一種抗basigin人源化抗體及其應用
【專利摘要】本發明公開了一種抗BASIGIN人源化抗體及其應用，該抗體包含免疫球蛋白輕鏈可變區和免疫球蛋白重鏈可變區，所述的免疫球蛋白輕鏈可變區包含CDR1：如序列表中SEQ ID NO:13所示；CDR2：如序列表中SEQ ID NO:14所示；CDR3：如序列表中SEQ ID NO:15所示；所述的免疫球蛋白重鏈可變區包含CDR1：如序列表中SEQ ID NO:16所示；CDR2：如序列表中SEQ ID NO:17所示；CDR3：如序列表中SEQ ID NO:18所示。所述的抗BASIGIN人源化抗體在制備治療肺癌、肝癌和結直腸癌藥物中的應用；所述的抗BASIGIN人源化抗體在制備治療瘧疾藥物中的應用。
【專利說明】
一種抗BAS IGIN人源化抗體及其應用
技術領域
[0001] 本發明涉及生物技術領域，具體地說，本發明提供了一種抗BASIGIN人源化抗體及 其應用。
【背景技術】
[0002] BASIGIN(EMMPRIN、Neurothelin、M6antigen、BASIGIN)是一種高度糖基化的、分子 量為50~60kD的跨膜糖蛋白，屬免疫球蛋白超家族(IgSF)成員。在人類，BASIGIN共有269個 氨基酸組成，可分為胞外區、跨膜區及胞內區。N端起始翻譯后前21個殘基為信號肽，22~ 205構成胞外區，206~229為跨膜區，具有典型的亮氨酸拉鏈結構，C端230~269為胞內區。 已證實BASIGIN在許多類型的人實體瘤，如肺癌、肝癌、宮頸癌、結腸癌、乳腺癌、卵巢癌、食 管癌或胃癌中過度表達。
[0003] 既往研究表明，BASIGIN分子是腫瘤發展過程重要的功能性膜蛋白，參與多種與癌 癥有關的現象，如：
[0004] ①BASIGIN介導腫瘤細胞的粘附和運動：腫瘤細胞表面表達的BASIGIN與Vinci in 相互作用，促進腫瘤細胞偽足形成，鋪展及粘附；與膜聯蛋白annxin II相互作用，促進腫瘤 細胞MMP-2分泌，增強腫瘤細胞運動能力和侵襲潛能;通過刺激腫瘤細胞自身及其周圍的成 纖維細胞，分泌多種基質金屬蛋白酶（extracellular matrix metalloproteinase，MMP)， 包括MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-11以及MT1 -MMP和MT2-MMP等，從而加快腫瘤周圍基質的降 解，促進了腫瘤的轉移。
[0005] ②BASIGIN參與腫瘤細胞的無氧代謝:BASIGIN是單羧酸轉運體(monocarboxylate transporter)MCT-l和MCT-4的重要分子伴侶。BASIGIN可以與MCT-1和MCT-4相互結合，輔助 它們在細胞膜上正確定位，并繼續調節它們對乳酸代謝產物的轉運功能。由于腫瘤細胞主 要依靠無氧代謝產生能量，因此BASIGIN可間接通過影響MCT的表達和功能調節腫瘤細胞的 能量代謝。
[0006] ③BASIGIN促進腫瘤細胞耐藥:BASIGIN分子在通過共表達調節機制影響MDR基因 的轉錄，促進P -g的表達，從而可誘導腫瘤的多藥耐藥。Kanekura等證實BASIGIN通過P-g導 致MDR，所以下調BASIGIN的表達可能是一個有效抵制MDR的靶點。另外，BASIGIN促進p-TFII-I細胞核內定位，上調未折疊蛋白反應(UPR)的關鍵因子Bip表達，引起腫瘤細胞內質 網應激和UPR，從而抑制凋亡及對藥物的不敏感性，抑制BASIGIN分子可促進肝癌細胞凋亡， 并可增強腫瘤細胞對現有抗腫瘤藥物的敏感性。
[0007] ④BASIGIN上調VEGF表達促進腫瘤新生血管形成，抑制BASIGIN的表達，能夠顯著 抑制VEGF的分泌和腫瘤血管的生成。
[0008] ⑤BASIGIN結合多種分子參與相互作用:BASIGIN蛋白的跨膜段存在一個在進化上 高度保守的負電荷谷氨酸，是其可以與多種細胞膜蛋白發生相互作用的結構基礎，同時也 提示BASIGIN可以通過與多種蛋白的相互作用，影響細胞的多種生理活動。BASIGIN可以通 過與0)98、1]1丨681'；[11、03￥601；[11-1、05^1(^11；[1；[118(05^)等多種蛋白相互作用，從能量代謝、 細胞-基質相互作用、信號傳導等多個方面影響腫瘤細胞的生長和轉移過程。
[0009] 此外，多項回顧性研究還表明BASIGIN分子在腫瘤組織中的表達強度與腫瘤病人 的預后之間，存在著緊密的相關性。在非小細胞肺癌病人中，BASIGIN表達增高的水平與病 人的預后情況密切相關。
[0010] 因此，BASIGIN分子已成為腫瘤治療的新靶點，其中抗體藥物"利卡汀"的研制成 功，證明了該靶點成藥的安全性和有效性。
[0011] 此外，紅細胞上表達的BASIGIN通過與惡性瘧原蟲的棒狀體蛋白PfRh5以配體-受 體的方式發生相互作用，介導了原蟲與紅細胞的遠端識別，是惡性瘧原蟲入侵紅細胞的關 鍵環節。PfRh5與紅細胞上的BASIGIN分子的相互作用在不同惡性瘧蟲株是普遍存在的，提 示靶向紅細胞上的BASIGIN分子有望成為抗瘧新藥的重要靶點。新型的抗人紅細胞的 BASIGIN分子的抗瘧藥物與傳統的抗瘧化學藥物共同使用，能夠克服化療藥物的耐藥性。
[0012] 單克隆抗體(McAb)以其高特異性、高親和力、毒副作用小、免疫原性低、體內作用 時間長、可利用體內自身免疫系統發揮療效等優點，在許多疾病的診療中得到廣泛應用，成 為新型藥物研制的一條有效途徑。然而，鼠源McAb重復注入人體內會引起患者誘發人抗鼠 抗體(human anti mouse antibody，HAMA)反應，出現全身過敏毒性反應并阻斷抗體功效的 發揮。因此，人源抗體和人源化抗體以其特有的優勢越來越成為抗體藥物研發的主流趨勢。 [0013]本發明基于以上的研究背景，通過噬菌體抗體庫篩選高親和力的新型抗BASIGIN 人源抗體，并通過實驗驗證其生物學活性。
