硫酸化透明質酸對于 LNCaP-Al型前列腺癌細胞具有很強的抑制作用，同時不會導致明顯的體重減輕及血清毒性 (Anaid Benitez,Travis J.Yates,Luis E.Lopez,et alTargeting Hyaluronidase for Cancer Therapy：Antitumor Activity of Sulfated Hyaluronic Acid in Prostate Cancer Cel Is，Cancer Re s;71(12); 4085-95) D Stephan ieMSller 等合成硫酸化透明質酸和 硫酸化甲基透明質酸，通過靶向I型皰疹病毒證明二者均有抗病毒活性，且抗病毒活性隨著 硫酸化程度的提高而增強（Stephanie MSller, Michaela Schmidtke，DieterWeiss，et al ?， Synthesis and AntiherpeticActivity of Carboxymethylated and Sulfated Hyaluronan Derivatives ? Carbohydrate Polymers;90(2012):608-615)。但是這種生物活 性的硫酸化HA是水溶性性，不具有兩親性，不能作為藥物納米載體材料。
[0006] 本發明是將透明質酸上的羥基改性為硫酸根基團，并在HA羧基上接枝疏水性的脂 肪烴胺，發明一種硫酸化透明酰脂肪烴胺。它是兩親性聚合物納米材料，引入的脂肪烴胺是 疏水基團，有利于形成疏水內核，包裹藥物，引入的硫酸根同時有利于改善材料本身的親水 性，形成親水性外殼，提高藥物對CD44過量表達癌細胞的靶向作用；同時硫酸化透明質酰脂 肪烴胺本身具有一定的抗腫瘤活性，是一種潛在的抗腫瘤活性納米材料，且無毒，生物相容 性好。
[0007] 目前尚沒有將硫酸化透明質酸接枝脂肪烴胺制備抗腫瘤納米材料的報道。
【發明內容】
[0008] 本發明描述并要求一種新型硫酸化透明質酰脂肪烴胺、其制備方法以及其作為藥 物膠束載體材料的應用；它是一種安全性好、可生物降解、臨界膠束濃度低的兩親性聚合 物，可在水中自組裝形成聚合物膠束，作為納米藥物傳遞系統，同時材料本身具有抑制腫瘤 生長的作用。
[0009] 本發明的目的在于提供一種硫酸化透明質酰脂肪烴胺及其制備方法。
[0010] 本發明的目的在于提供硫酸化透明質酰脂肪烴胺在藥物制劑領域的應用。
[0011] 本發明涉及的硫酸化透明質酰脂肪烴胺，其特征是在透明質酸骨架上引入疏水性 基團脂肪烴胺以及親水基團硫酸根，使其具有兩親性，可在水中自組裝形成聚合物膠束。
[0012] 本發明所述的硫酸化透明質酰脂肪烴胺，是指疏水性的脂肪烴胺通過酰胺鍵接枝 到透明質酸中葡萄糖醛酸-N乙酰葡萄糖胺重復單元的羧基上，親水性基團硫酸根取代透明 質酸重復單元上的羥基。
[0013] 本發明所述的硫酸化透明質酰脂肪烴胺，其中接枝的疏水性基團脂肪烴胺的總取 代度為為5 %~40 %。
[0014]本發明所述的硫酸化透明質酰脂肪烴胺，其中硫酸化率為2~30%。
[0015] 本發明所述的硫酸化透明質酰脂肪烴胺，其特征在于選用的HA分子量為5X103~ 5X105Da〇
[0016] 具體地，本發明提供了一種硫酸化透明質酰脂肪烴胺的制備方法，包括以下過程： [0017] 透明質酸鈉(HA-Na)溶于雙蒸水中，室溫下磁力攪拌過夜；另稱取適量Dowex WX8 陽離子交換樹脂（四丁銨型)加入HA-Na中，室溫下磁力攪拌過夜，過濾，冷凍真空干燥，40 °C 下真空干燥，得透明質酸四丁銨鹽(TeBA-HA);
