一種高效提取擬南芥內層黏液層的方法
【專利摘要】本發明公開一種高效提取擬南芥內層黏液層的方法，屬于多糖提取領域。本發明的方法是利用超聲波提取內層黏液層。該方法經濟、簡化勞動：提取溶液為水，無需進行脫鹽處理便可得到大量的種皮黏液層，而酸堿鹽法提取時，殘留的鹽分需要去除。節省時間：震蕩法和酸堿鹽法提取時間一般為1～2h，后期還需要進行脫鹽，本方法可在20S完成提取。提取效率高：震蕩法和酸堿鹽法提取過后的種子經釕紅染色后顯示有大量黏液層殘留，而本方法提取后，基本無黏液層殘留。該方法具有高效、穩定、重現性好等優點，能最大程度地將黏液層提取出來，可使黏液層的分析更加精確，推動黏液層形成機理的研究，在化工行業中，本方法可縮短提取時間，減少成本。
【專利說明】
一種高效提取擬南芥內層黏液層的方法
技術領域
[0001]本發明屬于多糖提取領域，特別涉及一種高效提取擬南芥內層黏液層的方法。
【背景技術】
[0002]被子植物的胚在發育時，覆蓋在胚周圍的珠被會形成種皮，種皮將外界的各種不利因素隔離并可以調節種子的萌發，一些種子植物(如十字花科、茄科、亞麻科和車前草科等)的種皮在形成時，外層細胞會分泌大量黏液，形成一層膠狀的黏液層圍繞種子，這層黏液層對促進種子的吸水和擴散有重要作用。由于黏液層富含果膠成分，已經成為獲得果膠的重要原料。擬南芥種皮的外層細胞在分化時會在初生細胞壁和細胞膜之間積累大量的黏液，并且在細胞中央形成柱形的細胞質，這層細胞質周圍會形成一層加厚的次生細胞壁，最終形成一種火山形成的結構，稱為小柱。在種子吸水時，種皮外層細胞壁破裂釋放出黏液，最先釋放出的為外層黏液層，主要成分為無支鏈、非甲基化、非乙酰化的rhamnogalacturonan I(RG I)。還有一層黏液緊緊粘附于種皮，稱為內層黏液層，這層黏液與種子的聯結非常緊密，非常難以提取，這可能是由于黏液中的大分子交聯或者黏液與小柱之間的交聯，也有可能是外層細胞破碎后殘留于種皮進而阻止黏液的釋放(Western TL,Skinner DJ,Haughn Gff(2000)Differentiat1n of mucilage secretory cells of theArabidopsis seed coat.Plant phys1logy 122:
[0003]345-356)，內層黏液層的成分也主要為RG I，又可分為兩部分，外側包含有半乳聚糖和低甲基化的HG，內側包含有纖維素、半乳聚糖和高甲基化的HG。
[0004]擬南芥的外層黏液層非常容易獲得，將擬南芥種子浸于水中震蕩幾分鐘即可，但內層黏液層卻非常難以提取，在科研實驗中，擬南芥內層黏液層的提取主要通過震蕩、化學試劑如酸喊鹽等來提取(Macquet A1Ralet MC,Kronenberger JjMar1n-Poll A1North HM(2007) In situ, chemical and macromolecular study of the composit1n ofArabidopsis thaliana seed coat mucilage.Plant&cell phys1logy 48:984-999)，但這些方法提取到的只是內層黏液層的一部分，還有大量的內層黏液層成分殘留于種皮上。建立一種高效的擬南芥黏液層的提取方法，不但可以促進黏液層合成機理的研究，還可以為黏液層的化工提取提供方便。
【發明內容】
[0005]為了克服現有擬南芥內層黏液層提取方法的缺點與不足，本發明的目的在于提供一種高效提取擬南芥內層黏液層的方法。本發明的方法是利用超聲波提取內層黏液層。該方法具有高效、穩定、重現性好等優點，能最大程度地將黏液層提取出來。
[0006]本發明的目的通過下述技術方案實現:
[0007]—種高效提取擬南芥黏液層的方法，包括以下步驟:
[0008](I)獲得干燥的擬南芥種子；