【發明內容】
[0014]針對現有技術中的缺陷和不足，本發明的目的是提供一種抗BASIGIN人源化抗體 及其應用。
[0015]第一方面，本發明提供了三種抗人BASIGIN人源化抗體，分別命名為單克隆抗體 HP6H8-1、單克隆抗體HP6H8-2和單克隆抗體HP6H8-3，其均包含免疫球蛋白輕鏈可變區和免 疫球蛋白重鏈可變區；
[0016] (1)免疫球蛋白輕鏈可變區包含CDR1:如序列表中SEQ ID ^):13所示{01?2:如序 列表中3￡0 10從)：14所示;〇)1?3:如序列表中5￡0 10從)：15所示；
[0017] ⑵免疫球蛋白重鏈可變區包含CDR1:如序列表中SEQ ID如：16所示;0)1?2:如序 列表中3￡0 10從)：17所示;〇)1?3:如序列表中5￡0 10從)：18所示；
[0018] 在一個優選實例中，單克隆抗體HP6H8-1包含如SEQ ID N0:1所示的輕鏈可變區氨 基酸序列和如SEQ ID N0:3所示的重鏈氨基酸序列；該抗體的親和性KD = 9.05X 10-nM。 [0019] 在一個優選實例中，單克隆抗體HP6H8-2包含如SEQ ID N0:5所示的輕鏈可變區氨 基酸序列和如SEQ ID N0:7所示的重鏈氨基酸序列；該抗體的親和性KD = 5.83X 10-nM。
[0020] 在一個優選實例中，單克隆抗體HP6H8-3包含如SEQ ID N0:9所示的輕鏈可變區氨 基酸序列和如SEQ ID N0:11所示的重鏈氨基酸序列；該抗體的親和性KD = 1.02X 1(T1QM。 [0021 ]本發明的另一目的在于提供編碼上述重組人源化抗體的DNA分子。
[0022] 在一個優選實例中，單克隆抗體HP6H8-1輕鏈可變區核苷酸序列為SEQ ID N0: 2所 示的序列，重鏈可變區的核苷酸序列為SEQ ID NO: 4所示的序列，該抗體的親和性KD = 9.05 X10-nM;
[0023] 在一個優選實例中，單克隆抗體HP6H8-2輕鏈可變區核苷酸序列為SEQ ID N0:6所 示的序列，重鏈可變區的核苷酸序列為SEQ ID NO: 8所示的序列，該抗體的親和性KD = 5.83 X10-nM;
[0024] 在一個優選實例中，單克隆抗體HP6H8-3輕鏈可變區核苷酸序列為SEQ ID NO: 10 所示的序列，重鏈可變區的核苷酸序列為SEQ ID N0:12所示的序列，該抗體的親和性KD = 1.02X10-10M〇
[0025]在一個優選實例中，上述抗體的輕鏈恒定區為k，重鏈恒定區為IgG2組成，然而本 發明也保護其它抗體的同種型，如I gG 1，I gG3，I gG4，I gM，I gA 1，I gA2，I gD，I gE。本發明也保 護抗體的抗原結合片段，包括Fab，Fv，scFv和單鏈抗體。
[0026]本發明的另一個目的在于提供抗BASIGIN人源化單克隆抗體的表達載體，使通過 G418篩選獲得抗BASIGIN單克隆抗體的輕、重鏈基因同時高表達的重組CH0細胞克隆。
[0027]本發明的另一個目的還在于提供了一種制備所述抗BASIGIN單克隆抗體的方法， 該方法包括：
[0028] a)提供所述抗BAS IGIN單克隆抗體的DNA分子；
[0029] b)提供一種表達載體，該載體含有步驟a)中所述的DNA分子及表達該DNA分子的調 控序列；
[0030] c)用步驟a)中所述的表達載體轉化宿主細胞，特別是哺乳動物細胞，優選的是CH0 細胞；
[0031] d)在適合所述單克隆抗體的培養條件下培養步驟c)中所得的宿主細胞和分離純 化步驟c)中所表達的所述單克隆抗體。
[0032] 本發明的另一目的，抗人BASIGIN人源化抗體在制備治療BASIGIN表達相關疾病藥 物中的應用，BASIGIN表達相關疾病包括肺癌、肝癌、結腸癌和瘧疾4。
[0033] 為克服鼠源McAb重復注入人體內會引起患者誘發人抗鼠抗體(human anti mouse antibody，HAMA)反應，出現全身過敏毒性反應并阻斷抗體功效的發揮的缺點，本發明采用 噬菌體展示抗體文庫技術、計算機輔助抗體結構設計等技術，以分泌抗人BASIGIN分子的鼠 源性抗體6H8(又名HAbl8GC2)的雜交瘤細胞株HAbl8Gedomab2(保藏號CCTCC-C200636,詳見 專利號：ZL200710007452.2中記載）為基礎，通過生物信息學明確該抗體輕重鏈可變區的 CDR和FR區，利用計算機輔助抗體結構設計手段，設計了人源化抗體的框架區，并應用分子 生物學手段進行了全分子的基因構建，真核表達了抗人BASIGIN人源化抗體。抗體親和力及 免疫組化分析結果表明，抗人BASIGIN人源化抗體親和力優于鼠源性親本抗體，并且維持了 親本抗體識別抗原的特異性。抗人BASIGIN人源化抗體體外抑制惡性瘧原蟲侵襲紅細胞實 驗結果提示了該抗體在治療或預防肺癌、肝癌、結腸癌、瘧疾方面的用途。
【附圖說明】
[0034] 圖1為VH framework中選擇更換的氨基酸；
[0035] 圖2為VL framework中選擇更換的氨基酸；
[0036] 圖3為嵌合抗體和人源化抗體的ELISA分析；
[0037] 圖4為輕鏈基因表達載體pcDNA3.3-LC-N-229-205結構示意圖；
