高效分離純化紐莫康定的方法
【專利摘要】本發明為高效分離純化紐莫康定（Pnemocandin）的方法，解決已有分離純化紐莫康定的方法回收率較低，難以回收利用洗脫溶劑，不能同時分離多種近似雜質,分離過程中產品的穩定性差的問題。其步驟為將經大孔吸附樹脂洗脫分離得到包含紐莫康定A0、B0和C0三種組分的粗品用乙醇溶解，硅膠作為填料進行柱層析分離，洗脫劑選用低沸點中等極性溶劑、高沸點醇和水組成的三元溶劑體系，洗脫液經濃縮、重結晶而得到高純度紐莫康定B0。由本發明方法制備的紐莫康定B0純度極高、更高效地一步分離A0、B0和C0組分，方法操作簡單、洗脫劑易回收，利于工業化應用。
【專利說明】
高效分離純化紐莫康定的方法
[0001 ]
技術領域： 本發明涉及藥物化學領域，具體涉及一種高效分離純化紐莫康定的方法。
[0002]
【背景技術】： 紐莫康定是由Glarea lozoyensis產生的次級代謝產物，Glarea lozoyensis在發酵時 除了會產生紐莫康定B〇以外還會產生結構類似物A〇以及同分異構體C〇。
[0003] 中國發明專利200910133118.0公開了制備紐莫康定B0的方法，首先過酸性氧化 鋁柱，然后上HP20吸附樹脂，接下來用反相樹脂YPR-n洗脫得到紐莫康定B〇純度大于90%， 最后重結晶得到純度可達到96%的成品。該方法沒有對同分異構體C Q進行檢測和純度控制， 而一般發酵液中的Co雜質含量在10%左右，該方法得到的是B〇和Co的混合物，在下一步的合 成反應中將嚴重影響卡泊芬凈的質量。
[0004] 中國專利201410051009.5公開了一種高效制備紐莫康定B〇的方法，將含有紐莫 康定B〇的發酵液酸化過濾，浸提;浸提液濃縮后加入硅藻土裹晶；離心固體用乙醇溶解，加 入活性炭脫色過濾;濾液濃縮，加入氯仿過硅膠柱，收集紐莫康定Bo的過柱液;紐莫康定B〇的 過柱液濃縮至干，在多相溶劑體系下結晶，得到紐莫康定B〇。該方法雖對C Q雜質進行了檢測 和純度控制，但它的回收率較低，操作復雜，不利于工業生產應用。
[0005] 中國發明專利201410711185.7公開了一種采用動態軸向壓縮柱制備高純度紐莫 康定B〇的方法，紐莫康定粗品濃縮干燥后，加入氯仿和甲醇混合物溶解，上樣，氯仿、甲醇和 水混合液洗脫，紫外檢測峰值最大時收集洗脫液，得目標組分，濃縮干燥即得紐莫康定B〇。 該方法雖采用了動態軸向壓縮柱來代替傳統的硅膠柱，但過程中的固液分離仍采用傳統離 心和旋轉蒸發，分離過程效率低，洗脫劑難以回收利用。
[0006] 紐莫康定結構式如下：
現有技術在制備過程中采用吸附樹脂或活性炭來除雜純化得到粗品后，主要通過硅膠 層析柱將對紐莫康定B〇結構類型物進行分離，但已報道的系統都很難將紐莫康定B〇和Co很 好分離，且洗脫系統洗脫劑很難回收利用;現有技術沒有包含雜質紐莫康定A〇的去除，需增 加相應分離步驟，造成提取收率的進一步降低。因此高效分離紐莫康定A Q、B〇和CQ，提高回收 率，以及回收利用洗脫溶劑，降低成本，對紐莫康定Bo的工業化生產有著很重要的意義。采 用201410051009.5、201410711185.7專利能夠初步實現紐莫康定B〇和Co的分離，但存在以下 問題：1)發酵粗品中的紐莫康定A〇不能得到有效分離;2)在濃縮和結晶過程中，由于紐莫康 定在中性或堿性下會在發生開環降解，在生產過程中會發生一定程度的降解;3)使用的溶 劑體系對溶劑比例要求嚴格，比例稍有偏差分離度會明顯降低，尤其不能加入影響極性的 酸保護劑。
[0007]
【發明內容】
： 本發明的目的是提供一種應用于工業生產，紐莫康定Ao能得到有效分離，回收率高，操 作簡單、洗脫劑易回收的高效分離純化紐莫康定的方法。
[0008] 為實現本發明目的，采用的技術方案為： 高效分離純化紐莫康定AQ、BQ和Co的方法，包括以下步驟： a. 溶解:將含有紐莫康定B〇的紐莫康定粗品用乙醇充分溶解，溶解時固液比為1:12~ 14，g: ml，過濾后得粗品溶液； b. 上柱:采用層析柱分離純化，層析柱填料選用150~400目硅膠，采用濕法裝柱，用乙 酸乙酯逐漸將柱子裝實后加入粗品溶液； c. 層析:采用上述硅膠柱層析，流速控制在0.5~2.5BV/h，洗脫劑采用低沸點中等極性 溶劑、高沸點醇和水組成的三元溶劑體系，三者體積比為(3~8): (3~7) : (1~5); d. 濃縮及重結晶：將分段收集到的含紐莫康定B〇洗脫液減壓濃縮，正丙醇中重結晶得 到純品。