[0018] TeBA-HA溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，50 °C磁力攪拌5h使其溶解；另精密稱取 一定量的硫酸化劑（三氧化硫吡啶絡合物）溶于DMF中，室溫下攪拌至溶解后，加入上述 TeBA-HA溶液中，充氮保護，室溫磁力攪拌20min;反應液加入冰水終止反應，1M NaOH溶液調 節pH至9.0,加入乙醇洗滌、離心2次，沉淀用水溶解后蒸餾水透析ld，冷凍真空干燥，室溫下 真空干燥得硫酸化透明質酸(sHA);
[0019] sHA溶于甲酰胺中，50°C磁力攪拌2h使其溶解，冷卻至室溫后，加定量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，冰浴下反應2h;另精 密稱取一定量脂肪烴胺(ALA)溶于DMF中，將其逐滴加入sHA溶液中，充氮保護，35°C磁力攪 拌24h;反應液加入乙醇洗滌、離心兩次，沉淀用水溶解后蒸餾水透析2d，冷凍真空干燥得硫 酸化透明質酰脂肪烴胺(sHA-ALA)。
[0020]本發明所述的硫酸化透明質酰脂肪烴胺，可包載難溶性藥物(如多西紫杉醇等）、 基因類藥物、蛋白質藥物，制成載藥聚合物膠束納米粒。
[0021] 本發明所述的載藥聚合物納米粒是將硫酸化透明質酰脂肪烴胺溶于雙蒸餾水，自 組裝成濃度為1~5mg/mL的空白膠束溶液，將難溶或微溶性藥物溶于有機溶劑后，逐滴加入 上述的空白膠束溶液中，經超聲處理后，置于雙蒸餾水中透析除去有機溶劑，透析液經離 心、過濾后，必要時凍干，制得粒徑為1~l〇〇〇nm的聚合物載藥膠束。
[0022] 上述硫酸化透明質酰脂肪烴胺，具有抑制腫瘤生長，易形成載藥聚合物納米粒，制 備納米粒工藝簡便，納米粒膠束穩定性好，包封率高，納米粒給藥途徑多等特點。
【附圖說明】
[0023]圖1:硫酸化透明質酸的IR圖譜
[0024]圖2:硫酸化透明質酰十八胺的1H-NMR圖譜
[0025]圖3:硫酸化透明質酰十八胺的Im/Im與聚合物對數濃度關系圖
[0026]具體實施方法
[0027]通過下面實施例說明本發明的【具體實施方式】，但本發明的保護范圍，不局限于此。
[0028]實施例1透明質酸四丁銨鹽的制備
[0029] 透明質酸鈉(1^5000，骱-他，2.(^)溶于4001^雙蒸水中，室溫下磁力攪拌過夜；另 稱取20g Dowex WX8陽離子交換樹脂（四丁銨型）加入HA-Na中，室溫下磁力攪拌過夜混，過 濾，冷凍真空干燥，40°C下真空干燥，得透明質酸四丁銨鹽(TeBA-HA)。
[0030]實施例2硫酸化透明質酸(sHA)的制備
[0031] 精密稱取實施例1中的TeBA-HA(MW5000,500mg)溶于25ml N，N'_二甲基甲酰胺 (DMF)中，50°C磁力攪拌5h使其溶解；另精密稱取1400mg的硫酸化劑三氧化硫吡啶絡合物 (S03 ? Py)溶于25mL DMF中，室溫下攪拌至溶解后，加入TeBA-HA中，充氮保護，室溫磁力攪 拌20min;反應液加入100mL冰水終止反應，1M NaOH溶液調節pH至9.0，加入乙醇洗滌、離心2 次，沉淀用水溶解后蒸餾水透析2d，冷凍真空干燥，室溫下真空干燥得硫酸化透明質酸 (sHA)。IR圖譜確認sHA結構(見圖1) JMMB法測定硫酸化程度，硫含量(S% )為5.56%。
[0032]實施例3硫酸化透明質酰十八胺(sHA-ODA)的制備
[0033] 精密稱取實施例2中的sHA(lOOmg)溶于5ml甲酰胺中，50°C磁力攪拌2h使其溶解， 冷卻至室溫后，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC，95mg)、N-羥基琥珀 酰亞胺(NHS，58mg)，冰浴下反應2h;另精密稱取一定量十八胺(0DA)溶于9mLDMF中，將其逐 滴加入sHA溶液中，充氮保護，35 °C磁力攪拌24h;反應液加入乙醇洗滌、離心兩次，沉淀用水 溶解后蒸餾水透析2d，冷凍真空干燥得硫酸化透明質酰十八胺（sHA-ODA) ^H-NMR圖譜（見 圖2)確認sHA-ODA結構。
