獲自功能型蘋果的花青苷調控蛋白MsMYB111及其編碼基因和應用
【專利摘要】本發明公開了一種獲自功能型蘋果的花青苷調控蛋白MsMYB111及其編碼基因和應用。本發明提供的蛋白質，獲自蘋果，命名為MsMYB111蛋白，是如下(a1)或(a2)：(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(a2)將序列1的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物花青苷含量相關的由序列1衍生的蛋白質。編碼MsMYB111蛋白的基因(MsMYB111基因)也屬于本發明的保護范圍。本發明還保護MsMYB111蛋白的應用，為如下(b1)或(b2)：(b1)調控植物的花青苷含量；(b2)降低植物的花青苷含量。本發明發現了MsMYB111蛋白及其功能，可用于培育花青苷含量改變的轉基因植物，在植物育種中具有重大應用前景。
【專利說明】
獲自功能型蘋果的花青苷調控蛋白MsMYB111及其編碼基因和 應用
技術領域
[0001 ]本發明涉及一種獲自功能型蘋果的花青苷調控蛋白MsMYBlll及其編碼基因和應 用。
【背景技術】
[0002] "醫食同源"是發展方向。蘋果耐貯性好，供應周期長，是世界性果品，尤其果實含 有較高比例的、人體比較容易吸收的游離多酚，具有很好的抗氧化、抗腫瘤、預防心腦血管 疾病及保肝等作用，營養保健價值高，有"一天一蘋果，醫生遠離我"（An apple a day keeps the doctor away!)的美譽，世界上相當多的國家都將其列為主要消費果品而大力 推薦。但近幾年的調研結果表明，一方面，在過去幾十年國內外育成的1000多個蘋果品種， 80%是'金帥'等品種的雜交、實生或芽選后代，這種"近親繁殖"往往帶來品種的遺傳基礎 狹窄及抗逆性減退等問題;另一方面，特色、多抗和多樣性果品成為產業發展的重要方向。 [0003] 新疆野蘋果及其紅肉變型（Malus sieversii f.neidzwetzkyana)是世界栽培蘋 果的祖先種，不僅遺傳多樣性極為豐富，而且富含類黃酮等功能、保健成分，是進行抗逆與 品質育種的珍貴基因庫。但因農田開墾等原因，新疆野蘋果的遺傳多樣性正遭到嚴重破壞， 瀕臨滅絕;我國是世界上最大的蘋果生產和消費國，其中2012年生產蘋果3950萬噸，主要用 于鮮食，且近70 %是類黃酮含量較低的富士品種。
[0004] 因此，圍繞"新疆野蘋果資源的科學保護與持續高效利用、栽培品種遺傳基礎拓 展、蘋果產業轉型升級與共給側結構改革和農民持續增收以及人類健康水平提升"，進行聯 合攻關與集成示范，本發明的發明人與美國康奈爾大學的教授合作，對新疆野蘋果及歐洲 森林蘋果等世界范圍內的97份蘋果資源進行了基因組重測序與生物信息學分析，構建了新 疆紅肉蘋果與蘋果品種雜種一代及回交一、二代分離群體，研究明確了新疆野蘋果群體遺 傳結構與遺傳多樣性特征、核心種質構建的技術參數、類黃酮含量等性狀的遺傳變異特點 及發育機理，提出了"功能型蘋果"的概念及"寬行高干、行間生草、給草施肥、肥田養根"的 現代果園管理理念，創建了常規雜交與生物技術有機結合的蘋果高效育種技術體系，創制 了一批新品種及優異種質，研發了蘋果新品種配套高效栽培技術體系。目前，已授權和申報 發明專利10余項，定植雜種實生苗4萬余株，育成新品種（系）16個;發表相關研究論文120 篇，其中SCI論文20余篇，這些研究成果總體處在國際同類研究的領先水平。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種獲自功能型蘋果的花青苷調控蛋白MsMYBlll及其編碼 基因和應用。
[0006] 本發明提供的蛋白質，獲自蘋果，命名為MsMYBlll蛋白，是如下(al)或(a2):
[0007] (al)由序列表中序列1所不的氣基酸序列組成的蛋白質；
[0008] (a2)將序列1的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添 加且與植物花青苷含量相關的由序列1衍生的蛋白質。
[0009] 為了使(a)中的MsMYBlll蛋白便于純化和檢測，可在由序列表中序列1所示的氨基 酸序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。
[0010] 表1標簽的序列
[0012] 上述(b)中的MsMYBlll蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達 得到。上述(b)中的MsMYB 111蛋白的編碼基因可通過將序列表中序列2所示的DNA序列中缺 失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其 端和/或3'端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。