[0009] 所述a步驟溶解過程中，采用超聲波進行溶解。
[0010] 所述C步驟層析過程中，三元溶劑洗脫劑體系中高沸點醇為正丙醇、正丁醇、異丁 醇、正戊醇、仲戊醇、正己醇中一種。
[0011] 所述C步驟層析過程中，三元溶劑洗脫劑體系中低沸點中等極性溶劑為二氯甲烷、 四氫呋喃、乙酸乙酯、乙醚和丙酮中之一種，低沸點中等極性溶劑與高沸點醇的沸點相差15 °C以上。
[0012] 所述c步驟層析過程中，三元溶劑體系中低沸點中等極性溶劑、高沸點醇和水的體 積比為(3~8): (3~6) : (1~4)，或者為(3~5): (3~5) : (2~4)。
[0013]所述c步驟層析過程中，在所述三元溶劑體系中添加有機酸，該有機酸在三元溶劑 體系中的體積濃度為〇. 1~〇. 3% ;所述有機酸選自甲酸、乙酸、丙酸、丁酸中之一種。
[0014]本發明通過洗脫劑采用低沸點中等極性溶劑、高沸點醇和水組成的三元溶劑體 系，三者體積比為(3~8): (3~7) : (1~5)，意外的實現了紐莫康定AQ、BQ和Co的同時分離，通 過硅膠柱層析制備出高純度紐莫康定Bo。
[0015]相比于現有紐莫康定分離純化技術，本發明通過用乙醇溶解紐莫康定進行濕法上 樣，對于其他的干法上樣來說，簡化實驗操作。本發明的三元溶劑體系洗脫劑相能更好分離 紐莫康定Ao、Bo和Co，大大提高收率，且低沸點中等極性溶劑、高沸點醇和水組成的三元溶劑 體系通過物理性質差異較易實現溶劑回收利用，從而降低成本和更有利于環保，對紐莫康 定Bo的工業化生產有著很重要的意義。
[0016] 本發明通過在流動相中加入微量的酸，維持了分離過程中產品的穩定性。
[0017]
【具體實施方式】： 下面結合實施例，對本發明的【具體實施方式】作進一步詳細描述。以下實施例用于說明 本發明，但不用來限制本發明的范圍。下述實施例中未注明的具體技術或條件，均為常規技 術或條件，或按照本領域內的文獻所描述的技術或條件，或者按照產品說明書進行。
[0018] 實施例1: 1、稱取5.0g紐莫康定粗品（紐莫康定AQ、BQ和Co含量分別為2.5%、70.6%和8.8%，）采用超 聲波溶解于60ml乙醇，用300~400目硅膠作填料，采用濕法裝柱，柱體積為500ml，用乙酸 乙酯逐漸將柱子裝實，用濕法將粗品溶液上樣到層析柱，進行層析柱洗脫。
[0019] 2、以體積比為4:3 :3的乙酸乙酯、異丙醇和水作為洗脫劑，洗脫劑為3倍硅膠體 積的用量對層析柱進行洗脫。
[0020] 3、分段收集洗脫液并進行減壓濃縮，濃縮得到目標產物，在正丙醇中重結晶可得 至泊色紐莫康定純品Bo 2.2g，回收率為62.3%。
[0021] 4、制得的成品經HP LC檢測C〇純度為0.0 5 %，紐莫康定A〇純度為0.1 %，堿降解產物 0.11%，紐莫康定Bo的正相純度為99.7%，反相純度為99.4%。
[0022] 5、HPLC高效液相檢測方法為： ①反相檢測條件:測定柱:C18柱，4.6mm X 250mm X 5um，柱溫:40°C ;采用等洗脫，流動相 為乙腈與水溶液，比例為44:56 ;流速為1.5mL/min ;檢測波長:210nm;進樣量:10yL。
[0023] ②正相檢測條件:測定住：Si02柱，4.6mmX 250mmX 5um;柱溫30°C ;流動相A為乙酸 乙酯(84%)，流動相B為甲醇(9%)，流動相C為水(7%);流速為1.2mL/min ;檢測波長278nm ;進樣量10yL。運行時間30min。
[0024] 實施例2: 1、稱取5.0g紐莫康定粗品（紐莫康定AQ、BQ和Co含量分別為2.5%、70.6%和8.8%，）采用超 聲波溶解于60ml乙醇，用300~400目硅膠作填料，采用濕法裝柱，柱體積為500ml，用乙酸 乙酯逐漸將柱子裝實，用濕法將粗品溶液上樣到層析柱，進行層析柱洗脫。