[0009](2)提取擬南芥種子的外層黏液層；
[0010](3)取步驟(2)中去除外層黏液層的種子，利用超聲波進行超聲處理，獲得內層黏液層。
[0011]為了更好的實現本發明:還包括如下步驟:
[0012](4)對步驟(2)得到的外層黏液層和步驟(3)得到的內層黏液層分別進行三氟乙酸水解；
[0013](5)對步驟(4)得到的水解液進行高速離心，分別取上清和沉淀；
[0014](6)對步驟(5)得到的沉淀用蒽酮法測定結晶纖維素含量；
[0015](7)利用硫酸苯酚法測定步驟(4)得到的水解液中的糖含量，對照標準曲線，計算得到黏液層中的糖含量；
[0016](8)對步驟(2)、(3)處理后的種子進行釕紅染色。
[0017]步驟(I)中所述的獲得干燥的擬南芥種子通過以下方法實現，為了保證實驗的可重復性，將擬南芥種子置于干燥的室溫下一星期，使種子盡量脫水，最后收集起來置于低溫低濕種子柜中保存。
[0018]步驟(2)中所述的外層黏液層的提取溶劑為水;優選為純凈水；
[0019]步驟(2)中所述的提取的條件優選為置于150rpm的搖床上震蕩5?1min;
[0020]步驟(2)中所述的提取擬南芥種子的外層黏液層通過以下方法實現:稱取擬南芥種子，加入純凈水(擬南芥種子:純凈水=5mg:1mL)，震蕩，離心，取上清，為外層黏液層；用純凈水清洗種子3?5次，去除殘留的外層黏液層，最后加入純凈水(擬南芥種子:純凈水=5mg:ImL)。
[0021 ]所述的震蕩的條件優選為置于150rpm的搖床上震蕩5?1min;
[0022]所述的離心的條件優選為2000?5000rpm離心Imin;
[0023]步驟(3)中所述的內層黏液層的提取溶劑為水;優選為純凈水；
[0024]步驟(3)中所述的超聲波的振幅為20?80%;優選為60%。
[0025]步驟(3)中所述的內層黏液層的提取通過以下方法實現:取步驟(2)中去除外層黏液層的種子，超聲處理，靜置或離心，待種子沉到試管底部后，取上清，為內層黏液層。
[0026]所述的超聲處理是置于超聲波破碎儀(Sonics VCX130PB，裝備有3mm探頭，振幅60%)進行超聲處理；
[0027]所述的超聲處理的時間優選為1S?2min ；優選為20S?60S ；更優選為20S ；
[0028]所述的靜置的時間優選為I?5min;
[0029]所述的離心的條件優選為2000?5000rpm離心lmin;
[0030]步驟(4)中所述的水解的條件優選為121°C條件下水解0.5?lh。
[0031]步驟(4)中所述的三氟乙酸水解通過以下方法實現:取步驟(2)得到的外層黏液層和步驟(3)得到的內層黏液層，分別加入三氟乙酸，在121°C條件下水解0.5?lh。
[0032]所述的外層黏液層或內層黏液層與三氟乙酸的體積比優選為5:1;
[0033]步驟(5)中所述的高速離心的條件優選為12000rpm離心5?1min;
[0034]步驟(6)中所述的測定結晶纖維素含量通過以下方法實現:對步驟(5)得到的沉淀，加入70 %硫酸，置于室溫下水解Ih后加入純凈水，使硫酸濃度為17.5%;取用17.5%的硫酸梯度稀釋成O，10，20，40，60，80，150，200yg/mL的葡萄糖標準溶液，加入預冷的0.2%蒽酮濃酸溶液，立即搖勻并置于冰上冷卻；所有樣品準備好后置于沸水浴中15min。以上樣品冷卻后后，置于分光光度計下測定620nm吸光值，制作標準曲線，計算樣品中結晶纖維素含量。
[0035]步驟(7)中所述的硫酸苯酚法測定糖含量通過以下方法實現:取步驟(4)得到的水解液，加入5 %苯酚，加入濃硫酸，立即搖勻；取梯度稀釋成O，10，20，40，60，80，150，200yg/mL的葡萄糖標準溶液，加入5 %苯酚，加入濃硫酸，立即搖勻。以上樣品溫室放置Ih后，置于分光光度計下測定490nm吸光值，制作標準曲線，計算樣品糖含量。