[0013] 編碼所述MsMYBlll蛋白的基因(MsMYBlll基因）也屬于本發明的保護范圍。
[0014]所述基因為如下（1)或(2)或(3):
[0015] ⑴編碼區序列表中序列2所示的DNA分子；
[0016] (2)在嚴格條件下與（1)限定的DNA序列雜交且編碼與植物花青苷含量相關的蛋白 質的DNA分子；
[0017] (3)與（1)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼與植物花青苷含量相關的蛋 白質的DNA分子。
[0018] 上述嚴格條件可為用0.1 X SSPE(或0.1 X SSC)，0.1 % SDS的溶液，在DNA或者RNA雜 交實驗中65°C下雜交并洗膜。
[0019] 含有所述MsMYB 111基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系、轉基因植物組織 或重組菌均屬于本發明的保護范圍。
[0020] 可用現有的植物表達載體構建含有MsMYBlll基因的重組表達載體。所述植物表達 載體包括雙元農桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。使用MsMYBlll基因構建重組表 達載體時，可在其轉錄起始核苷酸前加上任何一種增強型、組成型、組織特異型或誘導型啟 動子，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結合使用;此外，使用MsMYBlll基因構建重組 表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄增強子，這些增強子區域可以是ATG 起始密碼子或鄰接區域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列 的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合 成的。翻譯起始區域可以來自轉錄起始區域或結構基因。為了便于對轉基因植物細胞或植 物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入在植物中表達可產生顏色變 化的酶或發光化合物的基因、具有抗性的抗生素標記物或是抗化學試劑標記基因等。從轉 基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以表型篩選轉化植株。所述重組 表達載體的出發載體可為pRI 101載體。所述重組表達載體具體可為在pRI 101載體的Sail和 BamHI酶切位點之間插入序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子得到的重組質粒pRIlOl- MsMYBlllo
[0021]所述植物組織具體可為植物愈傷組織，更具體可為植物幼葉愈傷組織。所述植物 可為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物具體可為薔薇科植物。所述薔薇科植物具 體可為蘋果屬植物。所述蘋果屬植物具體可為蘋果，更具體可為蘋果'紫紅1號'。
[0022 ] 本發明還保護所述MsMYBlll蛋白的應用，為如下(bl)或(b2):
[0023] (bl)調控植物的花青苷含量；
[0024] (b2)降低植物的花青苷含量。
[0025]所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物具體可為薔薇科植物。 所述薔薇科植物具體可為蘋果屬植物。所述蘋果屬植物具體可為蘋果，更具體可為蘋果'紫 紅1號'。
[0026]本發明還保護所述MsMYBlll基因在培育花青苷含量降低的轉基因植物中的應用。 所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物具體可為薔薇科植物。所述薔薇 科植物具體可為蘋果屬植物。所述蘋果屬植物具體可為蘋果，更具體可為蘋果'紫紅1號'。 [0027]本發明還保護一種培育轉基因植物的方法，包括如下步驟:將所述MsMYBl 11基因 導入出發植物，得到花青苷含量低于所述出發植物的轉基因植物。所述出發植物可為單子 葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物具體可為薔薇科植物。所述薔薇科植物具體可為蘋 果屬植物。所述蘋果屬植物具體可為蘋果，更具體可為蘋果'紫紅1號'。所述MsMYBl 11基因 具體可通過以上任一所述重組表達載體導入所述出發植物。所述方法中，具體可將所述 MsMYBlll基因導入出發植物的愈傷組織，然后將愈傷組織培育為植株。所述愈傷組織具體 可為幼葉愈傷組織。攜帶有所述MsMYBlll基因的重組表達載體可通過Ti質粒、Ri質粒、植物 病毒載體、直接DNA轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導等常規生物學方法轉化到植物細胞或 組織中。