[0038] 圖5為重鏈基因表達載體p0ptivec-HC-D-229-205結構示意圖；
[0039]圖6為抗體表達量結果圖；
[0040]圖7為人源化抗體的HP6H8-1免疫組織化學染色結果；
[00411圖8為人源化抗體HP6H8-1體外抑制惡性瘧原蟲侵襲紅細胞實驗；
[0042]以下結合說明書附圖和【具體實施方式】對本發明做具體說明。
【具體實施方式】 [0043] 一、術語解釋：
[0044] 免疫球蛋白是指一類結構上相關的糖蛋白，該糖蛋白由兩對多肽鏈組成，一對低 分子量的輕鏈(L)和一對高分子量的重鏈(H)，所有四條鏈通過二硫鍵互相連接。每條重鏈 典型地由重鏈可變區（在本文中縮寫為VH)和重鏈恒定區（在本文中縮寫為CH)組成。每條輕 鏈典型地由輕鏈可變區(在本文中縮寫為VL)和輕鏈恒定區（在本文中縮寫為CL)組成。輕鏈 恒定區典型地由一個結構域CL組成。VH和VL可進一步細分成高變的區（或序列上高變的高 變區和/或結構確定的環的形式），也稱為互補決定區（CDR)，中間穿插著較其保守的區，稱 為框架區(FR)。每個VH和VL典型地由三個CDR和四個FR組成，從氨基末端到羧基末端按下面 順序排布，？1?1、001?1、？1?2、0)1?2小1?3丄01?3、？1?4(可參見〇1〇讓13和1^81^，1987)。典型地，在這 區中氨基酸殘基的編號可通過Kabat等人， SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，5thEd，Pub 1icHealthService， NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD. (1991)(短語可變結構域殘基編號，如Kabat 中或根據Kabat，在本文中指用于重鏈可變結構域或輕鏈可變結構域的這種編號系統）中描 述的方法執行。
[0045] "人源化抗體"，如在本文中使用的，在本文中指來源于非人抗體，典型地鼠科動物 的抗體，該抗體保留或基本保留親本抗體(parent antibody)的抗原結合的性質但它在人 中的免疫性低。由于本發明抗體由結構和功能特征限定，因此"人源化抗體"可與"抗體"交 換使用。
[0046]互補決定區（CDR)，如在本文中使用的，是指多種氨基酸序列，該多種氨基酸序列 共同限定免疫球蛋白結合位點的可變片段(Fv)區的結合親和力和特異性。
[0047] 框架區（FR)，如在本文中使用的，是指插入在CDR之間的氨基酸序列。抗體的這些 部分用來將CDR保持在適當的位置(允許CDR結合抗原）。輕鏈可變區和重鏈可變區均包含框 架區（FR)和典型地三個⑶R。
[0048] 恒定區(CR)，如在本文中使用的，是指賦予效應子功能的抗體分子的部分。題述人 源化抗體的恒定區來源于人免疫球蛋白。重鏈恒定區可選自五種同種型：a、S、e、y或y。進 一步地，各種亞類的重鏈(例如，重鏈的IgG亞類)可引起不同效應子功能，因而，通過選擇期 望的重鏈恒定區，可生產具有期望的效應子功能的抗體。優選的重鏈恒定區是Y l(IgGl)、 y 2(IgG2)、y 3(IgG3)和丫 4(IgG4)，更優選y 2(IgG2)。輕鏈恒定區可以是k或A型，優選為k 型。
[0049] 技術人員應當理解免疫球蛋白重鏈或輕鏈的可變區或恒定區可按照描述的通過 使用標準的重組DNA技術連接，從而創建可在適宜的宿主中被表達(從而產生所述免疫球蛋 白鏈(一種或多種））的多核苷酸，或可通過使用肽化學合成連接的可變區和恒定區。
[0050] 本發明的人源化抗體保存了親本抗體的結合性質的重要部分，即單克隆抗體，該 親本抗體也就是稱為抗人BASIGIN分子的鼠源性抗體6H8，由雜交瘤細胞株HAbl8Gedomab2 產生，該雜交瘤細胞株HAbl8Gedomab2于2006年12月13日保藏在中國典型培養物保藏中心 (CCTCC-C200636,詳見專利號:ZL200710007452.2中記載）。特別地，本發明的抗人BASIGIN 人源化抗體保留了特異性結合親本抗體識別抗原的能力，該親本抗體用于生產此種人源化 抗體。優選地，人源化抗體展現出與親本抗體相同或基本相同的抗體結合親和力 (affinity)和親合力(avidity)。理想地，抗體的親和力(KD)將不大于親本抗體親和力的10 倍。
[0051]技術人員應當理解，"親合力(avidity)"是指兩個分子之間，例如抗體和抗原之間 相互作用的總強度。親合力取決于相互作用的親和力和價態。而且，"親和力"是指分子(例 如，抗體）的單個結合位點與配體(例如，抗原)之間結合的強度。分子X對配體Y的親和力可 由解離常數(Kd)表示，解離常數是占據溶液中存在的一半的X分子的結合部位所需的Y濃 度。更小的Kd表示更強或更高的親和力相互作用，和需要更低的配體濃度來占據該部位。 [0052] "人源化抗體"或"抗體"，如本發明中使用的，包括完整分子以及能與表位決定簇 結合的它們的片段，例如FaKFUl/U和Fv。這些抗體片段保留了選擇性結合到人C5aR的一 些能力，這些片段的實施例包括，但不限于下面：
[0053] (l)Fab，含有抗體分子的單價抗原結合片段的片段，該片段可通過酶木瓜蛋白酶 將全抗體(who leant ibody)降解生成完整的輕鏈和一個重鏈的一部分；
[0054] (2) Fab '，可通過以下方式獲得抗體分子片段，用胃蛋白酶處理全抗體，接著還原， 從而生成完整的輕鏈和重鏈的一部分;每個抗體分子可得到兩個Fab'片段；
[0055] (3)(Fab'）2,可通過用酶胃蛋白酶處理但沒有隨后還原以獲得抗體片段；（Fab)2 是通過兩個二硫鍵結合在一起的兩個Fab '片段的二聚體；