[0025] 2、以體積比為4:3:2的乙酸乙酯、正丁醇和水作為洗脫劑，洗脫劑中加入體積0.1% 乙酸，洗脫劑為4倍硅膠體積的用量對層析柱進行洗脫。
[0026] 3、分段收集洗脫液并進行減壓濃縮，濃縮得到目標產物，在正丙醇中重結晶可得 至丨泊色紐莫康定純品Bo 2. lg，回收率為59.5%。
[0027] 4、制得的成品經HPLC檢測Co純度為0.02%，紐莫康定Ao純度為0.06%，紐莫康定Bo的 正相純度為99.8%，反相純度為99.7%。
[0028] 實驗例（參照中國發明專利201410711185.7)。
[0029] 1、稱取5.0g紐莫康定粗品（紐莫康定AQ、BQ和Co含量分別為2.5%、70.6%和8.8%，）采 用超聲波溶解于60ml氯仿，用300~400目硅膠作填料，采用濕法裝柱，柱體積為500ml，用 氯仿：甲醇(3:1)逐漸將柱子裝實，用濕法將粗品溶液上樣到層析柱，采用氯仿：甲醇(5:1， 質量比）預洗。
[0030] 2、采用氯仿：甲醇(3:1，質量比)作為洗脫劑，洗脫劑為4倍硅膠體積的用量對層析 柱進行洗脫。
[0031] 3、分段收集洗脫液并進行減壓濃縮，濃縮得到目標產物，在正丙醇中重結晶可得 到白色紐莫康定純品Bo 1.45g，回收率為41.1%。
[0032] 4、制得的成品經HPLC檢測紐莫康定Co純度為0.16%，紐莫康定Ao純度為1.6%，堿降 解產物0.15%，紐莫康定Bo的正相純度為98.9%，反相純度為98.0%。
[0033]實施例1、2與實驗例相比，收率差距不大，但實施例1由于沒有添加有機酸，產品中 存在堿降解雜質。實驗例中沒有實現紐莫康定Ao的有效分離，存在紐莫康定Bo降解雜質，收 率也明顯低于本發明。
【主權項】
1. 高效分離純化紐莫康定的方法，其特征在于包括以下步驟： a. 溶解:將含有紐莫康定Bo的紐莫康定粗品用乙醇充分溶解，溶解時固液比為1:12~ 14，g: ml，過濾后得粗品溶液； b. 上柱:采用層析柱分離純化，層析柱填料選用150~400目硅膠，采用濕法裝柱，用乙 酸乙酯逐漸將柱子裝實后加入粗品溶液； c. 層析:采用上述硅膠柱層析，流速控制在0.5~2.5BV/h，洗脫劑采用低沸點中等極性 溶劑、高沸點醇和水組成的三元溶劑體系，三者體積比為(3~8): (3~7) : (1~5); d. 濃縮及重結晶:將分段收集到的含紐莫康定Bo洗脫液減壓濃縮，正丙醇中重結晶得到 純品。2. 根據權利要求1所述的高效分離純化紐莫康定的方法，其特征在于所述a步驟溶解過 程中，采用超聲波進行溶解。3. 根據權利要求1所述的高效分離純化紐莫康定的方法，其特征在于所述c步驟層析過 程中，三元溶劑洗脫劑體系中高沸點醇為正丙醇、正丁醇、異丁醇、正戊醇、仲戊醇、正己醇 中一種。4. 根據權利要求1或2所述的高效分離純化紐莫康定的方法，其特征在于所述c步驟層 析過程中，三元溶劑洗脫劑體系中低沸點中等極性溶劑為二氯甲烷、四氫呋喃、乙酸乙酯、 乙醚和丙酮中之一種，低沸點中等極性溶劑與高沸點醇的沸點相差15 °C以上。5. 根據權利要求1所述高效分離純化紐莫康定的方法，其特征在于所述c步驟層析過程 中，三元溶劑體系中低沸點中等極性溶劑、高沸點醇和水的體積比為(3~8): (3~6) : (1~ 4)，或者為(3~5): (3~5) : (2~4)。6. 根據權利要求1所述的高效分離純化紐莫康定的方法，其特征在于所述c步驟層析過 程中，在所述三元溶劑體系中添加有機酸，該有機酸在三元溶劑體系中的體積濃度為0.1~ 0.3%;所述有機酸選自甲酸、乙酸、丙酸、丁酸中之一種。
【文檔編號】C07K7/56GK105820213SQ201610232761
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年4月15日
【發明人】王欣榮, 楊淵, 翟龍飛, 褚以文, 方舟, 詹良靜, 張新宜, 林家富, 劉超蘭
【申請人】中國醫藥集團總公司四川抗菌素工業研究所