[0028]本發明還保護一種獲得轉基因植物組織的方法，包括如下步驟:將所述MsMYBlll 基因導入出發植物組織，得到花青苷含量低于所述出發植物組織的轉基因植物組織。所述 出發植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物具體可為薔薇科植物。所述薔薇 科植物具體可為蘋果屬植物。所述蘋果屬植物具體可為蘋果，更具體可為蘋果'紫紅1號'。 所述MsMYBlll基因具體可通過以上任一所述重組表達載體導入所述出發植物組織。所述植 物組織具體可為植物愈傷組織。所述愈傷組織具體可為幼葉愈傷組織。
[0029] 本發明還保護所述MsMYBl 11蛋白或所述所述MsMYBl 11基因或以上任一所述方法 在植物育種中的應用。所述植物育種的目的為培育花青苷含量降低的植物。
[0030] 本發明發現了MsMYBlll蛋白及其功能，可用于培育花青苷含量改變的轉基因植 物，在植物育種中具有重大應用前景。
【附圖說明】
[0031] 圖1為表型鑒定的結果。
【具體實施方式】
[0032] 以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平 均值。
[0033] pRIlOl 載體（又稱"pRIHU-AN DNA"）：Takala 公司，Code No.3262。農桿菌 LBA4404:Tiangen公司，產品目錄號:CC2901。蘋果'紫紅1號'（又稱'紫紅1號'紅肉蘋果）：參 考文獻:《'紫紅1號'紅肉蘋果果肉抗氧化性及花色苷分析》。
[0034] 制備幼葉愈傷組織的方法具體參見文獻：Ji X H，Zhang R，Wang N，Yang L&Chen X S.Transcriptome profiling reveals auxin suppressed anthocyanin biosynthesis in red-fleshed apple callus(Malus sieversii f.niedzwetzkyana).Plant Cell Tiss Organ Cult，2015，123: 389-404 ?。1 %鹽酸甲醇溶液的制備方法:97 ? 2ml甲醇中加入2 ? 8ml 濃鹽酸。0.025M KC1緩沖液(pH= 1.0)的制備方法：1.86g KC1用980ml蒸餾水溶解，用濃鹽 酸調pH到1.0，轉入1L容量瓶中，用蒸餾水定容。0.4M NaAc緩沖液(pH=4.5)的制備方法:稱 54.43g NaAC用960ml蒸餾水溶解，用濃鹽酸調pH到4.5，轉移到1L容量瓶，用蒸餾水定容。
[0035] 實施例1、MsMYBl 11蛋白及其編碼基因的發現
[0036] 從'紅脆1號'蘋果中發現了一個新蛋白，如序列表的序列1所示，將其命名為 MsMYBlll蛋白。將編碼MsMYBlll蛋白的基因命名為MsMYBlll基因，其開放閱讀框如序列表 的序列2所示。
[0037] GENBANK中，與序列1同源性最高的蛋白如序列表的序列3所示。將序列表的序列3 所示的蛋白質命名為對照蛋白，其編碼基因命名為對照基因，如序列表的序列4所示。
[0038] 實施例2、MsMYBlll蛋白的功能鑒定
[0039] 一、構建重組質粒
[0040] 1、構建重組質粒 pRIlOl-MsMYBlll
[0041] (1)人工合成序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子。
[0042] (2)以步驟（1)得到的DNA分子為模板，采用F1和R1組成的引物對進行PCR擴增，得 到PCR擴增產物。
[0045] (3)用限制性內切酶Sal I和BamHI雙酶切步驟(2)得到的PCR擴增產物，回收酶切產 物。
[0046] (4)用限制性內切酶Sal I和BamHI雙酶切pRI 101載體，回收約1 Okb的載體骨架。