[0056] (4)Fv，定義為含有表示為兩條鏈的輕鏈可變區和重鏈可變區的基因工程片段； [0057]下面將結合實施例進一步詳細地描述本發明。然而應當理解，列舉這些實施例只 是為了起說明作用，而不是用來限制本發明。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說 明，均為常規方法。下述實施例中所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得 到。
[0058] 一、含抗人BASIGIN分子的鼠源性抗體6H8輕、重鏈可變區的噬菌體展示載體的構 建
[0059] 1.材料
[0060] 雜交瘤細胞株HAbl8GC2，為專利
【申請人】于2006年（專利號：ZL200710007452 ? 2)制 備并保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號:CCTCC-C200636。
[0061] 引物：
[0062] VH基因擴增引物：
[0063] 上游引物:pFL-6HB-Fl，見序列表中SEQ ID N0:19;
[0064] 下游引物：linker-Rl，見序列表中SEQ ID N0:20。
[0065] VL基因擴增引物：
[0066] 上游引物：linker-Fl，見序列表中SEQ ID N0:21;
[0067] 下游引物:pFL-6HB-R2,見序列表中SEQ ID N0:22。
[0068] 2.方法和結果
[0069] 2.1總RNA提取：參照總RNA提取試劑盒(Omega bio-tek)說明書抽提雜交瘤細胞 HAb 18GC2中的總RNA。并用瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性。
[0070] 2 ? 2逆轉錄cDNA:取lug2 ? 1 中得到的總RNA，參照PrimeScript RT reagent Kit (TaKaRa)反轉錄試劑盒說明書合成cDNA第一鏈，-20 °C凍存備用。
[0071] 2.3PCR擴增VH基因和VL基因。用2.2制備的cDNA為模板，利用VH基因引物和VL基因 弓丨物分別擴增得到VH基因片段和VL基因片段。擴增體系按Phusion?High-Fidelity DNA Polymerase(NEB)說明書配置。PCR 反應條件：94°C，5min;94°C，15s，54°C，30s，72°C，lmin， 35個循環;72°C，lOmin。1 %瓊脂糖凝膠電泳觀察所擴增片段的大小。
[0072] 2.4scFv基因的擴增：以相同摩爾數混合2.3中得到的VH基因片段和VL基因片段， 利用overlap-PCR擴增scFv基因，擴增體系如下:VH基因片段lpmol，VL基因片段化111〇14?1-6HB-F1(SEQ ID N0:21)100pmol，pFL-6HB-R2(SEQ ID N0:22)100pmol，10XPCR緩沖液 10y LoPCR反應條件：95 °C，5min; 95°C，15s，56 °C，30s，72°C，lmin，35個循環；72°C，lOmin。1 % 瓊 脂糖凝膠電泳觀察所擴增片段的大小。
[0073] 切下目的條帶，使用DNA片段純化劑盒(Omega bio-tek)回收得到含酶切位點Nco I和Not I的scFv基因片段。
[0074] 2.5scFv基因酶切及與載體連接及連接產物轉化:將上述制備的含酶切位點Nco I 和Not I的scFv基因片段及載體質粒pGEM-T載體(Promega)用紫外分光光度計測核酸濃度 后進行酶切。
[0075] 酶切方法包括:取scFv回收產物或pGEM-T載體3yg，加入Nco I-HF和Not I-HF限制 性內切酶(NEB)各1此，10 X CutSmart緩沖液5yL，加水到50yL，37°C酶切lh。1 %瓊脂糖凝膠 電泳切下目的條帶，進行膠回收，方法同2.4得到酶切后的scFv回收產物。
[0076] 取酶切后的scFv回收產物0.7yg，酶切后的載體pGEM-T 1.4yg，T4連接酶40U，5 X 連接緩沖液40yL，16°C連接過夜。取連接產物轉化TG1感受態細胞。涂布于LB瓊脂平板上，37 °(：培養過夜。第二天，隨機挑取10個單克隆，利用載體通用引物進行陽性克隆菌落鑒定;挑 取5個陽性克隆，進行測序驗證，測序正確的克隆保存于-40 °C備用，獲得含有完整6H8輕重 鏈可變區基因的s cFv基因表達載體pFL-6H8。
[0077] 二、限定鼠源性抗BAS IG IN單克隆抗體6H8的⑶R和框架殘基
[0078] 用醫w. expasy. org在線軟件將編碼抗BASIGIN的鼠源性抗體6H8，又名HAbl8GC2單 克隆抗體(專利號：ZL200710007452.2)的輕、重鏈可變區核苷酸序列翻譯為其編碼的氨基 酸序列。根據Kabat數據庫確定輕鏈可變區序列中的互補決定區CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸 序列分別如序列表中3￡〇10^):13、3￡〇10勵：14和3￡〇10勵：15所示。重鏈可變區序列中 的互補決定區CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別如序列表中SEQ ID N0:16、SEQ ID N0: 17和SEQ ID NO: 18所示。
[0079]三、挑選合適的人抗體框架序列