[0034]實施例4 sHA-ODA臨界膠束濃度的測定
[0035] 精密稱取10mg sHA-ODA，分散于少量蒸餾水中，磁力攪拌24h，冰浴探頭超聲30min (超聲功率95W，工作2s，間歇5s)，定容至10mL，得lmg/mL的空白膠束溶液;將lmg/mL的空白 膠束溶液稀釋至 sHA-ODA 濃度(C)為 1X10-3、2X10-3、5X10-3、1X10-2、2.5X10- 2、5X10-2、 7.5 X 10'1 X 10'5 X HTVg/mL的系列膠束溶液，分別加入定量的芘（終濃度為5 X 10-6mo 1/L)中，混合液超聲30min，60 °C水浴lh，40°C避光水浴過夜，利用熒光分光光度計測定 芘的熒光強度。激發波長為335nm，發射波長I^371nm，I 3為382nm，狹縫寬度Ex為3nm，EM為 3nm〇
[0036]以lgC(g/L)與芘在371nm和382nm出的熒光強度比值（h/13)作圖（見圖3)，曲線的 拐點對應的聚合物濃度即為該聚合物材料的臨界膠束濃度(CMC)。計算得sHA-ODA的CMC值 為60 . lyg/mL。由此表明sHA-ODA膠束的臨界膠束濃度比較小，以此制備的載藥膠束具有較 好的稀釋穩定性。
[0037] 實施例5空白sHA-ODA膠束納米粒的制備
[0038] 按1~5mg/mL的濃度將兩親性sHA-ODA溶于蒸餾水中，經超聲處理制備成粒徑為 100~lOOOnm的空白膠束納米粒溶液(sHA-ODA NDs)。
[0039]實施例6載多西紫杉醇sHA-ODA膠束納米粒的制備
[0040] l〇mg sHA-ODA溶于蒸餾水制得濃度2mg/mL的空白膠束溶液，將2. Omg的多西紫杉 醇（DTX)溶于400此甲醇中，逐滴加入到上述空白膠束溶液中，冰浴超聲30min(超聲功率 95W，工作2s，間歇5s)，置于蒸餾水中透析除去甲醇，透析液經離心，過濾后，制得粒徑為1~ 300nm的載藥sHA-ODA膠束納米粒(DTX-sHA-〇DA NPs)。表1是DTX-sHA-〇DA膠束納米粒及空 白膠束納米粒的一些性質。
[0041] 表1 DTX-sHA-ODA膠束納米粒及空白膠束納米粒的一些性質
[0043] 結果顯示，硫酸化透明質酰十八胺（sHA-ODA)這種兩親性材料，可在水中自發形成 膠束，且納米粒粒徑小于250nm，藥物包封率高（> 98 % )，對多西紫杉醇有明顯的增溶作用。
[0044] 實施例7 DTX-sHA-ODA NPs體外對腫瘤細胞的抑制作用
[0045] 納米制劑組:DTX-sHA-ODA NPs，培養液稀釋至濃度為0.41yM~100yM。
[0046] 陽性對照組:市售制劑多西紫杉醇注射液，培養液稀釋至濃度為0.41yM~100yM。 [0047]陰性對照組:sHA-ODA空白膠束納米粒，培養液稀釋至上述相同濃度。
[0048]取處于指數生長期狀態良好的人乳腺癌細胞MCF-7，加入0.25 %胰蛋白酶消化液， 消化使貼壁細胞脫落，計數制成細胞懸液;分別以6 X103個/孔的密度接種于96孔培養板 中，置C〇2培養箱中培養24h;按上述實驗方案分別給予所需濃度的納米制劑組、陰性對照 組、陽性對照組溶液，每一濃度平行6孔，繼續培養。24h后，向每孔加入10此MTT液，放入孵 箱4h后，向每孔加入150yL DMS0，使用酶標儀檢測490nm處吸光度。處理數據，計算半數抑制 濃度IC5Q值(見表2)。
[0049] 表2 DTX-sHA-ODA NPs體外對腫瘤細胞增殖的抑制作用（IC5q值）