[0047] (5)將步驟（3)的酶切產物與步驟（4)的載體骨架連接，得到重組質粒pRI 101 - MsMYBlll。根據測序結果，對重組質粒pRIlOl-MsMYBlll進行結構描述如下：在pRIlOl載體 的Sa 11和Bamm酶切位點之間插入了序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子。
[0048] 2、構建重組質粒 pRIlOl-AMsMYBlll
[0049] (1)人工合成序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子。
[0050] (2)以步驟（1)得到的DNA分子為模板，采用F2和R2組成的引物對進行PCR擴增，得 到PCR擴增產物。
[0053] (3)以步驟（1)得到的DNA分子為模板，采用F3和R3組成的引物對進行PCR擴增，得 到PCR擴增產物。
[0056] (4)將步驟(2)的PCR擴增產物和步驟(3)的PCR擴增產物混合后作為模板，采用F2 和R3組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。
[0057] (5)用限制性內切酶Sal I和BamHI雙酶切步驟(4)得到的PCR擴增產物，回收酶切產 物。
[0058] (6)用限制性內切酶Sal I和BamHI雙酶切pRI 101載體，回收約1 Okb的載體骨架。 [0059] (7)將步驟(5)的酶切產物與步驟(6)的載體骨架連接，得到重組質粒pRI 101 - A MsMYBlll。根據測序結果，對重組質粒pRIlOl-AMsMYBlll進行結構描述如下：在pRIlOl載 體的Sa 11和Bamm酶切位點之間插入了序列表的序列5所示的雙鏈DNA分子。
[0060] 3、構建對照質粒
[00611 將人工合成的序列表的序列4所示的雙鏈DNA分子插入pRI 101載體的Sail和BamHI 酶切位點之間，得到對照質粒。
[0062] 二、轉MsMYB 111基因愈傷組織的獲得
[0063] 1、將重組質粒pRIlOl-MsMYBlll導入農桿菌LBA4404,得到重組農桿菌。
[0064] 2、將步驟1得到的重組農桿菌接種至30ml含50μg/ml卡那霉素和50μg/ml利福平的 YEP液體培養基，28°C振蕩培養至0D6mnm=0.6，12000rpm離心收集菌體，用30ml ddH20懸浮， 加入乙酰丁香酮并使其濃度為l〇〇yM，得到侵染液。
[0065] 3、取蘋果'紫紅1號'的幼葉愈傷組織，浸沒到步驟2得到的侵染液中，室溫振蕩 30min〇
[0066] 4、完成步驟3后，取愈傷組織，置于含lmg/L 6-BA和0.3mg/L NAA的MS固體培養基 上，28°C暗培養2天，然后轉移到含lmg/L 6_BA、0? 3mg/L NAA、50mg/L卡那霉素和50mg/L利 福平的MS固體培養基上光暗交替（16h光照/8h黑暗)培養30天。
[0067] 5、完成步驟4后，取愈傷組織，提取基因組DNA，采用F4和R4組成的引物對進行PCR 鑒定，PCR鑒定為陽性的即為轉MsMYBlll基因愈傷組織。
[0068] F4:5 '-GCTCCTACAAATGCCATCA-3 '；
[0069] R4:5 '-TTATCTGAAAAGCACAAGGGTAG-3 '。
[0070] F4對應載體骨架上的35S啟動子部分序列，R4對應MsMYBlll基因上的部分序列，靶 序列長度約為750bp。
[0071] 6、完成步驟4后，取轉MsMYBlll基因愈傷組織，置于含lmg/L 6-BA、0.3mg/L NAA、 50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的MS固體培養基上繼代培養。
[0072]三、對照組織的獲得
[0073] 將重組質粒pRIlOl-AMsMYBlll代替重組質粒pRIlOl-MsMYBlll進行步驟二，得到 轉AMsMYB 111基因愈傷組織。
[0074] 將對照質粒代替重組質粒pRIlOl-MsMYBlll進行步驟二，得到轉對照基因愈傷組 織。
[0075] 將pRI 101載體代替重組質粒pRI 101-MsMYBl 11進行步驟二，得到轉空載體愈傷組 織。
[0076]四、表型鑒定
[0077]各個愈傷組織的照片見圖1。圖1中的各個愈傷組織分別為步驟二的6中培養30天 后的轉MsMYBlll基因愈傷組織、步驟三的6中培養30天后的轉AMsMYBlll基因愈傷組織、步 驟三的6中培養30天后的轉對照基因愈傷組織、步驟三的6中培養30天后的轉空載體愈傷組 織和處于同一時期的蘋果'紫紅1號'幼葉愈傷組織（用WT表示）。蘋果'紫紅1號'的愈傷組織 顯示為深紫色，表明其中花青苷含量較高。轉MsMYBlll基因愈傷組織顯示為淺黃色，表明其 花青苷含量相對'紫紅1號'大大降低。轉AMsMYBlll基因愈傷組織與'紫紅1號'的愈傷組織 顏色基本一致。轉空載體愈傷組織與'紫紅1號'的愈傷組織顏色基本一致。轉對照基因愈傷 組織顯示為黃紫相間的顏色，其中花青苷含量高于轉MsMYBlll基因愈傷組織且低于'紫紅1 號'的愈傷組織。