[0080]為了挑選合適的小鼠CDR移植在其上的人抗體框架序列，本發明人借助源自Kabat 蛋白質數據庫提供的抗體序列構建的人源抗體序列信息數據庫；利用Discovery Studio (VI0VIA，version 3.5)，通過同源模建、力學優化技術對人源化前后的抗體分子結構進行 分析及替換，確保被替換的氨基酸不會改變VH和VL的整體骨架結構，特別是不會破壞0-strand二級結構，從而保持抗體原有親和力。并將人源抗體序列信息數據庫中人源抗體可 變區框架與前述的CDR進行拼接，篩選合理的抗體可變區，結果獲得如圖1所示的VH framework和如圖 2所不的 VLframework 〇。
[0081 ]四、噬菌體展示BASIGIN人源化抗體文庫的構建和篩選
[0082] 根據三獲得的抗體序列及計算機模擬獲得的抗體氨基酸序列，包括輕鏈可變區氨 基酸序列SEQ ID N0:1，SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:9,重鏈可變區氨基酸序列SEQ ID N0:3， SEQ ID N0:7和SEQ ID NO: 11。選擇在哺乳動物細胞中常用的密碼子進行反向翻譯，獲得相 應的抗體基因核苷酸序列。利用基因全合成PCR技術，設計相應的引物，通過重疊PCR的方法 獲得全長基因；克隆入克隆載體，進行序列測定。
[0083] 1.材料
[0084] 一中所得到的抗BASIGIN鼠源ScFv克隆引物：
[0085]人源化VH基因擴增引物：
[0086] 上游引物:6H8-L1_F1，見序列表中SEQ ID N0:23;6H8-L1_F2,見序列表中SEQ ID N0:25;6H8-L1_F3,見序列表中SEQ ID N0:27;
[0087] 下游引物:6H8-L1_R1，見序列表中SEQ ID N0:24;6H8-L1_R3,見序列表中SEQ ID 勵：26;6118-11_1?4，見序列表中5￡〇10勵：28;6118-11_1?2，見序列表中5￡〇10勵：33 ;6118-L1_R5,見序列表中SEQ ID N0:34;
[0088]人源化VL基因擴增引物：
[0089] 上游引物：6H8-L1_F4,見序列表中SEQ ID N0:29;6H8-L1_F6,見序列表中SEQ ID N0:31;6H8-L1_F5,見序列表中SEQ ID N0:36;
[0090] 下游引物：6H8-L1_R6,見序列表中SEQ ID N0:30;6H8-L1_R8,見序列表中SEQ ID N0:32;6H8-L1_R7,見序列表中SEQ ID N0:35;
[0091] 2.利用以上引物進行PCR擴增目的片段：
[0092]擴增方案如下：
[0093] 2.1以pFL-6H8 為模板，分別以6118-11_卩1+6118-11_1?1、6118-11_卩2+6118-11_1?3、6118-L1_F3+6H8-L1_R4、6H8-L1_F4+6H8-L1_R6、6H8-L1_F6+6H8-L1_R8 為引物對，擴增目的基因； 反應條件為 95°(：，31^11;95°(：，3〇86(3;55°(：，3〇86(3;72°(：，4〇86(3 ;40個循環，最后72°(：延伸， lOmiruPCR反應結束后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳純化回收PCR產物并連入pMD18-T載體 (TaKaRa)。將測序正確的片段分別命名為6H8-L1-1片段、6H8-L1-2片段、6H8-L1-3片段、 6H8-L1-4 片段和 6H8-L1-5 片段。
[0094] 2.2分別以2.1中獲得的6118-11-1片段、6118-11-2片段、6118-11-3片段、6118-11-4片 段和 6H8-L1-5 片段為模板，以 6H8-L1_F1+6H8-L1_R2、6H8-L1_F2+6H8-L1_R5、6H8-L1_F4+ 6H8-L1_R7、6H8-L1_F5+6H8-L1_R8為引物，擴增目的基因；反應條件同2.1JCR反應結束后， 利用1 %瓊脂糖凝膠電泳純化回收PCR產物并連入pMD 18-T載體(TaKaRa)，篩選陽性克隆測 序驗證，將測序正確的片段分別命名為6H8-L1-6片段、6H8-L1-9片段、6H8-L1-7片段和6H8-L1-8片段。
[0095] 2 ? 3 ?以2 ? 2中獲得的 6H8-L1-6 片段和 6H8-L1-9 片段為模板，以 6H8-L1_F1+6H8-L1_ R5為引物，擴增目的基因，反應條件同2.1，測序結果命名為6H8-L1-10片段；以6H8-L1-7片 段和6H8-L1-8片段為模板，以6H8-L1_F4+6H8-L1_R8為引物，擴增目的基因，反應條件同 2.1，測序結果命名為6H8-L1-11片段;反應條件同2.1。
[0096] 2.4?以 2.3 中獲得的 6H8-L1-10 片段和 6H8-L1-11 片段為模板，以 6H8-L1_F1+6H8-L1_R8為引物，擴增目的基因，測序結果命名為6H8-L1-12片段;反應條件同2.1。
[0097] 2.5.用NcoI-HF和Notl-HF(NEB)分別對PCR擴增的6H8-L1-12片段進行酶切，經1% 瓊脂糖電泳分離后，用Gel Extraction Kit(0mega bio-tek)純化酶切片段。然后，將純化 獲得的酶切片段與同酶切的噬菌體載體pComb3XSS用T4DNA連接酶(TaKaRa公司）進行連接， 去離子后電轉化TG1感受態細胞。接種于LB培養平板上進行克隆篩選。統計6H8-L1抗體噬菌 體文庫庫容，保存庫于-80°C備用。