[0051] 結果顯示，sHA-ODA空白膠束納米粒（陰性對照組)對于乳腺癌細胞的生長不僅沒 有促進作用，且具有一定的抑制作用。DTX-sHA-ODA NP制劑組的IC5Q小于多西紫杉醇注射液 (陽性對照組)3.1倍，說明載藥sHA-ODA NPs能使多西紫杉醇對乳腺癌細胞毒性明顯增強， 可能是通過CD44受體介導的主動靶向作用將藥物遞送至腫瘤細胞，提高抗腫瘤活性。
[0052]以上對本發明的具體實施例進行了詳細描述，但只是作為范例，本發明并不限制 于以上描述的具體實施例。對于本領域技術人員而言，任何對本發明進行的等同修改和替 代也都在本發明的范疇之中。因此，在不脫離本發明的精神和范圍下所作的均等變換和修 改，都應涵蓋在本發明的范圍內。
【主權項】
1. 硫酸化透明質酰脂肪烴胺，其特征是在于（1)它是透明質酸(HA)骨架的羧基上引入 疏水性基團脂肪烴胺以及在HA的羥基上引入親水基硫酸根而形成的，具有兩親性，（2)在水 中能自組裝形成聚合物膠束，作為難溶性藥物、蛋白質藥物、基因類藥物的納米載體，其包 含η個重復單元并具有以下結構通式(I):式中，m= 10~17中任意一個整數。2. 根據權利要求1所述的硫酸化透明質酰脂肪烴胺，其中HA的分子量為5 X103~5 X 105Da〇3. 根據權利要求1所述的硫酸化透明質酰脂肪烴胺，其中疏水性基團脂肪烴胺的取代 度為5%~40%。4. 根據權利要求1所述的硫酸化透明質酰脂肪烴胺，其中硫酸化率為2~30 %。5. 根據權利要求1所述的硫酸化透明質酰脂肪烴胺，其制備方法包括以下過程： 透明質酸鈉(HA-Na)溶于雙蒸水中，室溫下磁力攪拌過夜；另稱取適量Dowex WX8陽離 子交換樹脂（四丁銨型）加入HA-Na中，室溫下磁力攪拌過夜，過濾，冷凍真空干燥，40 °C下真 空干燥，得透明質酸四丁銨鹽(TeBA-HA); TeBA-HA溶于N，N' -二甲基甲酰胺(DMF)中，50°C磁力攪拌5h使其溶解；另精密稱取一定 量的硫酸化劑(三氧化硫吡啶絡合物)溶于DMF中，室溫下攪拌至溶解后，加入上述TeBA-HA 溶液中，充氮保護，室溫磁力攪拌20min;反應液加入冰水終止反應，1M NaOH溶液調節pH至 9.0，加入乙醇洗滌、離心2次，沉淀用水溶解后蒸餾水透析Id，冷凍真空干燥，室溫下真空干 燥得硫酸化透明質酸(sHA); sHA溶于甲酰胺中，50°C磁力攪拌2h使其溶解，冷卻至室溫后，加定量的1-乙基-(3-二 甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，冰浴下反應2h;另精密稱 取一定量脂肪烴胺(ALA)溶于DMF中，將其逐滴加入sHA溶液中，充氮保護，35°C磁力攪拌 24h;反應液加入乙醇洗滌、離心兩次，沉淀用水溶解后蒸餾水透析2d，冷凍真空干燥得硫酸 化透明質酰脂肪烴胺(sHA-ALA)。6. -種載藥聚合物納米粒的組合物，其特征在于，如權利要求1~5任何一項所述的硫 酸化透明質酰脂肪烴胺，包載難溶性藥物、蛋白質藥物、基因類藥物，制成載藥聚合物膠束 納米粒，加上醫藥學上可接受的輔料制備而成的藥物組合。7. 根據權利要求6中所述的載藥聚合物納米粒組合物，其制備方法包括以下過程:將硫 酸化透明質酰脂肪烴胺溶于雙蒸餾水，自組裝形成濃度為1~5mg/mL的空白膠束溶液，將難 溶或微溶性藥物溶于有機溶劑后，逐滴加入上述的空白膠束溶液中，經超聲處理后，置于雙 蒸餾水中透析除去有機溶劑，透析液經離心、過濾后，必要時凍干，制得粒徑為1~l〇〇〇nm的 聚合物載藥膠束。
【文檔編號】A61K9/107GK105820270SQ201610201033
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年3月30日
【發明人】欒立標, 蒲嘉琪
【申請人】中國藥科大學