[0078]五、含量鑒定
[0079]待測愈傷組織分別為:步驟二的6中培養30天后的轉MsMYBlll基因愈傷組織、步驟 三的6中培養30天后的轉AMsMYBlll基因愈傷組織、步驟三的6中培養30天后的轉對照基因 愈傷組織、步驟三的6中培養30天后的轉空載體愈傷組織和處于同一時期的蘋果'紫紅1號' 幼葉愈傷組織（用WT表示）。
[0080] 具體步驟如下：
[0081 ] 1、稱取0.5g待測愈傷組織，加入液氮并研磨成粉末，然后加入5ml 4°C預冷的1 % 鹽酸甲醇溶液，然后4 °C避光靜置浸提24h，然后8000r/min離心1 Omin，收集上清液。
[0082] 2、取lml步驟1得到的上清液，加入4ml 0.025M KC1緩沖液(pH=1.0)并混勻，然后 4 °C避光靜置浸提15min，然后8000r/min離心1 Omin，收集上清液。
[0083] 3、取lml步驟1得到的上清液，加入4ml 0.4M NaAc緩沖液(pH=4.5)并混勻，然后4 °C避光靜置浸提15min，然后8000r/min離心1 Omin，收集上清液。
[0084] 4、分別取步驟2得到的上清液和步驟3得到的上清液，測定510nm和700nm下的吸光 值。
[0085] 花青苷含量(mg/g) = AAX 5 X 0 ? 005 X 1000 X 449 ? 2/(26900 X 0 ? 5);
[0086] AA= (A510nm-A700niii)(pH=1.0)-(A510n]ii-A700nm)(PH=4.5) 〇
[0087] 花青苷含量單位"mg/g"中的"g"指的是愈傷組織的鮮重。
[0088] 進行五次重復試驗，每次重復試驗中每個待測愈傷組織各取10份，結果取平均值。 [0089] 結果見表2。轉MsMYBlll基因愈傷組織的花青苷含量顯著低于轉AMsMYBlll基因 愈傷組織、轉對照基因愈傷組織、轉空載體愈傷組織以及處于同一時期的蘋果'紫紅1號'幼 葉愈傷組織。結果表明，MsMYBlll蛋白可以降低植物的花青苷含量。
[0090]表2各個待測愈傷組織中的花青苷含量
【主權項】
1. 一種蛋白質，是如下(al)或(a2): (al)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質； (a2)將序列1的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且 與植物花青苷含量相關的由序列1衍生的蛋白質。2. 編碼權利要求1所述蛋白質的基因。3. 如權利要求2所述的基因，其特征在于:所述基因為如下（1)或(2)或(3): (1) 編碼區序列表中序列2所示的DNA分子； (2) 在嚴格條件下與（1)限定的DNA序列雜交且編碼與植物花青苷含量相關的蛋白質的 DNA分子； (3) 與（1)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼與植物花青苷含量相關的蛋白質 的DNA分子。4. 含有權利要求2或3所述基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系、轉基因植物組 織或重組菌。5. 權利要求1所述蛋白質的應用，為如下(bl)或(b2): (bl)調控植物的花青苷含量； (b2)降低植物的花青苷含量。6. 權利要求2或3所述基因在培育花青苷含量降低的轉基因植物中的應用。7. -種培育轉基因植物的方法，包括如下步驟:將權利要求2或3所述基因導入出發植 物，得到花青苷含量低于所述出發植物的轉基因植物。8. -種培育轉基因植物組織的方法，包括如下步驟:將權利要求2或3所述基因導入出 發植物組織，得到花青苷含量低于所述出發植物組織的轉基因植物組織。9. 如權利要求8所述的方法，其特征在于:所述植物組織為植物愈傷組織。10. 權利要求1所述蛋白質，或，權利要求2或3所述基因，或，權利要求7或8或9所述方 法，在植物育種中的應用。
【文檔編號】C07K14/415GK105820224SQ201610293357
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年5月5日
【發明人】許海峰, 陳學森, 王楠, 姜生輝, 王意程, 毛志泉, 姜遠茂
【申請人】山東農業大學