[0098] 2.6 6H8-L1噬菌體展示抗體庫的淘選
[0099]利用固相淘選方法對6H8-L1抗體噬菌體文庫進行抗原特異性淘選。具體操作如 下：
[0100] 復蘇6H8-L1抗體噬菌體文庫于60ml的2YT培養基中，于37°C搖床中培養至0D600 = 0.3-0.4。加入M13K07輔助噬菌體(Invitrogen);37°C靜置孵育30分鐘，搖床孵育60分鐘。離 心1500轉/10分鐘，棄上清，用60ml的50ug/ml卡那霉素(無葡萄糖）的培養基重懸細胞，并于 30°C搖床中過夜培養;離心12000轉/10分鐘沉淀噬菌體文庫，轉移上清至離心管中，30ml/ 管。向每支離心管加入7.5ml PEG/NaCl，混合均勻，置于冰上lh。離心，12000轉，5分鐘，棄上 清；用2.2ml含有PBS-5%BSA的溶液重懸噬菌體，離心，12000轉，5分鐘，去除細胞碎片。 [0101]用表達的BASIGIN分子包板進行親和篩庫，經過5輪的淘選(吸附-洗脫-擴增），每 一輪淘選的抗原包被濃度依次遞減（lug/ml、0. lug/ml、0.01ug/ml、0.001ug/ml、0.0001ug/ ml)。淘選進行至S/N小于10時（S/N表示為信噪比），終止淘選實驗，挑取768個克隆，誘導表 達，獲得scFv抗體用于Elisa檢測。
[0102] 五、ELISA分析及測序分析
[0103] 用包被緩沖液（200mM Na2C〇3/NaHC〇3，pH 9.2)將8六516預稀釋為1邱/1111，每個反應 孔中加50yl，4°C包被過夜;棄去反應孔中溶液，用lXroS緩沖液洗滌3次，加200yl封閉緩沖 液(2%BSA/1XPBS buffer)室溫下封閉lh;用200yl 1XPBS緩沖液洗滌3次；加入含scFV抗體 的細胞培養上清(8塊96孔微孔板)和陰性對照（50yl/孔），室溫溫育2h;用200yl IX PBS緩 沖液洗滌3次；加入用封閉緩沖液稀釋（1:2500)的Anti-c-Myc Ab(HRP)(Abcam Cat# abl9312，50yl/孔），室溫溫育lh;用200yl用lXroS緩沖液洗滌6次;在各反應孔中加入TMB底 物溶液(50yl/孔)反應10min;加入終止溶液(2M HCl，50yl/孔）以終止反應;用ELISA讀板儀 讀取450nm的吸光值；
[0104]根據ELISA的結果，選取A450>2.0的123個克隆送測序(測序工作由上海博尚生物 技術有限公司完成）。
[0105] DNA序列分析：參照人類抗體的germl ine數據庫和http : //www ? bioinf ? org ? uk/ abs/shab/評價序列的人源化程度。選擇人源化程度的最好的26個scFV分子進行親和力排 序(表1)。
[0106]六、利用SPR測定ScFv抗體親和力 [0107] 1.SPR結合分析方法
[0108] 利用ProteOn XPR36(Bi〇-Rad，XPR36)儀器進行抗體的親和力測定。用0.04M EDC+ 0.01M sulfo-NHS(Bio-Rad)活化GLC芯片（Bi〇-Rad，1765011)。用 10mM NaAc(pH 4.5)稀釋 BASIGIN至10mM，并以30ul/min的速度注射到芯片上，使抗原與被活化的芯片通過氨基偶 聯。最后用1M ethan〇lamine-HCl(Bi〇-Rad)滅活芯片；芯片轉動90度后用緩沖液（PBS/ 0.005%Tween 20)沖洗至基線平穩。在6個水平通道上分別注射5個含有ScFv抗體的細胞培 養上清。進樣速度為30ul/min。樣品結合時間為60s，解離時間為900s;利用朗繆爾動力學 (Kinetic-Langmuir)模型進行數據分析。
[0109] 2 ?結果
[0110] 使用SPR實時監測BASIGIN與含有ScFv抗體的TG1上清的結合，通過測定解離速率 常數GWf)反映BASIGIN與人源化ScFv抗體親和力大小。結果見表1。發明人選取了 Kc^值最 小的5個編號分別為11188,11214，11242，11245和11305的人源化ScFv進行完整抗體的構 建。
[0111] 表1SPR測定ScFv抗體親和力結果
[0114] 七、全人源化抗體構建
[0115] 1 ?材料
[0116] 1.1模板:根據前述親和力排序的結果，五個克隆接種過夜培養，分別提取質粒，測 序確認模板序列正確。
[0117] 1.2 引物：
[0118] 全人源化抗體VL基因擴增引物：
[0119] 上游引物:PCI-wbp229_Fl，見序列表中SEQ ID N0:37;
[0120] 下游引物:pCI-6H8_R8,見序列表中SEQ ID N0:38;
[0121] 全人源化抗體VH基因擴增引物：
[0122] 上游引物:PCI-wbp229_F2,見序列表中SEQ ID N0:39;PCI-wbp229_F3,見序列表 中SEQ ID N0:40;6H8-L1_R2,見序列表中SEQ ID N0:33;6H8-L1_R5,見序列表中SEQ ID N0:34；
[0123] 下游引物:PCI-wbp229_Rl，見序列表中SEQ ID N0:41;
[0124] 2利用以上引物和模板分別進行PCR擴增目的片段：
[0125] 擴增方案如下：
[0126] 2 ? 1 以上述 11188-58 為模板，分別以 PCI-wbp229_Fl+pCI-6H8_R8 和 PCI-wbp229_F2 +PCI-wbp229_Rl為引物對，擴增完整人源化抗體WBP229-201-VL和VH;