[0036]步驟(8)中所述的釕紅染色通過以下方法實現:配制0.01% (w/v)的釕紅染色液，對種子進行染色5min，洗去染色液后置于體視顯微鏡下觀察。
[0037]本發明相對于現有技術，具有如下的優點及效果:
[0038](I)經濟、簡化勞動。提取溶液為水，無需進行脫鹽處理便可得到大量的種皮黏液層，而酸堿鹽法提取時，殘留的鹽分需要去除。
[0039](2)節省時間。震蕩法和酸堿鹽法提取時間一般為I?2h，后期還需要進行脫鹽，本方法可在20S完成提取。
[0040](3)提取效率高。震蕩法和酸堿鹽法提取過后的種子經釕紅染色后顯示有大量黏液層殘留，而本方法提取后，基本無黏液層殘留。
[0041]本發明為高效提取擬南芥內層黏液層成分提供了一種可靠的途徑，在科學研究中，高效提取的擬南芥黏液層可使黏液層的分析更加精確，推動黏液層形成機理的研究，在化工行業中，本方法可縮短提取時間，減少成本。超聲波提取技術現已應用于很多行業，但在擬南芥這種特殊的模式植物中還沒有報道。
【附圖說明】
[0042]圖1是不同提取方式處理后擬南芥黏液層的釕紅染色。
[0043]圖2是不同提取方式對擬南芥黏液層多糖的提取量。
[0044]圖3是擬南芥種子經不同時間超聲處理后的釕紅染色。
[0045]圖4是擬南芥種子經不同時間階段超聲處理后糖的提取量。
[0046]圖5是擬南芥種子熒光免疫觀察;其中，A?D為超聲處理前，E?H為超聲處理后。
[0047]圖6是硫酸苯酚法測定總糖標準曲線。
[0048]圖7是蒽酮法測定結晶纖維素含量。
[0049]圖8是擬南芥種子黏液層各成分含量。
【具體實施方式】
[0050]下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。
[0051]所述技術領域的普通實驗人員依據以上本發明公開的內容和各參數所取范圍，均可實現本發明的目的。
[0052]下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件。
[0053]所述的擬南芥種子為野生型擬南芥(Arabidopsis thaliana)Col_0種子，購自Arabidopsis B1logical Resource Center(ABRC，https://abrc.0su.edu/)。
[0054]實施例1:不同提取方式對擬南芥黏液層的提取效率研究
[0055](I)提取試劑的配制:用純凈水配制以下提取試劑:0.05M EDTA,0.2%草酸銨(w/v)，0.01M Na0H，0.05M HCl。
[0056](2)不同化學提取試劑對擬南芥黏液層的提取:準確稱取5mg擬南芥種子，加入ImL純凈水，置于150rpm搖床上搖5min，3000rpm離心后，取上清，為外層黏液層。用純凈水清洗種子3遍，加入ImL對應試劑:純凈水，0.05M EDTA,0.2%草酸銨(w/v)，0.0IM NaOH，0.05MHCl，在40 0C搖床上200rpm搖Ih，3000rpm離心后，取上清，為內層黏液層。
[0057](3)超聲處理對擬南芥黏液層的提取:準確稱取5mg擬南芥種子，加入ImL純凈水，置于150rpm搖床上搖5min，3000rpm離心后，取上清，為外層黏液層。用純凈水清洗種子3遍，加入ImL純凈水，超聲處理20S，2000rpm離心后，取上清，為內層黏液層。
[0058](4)釕紅染色:步驟(2)和步驟(3)處理后的種子用純凈水洗3次，進行釕紅染色，最后置于體視顯微鏡下觀察，結果見圖1。由圖1可知，用化學試劑提取后，大部分黏液層還在種子上，并且經過NaOH提取后，大部分種子出現種皮碎裂的現象，種皮破裂有可能導致種子內部的糖類被抽提出來，導致結果不準確。而經過超聲處理20S后，擬南芥種子上的黏液層幾乎全部消失。