[0127] 2 ? 2 以上述11214-84 為模板，分別以 PCI-wbp229_Fl+pCI-6H8_R8 和 PCI-wbp229_F2 +PCI-wbp229_Rl為引物對，擴增完整人源化抗體WBP229-202-VL和VH;
[0128] 2 ? 3以上述 11242-111 為模板，分別以 PCI-wbp229_Fl+pCI-6H8_R8 和 PCI-wbp229_ F3+PCI-wbp229_Rl為引物對，擴增完整人源化抗體WBP229-203-VL和VH;
[0129] 2 ? 4以上述 11245-115 為模板，分別以 PCI-wbp229_Fl+pCI-6H8_R8 和 PCI-wbp229_ F3+PCI-wbp229_Rl為引物對，擴增完整人源化抗體WBP229-204-VL和VH;
[0130] 2.5以上述11305-123為模板，分別以？(：11匕口229_卩1+口(：1-6118_1?8和？(：11匕口229_ F3+PCI-wbp229_Rl為引物對，擴增完整人源化抗體WBP229-205-VL和VH; PCR擴增后，將PCR 產物經瓊脂糖凝膠電泳回收純化。
[0131] 2.6輕鏈可變區基因加入限制性內切酶哚〇10￥和31^81進行酶切，重鏈可變區基因 加入限制性內切酶NgoMIV和SnaBI進行酶切，酶切后經DNA純化試劑盒進行純化，并與相同 限制性內切酶消化的含有hIgG2/k的哺乳動物細胞表達載體pCI-vector連接。連接產物轉 化到T0P10大腸桿菌，涂布在含有100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養基上。獲得的陽性克隆 在含有l〇〇μg/ml氨節青霉素的LB液體培養基中培養，經過Invitrogen公司測序驗證后，用 質粒大抽試劑盒提取陽性克隆質粒，分別命名為WBP229-201~205。。
[0132] 八、細胞瞬時轉染及抗體純化
[0133] 利用Invitrogen公司的Freestyle Max Reagent轉染試劑分別將WBP229-201 ~ 205的含輕、重鏈基因的質粒共轉染入HEK293細胞（1.0X106個/ml)，將轉染后的細胞置于 搖床37°C，5%C0 2培養箱中震蕩培養，搖床轉速為120轉。在轉染7天后離心收取轉染后的細 胞上清液，采用ProteinA親和層析柱從細胞培養上清中分離純化目的抗體。選擇表達量最 高的3個人源化抗體WBP229-205含如SEQ ID N0:1所示的輕鏈可變區氨基酸序列和如SEQ ID N0: 3所示的重鏈氨基酸序列，并命名為HP6H8-1; 229-204含如SEQ ID N0:5所示的輕鏈 可變區氨基酸序列和如SEQ ID N0:7所示的重鏈氨基酸序列，并命名為HP6H8-2;229-203含 如SEQ ID N0:9所示的輕鏈可變區氨基酸序列和如SEQ ID N0:11所示的重鏈氨基酸序列， 并命名為HP6H8-3。九、人源化抗體親和力測定
[0134] 1. ELISA測定人源化抗體親和力
[0135] 將200ng⑶147重組蛋白包被到酶標板中，4°C靜置過夜。用0.1%的BSA室溫封閉1 小時。將八中制備獲得的3株抗體配制成10,100,1000,10000和100000ng/ml濃度，共5個梯 度，每孔加入l〇〇yl，室溫靜置1小時。加入l〇〇yl 1:4000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗 人輕鏈恒定區二抗(Millipore公司產品），室溫靜置1小時。加入TMB顯色，并用2M的H 2S〇4終 止反應。
[0136]用酶標儀在450nm下讀數。從結果可看出，篩選得到的3株抗體及嵌合抗體c6H8對 BASIGIN具有明顯的親和力，且其親和力優于對照鼠源性親本抗體6H8(圖3)。
[0137] 2 .SPR測定人源化抗體親和力
[0138] 方法同六。
[0139] 結果如表2所示。
[0140] 表2SPR測定人源化抗體親和力
[0142]
[0143] 綜上所述，人源化后的抗體的親和力優于鼠源性親本抗體6H8。
[0144] 十、高效人源化抗體表達載體構建及穩定表達細胞株篩選
[0145] 根據九中的結果，選取編號"229-205"的基因序列進行高效表達載體的構建
[0146] 1.輕鏈基因表達載體構建
[0147] 基因合成229-205的VL片段，5 ' -3 '分別引入限制性內切酶Xbal與BsiWI，對該片段 及含有輕鏈恒定區基因的pcDNA3.3-LC-104new-M進行Xbal與BsiWI雙酶切，1 %瓊脂糖凝膠 電泳后切膠回收。將切膠純化后的DNA片段（來自基因合成片段的416bp片段，與來自質粒 pcDNA3.3-LC-104new-M的5712bp片段）進行連接反應，T4連接酶20yl體系16°C下反應 20min，取10yl連接液轉化大腸桿菌T0P10感受態細胞。進行菌落PCR鑒定、酶切鑒定以及測 序后，挑一個正確的單克隆于200ml LB培養基，37°C，220rpm過夜振蕩培養，大量抽提質粒， 最終得到的質粒命名為pcDNA3.3-LC-N-229-205 (如圖4所示）。
[0148] 2.重鏈基因表達載體構建