[0059](5)按照實施例4的方法進行總糖測定，測定結果見圖2。由圖2可知，用各種化學試劑來進行提取時，得到的黏液層多糖要明顯少于超聲法。
[0060]實施例2:超聲提取擬南芥黏液層
[0061 ] (I)外層黏液層的提取:準確稱取5mg擬南芥種子，加入ImL純凈水，置于150rpm搖床上搖5min，3000rpm離心后，取上清，為外層黏液層。
[0062](2)同一管種子樣品經歷不同超聲階段的黏液層提取:步驟(I)中的種子，累積超聲5S，1S，20S，40S，lmin，2min，4min，6min后，分別取上清，為內層黏液層，每次超聲間隔用純凈水清洗種子兩次。
[0063](3)同一管種子樣品經歷不同超聲階段后黏液層變化:步驟(I)中的種子，累積超聲03，53，103，203，403，11^11，21^11，41^11，61^11后，分別取種子，每次超聲間隔用純凈水清洗種子兩次。
[0064](4)對步驟(I)和步驟(3)獲得的種子進行釕紅染色，染色結果見圖3。由圖3可知，在超聲處理20S時，絕大多數種子的黏液層已消失，但在超聲4min時，出現種皮破碎，說明超聲的時間對種子的影響很大，為了防止種皮破碎，應將超聲時間控制在2min以內。
[0065](5)對步驟(I)和步驟(2)獲得的黏液層分別按照實施例4的方法進行總糖測定，測定結果見圖4和圖8，由圖4可知，在超聲20S時，絕大多數黏液層多糖已提取出，在超聲4min后，由于種皮破碎，糖含量又開始上升，因此，超聲處理20S是最為合理的處理時間，由圖8可知，擬南芥外層黏液層含量約為15.56mg/g，內層黏液層含量約為21.66mg/g。
[0066]實施例3:擬南芥種子黏液層的熒光觀察
[0067](I)擬南芥種子用水搖5min去除外層黏液層后，用0.1M磷酸鹽緩沖液(PhosphateBuffer Solut1n,PBS；lL:0.218g KH2P04，I.463g K2HP04，29.22g NaCl，pH 7.2)清洗 2次，每次5min;
[0068](2)用新鮮的5% (w/v)脫脂牛乳浸泡種子，置于慢速搖床上搖動lh;去除脫脂牛乳，并用PBS緩沖液洗滌種子5min;
[0069](3)一抗孵育:用稀釋20倍的小鼠抗RG I抗體CCRC_M14(Complex CarbohydrateResearch Center)孵育種子lh，用PBS緩沖液洗滌種子5次以洗凈未結合的一抗；
[0070](4)二抗孵育:用稀釋50倍的FITC-羊抗小鼠抗體(康為世紀，貨號CWOl 13S)孵育Ih，用PBS緩沖液洗滌種子5次以洗凈未結合的二抗；
[0071](5)用0.01 %S4B(w/v,Direct Red 23,Sigma Aldrich，用20mM NaCl配制)復染5min，用PBS緩沖液洗滌種子5次；
[0072](6) Ca Icofluor 染色:取步驟(3)的種子，用 25yg/mL 的 Ca lcofluor (SigmaAldrich，用PBS 配制)染色 5min。
[0073](6)將制備好的樣品置于激光共聚焦顯微鏡(Zeiss LSM710，RG I 490nm，S4B552nm，Calcofluor 405nm)下觀察拍照，結果見圖5，由圖5可知，超聲處理后，擬南芥種皮表面的纖維素和RG I成分絕大多數都被去除，只有少量的纖維素和RG I殘留(箭頭)。
[0074]實施例4:硫酸苯酚法測定總糖
[0075](I)標準曲線繪制:精確配制濃度分別為O，10，20，40，60，80，100，150，200yg mL-1的葡萄糖溶液，每個標準溶液取300yL，加入150yL新配制的5 %苯酚溶液，加入1.5mL濃硫酸，立即混勻，室溫放置Ih后用紫外可見光分光光度計(上海美譜達UV-1200)在490nm波長下測量吸光值，繪制標準曲線(圖6)，得到回歸方程為y = -0.0134+0.02991*x。
[0076](2)樣品測定:按照步驟(I)的方法，測定實施例1、2中樣品的吸光值，根據標準曲線求得各樣品的糖含量。
[0077]實施例5:結晶纖維素含量測定
[0078](I)黏液層結晶纖維素的獲得:稱取5mg種子，加入ImL純凈水，搖動5min后去除上清，清洗兩次后加入ImL水，60 %振幅超聲處理20S，靜置使種子沉到底部后取上清。加入200yL三氟乙酸，121°C水解Ih，12000rpm離心5min后取結晶纖維素沉淀，用純凈水洗3次。對獲得的結晶纖維素樣品進行硫酸水解，WAHOyL 70%的硫酸，水解Ih，中間用移液器吹打5次，最后加入420yL純凈水，使硫酸最終濃度為17.5 V0o
[0079](2)結晶纖維素含量測定:用17.5%的硫酸溶液精確配制濃度分別為0，10，20，40，60，80，100，150，200yg mL—1的葡萄糖溶液，標準樣品和樣品分別取560yL，加入1.4mL用濃硫酸新配制的預冷的0.2%蒽酮試劑，搖勻后立即放冰上，全部樣品加完后置于沸水浴中處理15min。最后用紫外可見光分光光度計(上海美譜達UV-1200)在620nm波長下測量吸光值，繪制標準曲線(圖7)，得到回歸方程為y = 0.00736+0.02267*x。根據標準曲線求得樣品中的結晶纖維素含量，結果見圖8，由結果可知，擬南芥黏液層結晶纖維素含量大約為3.71mg/g。
[0080]上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1.一種高效提取擬南芥黏液層的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)獲得干燥的擬南芥種子； (2)提取擬南芥種子的外層黏液層； (3)取步驟(2)中去除外層黏液層的種子，利用超聲波進行超聲處理，獲得內層黏液層。2.根據權利要求1所述的高效提取擬南芥黏液層的方法，其特征在于還包括如下步驟: (4)對步驟(2)得到的外層黏液層和步驟(3)得到的內層黏液層分別進行三氟乙酸水解； (5)對步驟(4)得到的水解液進行高速離心，分別取上清和沉淀； (6)對步驟(5)得到的沉淀用蒽酮法測定結晶纖維素含量； (7)利用硫酸苯酚法測定步驟(4)得到的水解液中的糖含量，對照標準曲線，計算得到黏液層中的糖含量； (8)對步驟(2)、(3)處理后的種子進行釕紅染色。3.根據權利要求1或2所述的高效提取擬南芥黏液層的方法，其特征在于: 步驟(2)中所述的外層黏液層的提取溶劑為水。4.根據權利要求1或2所述的高效提取擬南芥黏液層的方法，其特征在于: 步驟(2)中所述的提取的條件為置于150rpm的搖床上震蕩5?lOmin。5.根據權利要求1或2所述的高效提取擬南芥黏液層的方法，其特征在于: 步驟(3)中所述的內層黏液層的提取溶劑為水。6.根據權利要求1或2所述的高效提取擬南芥黏液層的方法，其特征在于: 步驟(3)中所述的超聲波的振幅為20?80 %。7.根據權利要求1或2所述的高效提取擬南芥黏液層的方法，其特征在于: 所述的超聲處理的時間為1 S?2min。8.根據權利要求1或2所述的高效提取擬南芥黏液層的方法，其特征在于: 所述的超聲處理的時間為20S?60S。9.根據權利要求2所述的高效提取擬南芥黏液層的方法，其特征在于: 步驟(4)中所述的水解的條件為121°C條件下水解0.5?lh。10.根據權利要求2所述的高效提取擬南芥黏液層的方法，其特征在于: 步驟(5)中所述的高速離心的條件為12000rpm離心5?1min。
【文檔編號】C08B37/00GK105820266SQ201610253398
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年4月20日
【發明人】吳藹民, 趙先海, 喬立君, 陳曉陽
【申請人】華南農業大學