[0149] 基因合成229-205的VH片段，5 ' -3 '分別引入限制性內切酶Xbal與Nhel，對該片段 及含有重鏈恒定區基因的pOptivec-HC-208-M進行Xbal與Nhel的雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電 泳后割膠回收。將割膠純化后的DNA片段（來自基因合成片段的434bp片段，與來自質粒 pOptivec-HC-208-M的5364bp片段)進行連接反應，T4連接酶20yl體系16°C下反應20min，取 l〇yl連接液轉化大腸桿菌T0P10感受態細胞。經菌落PCR鑒定、酶切鑒定以及測序后，挑一個 正確的單克隆于200ml LB培養基，37°C，220rpm過夜振蕩培養，大提質粒，最終得到的質粒 命名為 p〇ptivec-HC-D-229-205(如圖 5 所示）。
[0150] 3. CH0穩定表達細胞株的構建及篩選
[0151 ] 用Freestyle Max Reagent(Invitrogen)將上述構建的人源化抗體輕鏈表達載體 pcDNA3 ? 3-LC-N-229-205 和人源化抗體重鏈表達載體 p0ptivec-HC-D-229-205 轉染入 CH0/ DHFR細胞中。轉染48小時后，首先用加入500μg/ml G418的Opti CH0培養基篩選傳代，一直 到細胞活率恢復到85%以上，再加入含有500nM MTX的篩選培養基中繼續篩選。用ClonePix FL挑選單克隆。單克隆培養7-10天后，HTRF的方法檢測細胞培養上清中抗體HP6H8-1表達量 為2.23 ± 0.18g/L(結果如圖6所示）。
[0152] 十一、免疫組化染色法測定人源化抗體的特異性
[0153] 用免疫組織化學方法，檢測抗體HP6H8-1與腫瘤組織的特異性結合能力，考察該抗 體的免疫組織交叉反應。具體操作如下：常規二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水、水化組織芯片； 3%H202阻斷滅活內源性過氧化物酶;正常羊血清工作液封閉；以抗體HP6H8-1為一抗，生物 素標記的兔抗人Fc抗體為二抗，辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液為三抗，DAB顯 色，蘇木精復染，脫水透明后封片、鏡檢。
[0154] 結果如圖7所示，抗體HP6H8-1在肺癌、肝癌、結腸癌等惡性腫瘤組織中可見特異性 著色，著色程度均為"++"或"+++"；而與正常組織極少結合。
[0155] 以上結果表明，本發明所涉及的以CDR移植為基礎的人源化抗體改造，并未影響鼠 源性親本抗體識別抗原的特異性，人源化抗體構建成功。
[0156] 十二、HP6H8-1抗體抑制惡性瘧原蟲侵襲紅細胞的體外抗瘧實驗
[0157] 方法：用惡性瘧原蟲株Dd2、3D7、FCCl和Nf54)分別感染人紅細胞(0型），當感染率 2 1 %，環狀體2 80%時，加入單抗HP6H8-1，單抗終濃度為0100(μg/ml)。原 蟲率0.5 %，RBC壓積2 %，每個濃度梯度3個復孔。37度培養72小時后，進行薄血膜涂片，100 倍油鏡下計數原蟲率。實驗獨立重復三次，取平均值。統計學數據用SPSS軟件計算。
[0158] 結果:人源化HP6H8-1單抗抑制惡性瘧原蟲株Nf54和FCC1的體外藥效學實驗結果 如圖8所示，給藥72小時后，人源化單抗HP6H8-1對各種惡性瘧原蟲株均有明顯的抗瘧作用， 對惡性瘧原蟲株的IC50分別為0.04、0.02、0.04、0.05mg/mL。
【主權項】
1. 一種抗BASIGIN人源化抗體，其特征在于，該抗體包含免疫球蛋白輕鏈可變區和免疫 球蛋白重鏈可變區，所述的免疫球蛋白輕鏈可變區包含⑶R1:如序列表中SEQ ID NO: 13所 示;CDR2:如序列表中SEQIDN0:14所示;CDR3 :如序列表中SEQIDN0:15所示； 所述的免疫球蛋白重鏈可變區包含⑶R1:如序列表中SEQ ID NO: 16所示;CDR2:如序列 表中SEQIDN0:17所示;CDR3:如序列表中SEQIDN0:18所示。2. 如權利要求1所述的抗BASIGIN人源化抗體，其特征在于，所述的抗BASIGIN人源化抗 體包括單克隆抗體HP6H8-1，單克隆抗體HP6H8-1的輕鏈可變區氨基酸序列如SEQ ID N0:1 所示，單克隆抗體HP6H8-1的重鏈氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示。3. 如權利要求1所述的抗BASIGIN人源化抗體，其特征在于，所述的抗BASIGIN人源化抗 體包括單克隆抗體HP6H8-2,單克隆抗體HP6H8-2的輕鏈可變區氨基酸序列如SEQ ID N0:5 所示，單克隆抗體HP6H8-2的重鏈氨基酸序列如SEQ ID N0:7所示。4. 如權利要求1所述的抗BASIGIN人源化抗體，其特征在于，所述的抗BASIGIN人源化抗 體包括單克隆抗體HP6H8-3,單克隆抗體HP6H8-3的輕鏈可變區氨基酸序列如SEQ ID N0:9 所示，單克隆抗體HP6H8-3的重鏈氨基酸序列如SEQ ID NO: 11所示。5. 如權利要求1、2、3或4所述的抗BASIGIN人源化抗體在制備治療BASIGIN表達相關疾 病藥物中的應用，所述的BASIGIN表達相關疾病包括肺癌、肝癌、結腸癌和瘧疾。
【文檔編號】A61P35/00GK105820250SQ201610285139
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年4月29日
【發明人】陳志南, 朱平, 黃婉, 張征, 張陽, 張夢瑤, 邊惠潔, 蔣建利
【申請人】中國人民解放軍第四軍醫大學