一種頭孢地尼的藥物組合物及其醫藥用圖
【專利摘要】本發明公開了一種頭孢地尼的藥物組合物及其醫藥用途，本發明提供的頭孢地尼的藥物組合物中含有頭孢地尼和一種結構新穎的天然產物化合物(Ⅰ)，頭孢地尼、化合物(Ⅰ)均能明顯提高腦缺血再灌注大鼠的神經功能評分及明顯降低炎性細胞因子TNF?α、IL?1β和黏附分子VCAM?1、ICAM?1的表達水平，兩者合用效果優于單用，可以開發成為保護腦缺血再灌注損傷的藥物。
【專利說明】
一種頭孢地尼的藥物組合物及其醫藥用途
技術領域
[0001] 本發明屬于生物醫藥領域，涉及頭孢地尼的新用途，具體涉及頭孢地尼的藥物組 合物及其醫藥用途。
【背景技術】
[0002] 頭孢地尼用于對頭孢地尼敏感的葡萄球菌屬、鏈球菌屬、肺炎球菌、消化鏈球菌、 丙酸桿菌、淋病奈瑟氏菌、卡他莫拉菌、大腸埃希菌、克雷伯菌屬、奇異變形桿菌、普魯威登 斯菌屬、流感嗜血桿菌等菌株所引起的感染。
[0003] 有許多證據說明僅僅缺血還不足以導致組織損傷，而是在缺血一段時間后又突然 恢復供血（即再灌注)時才出現損傷。在創傷性休克、外科手術、器官移植、燒傷、凍傷和血栓 等血液循環障礙時，都會出現缺血后再灌注損傷。缺血組織再灌注時造成的微血管和實質 器官的損傷主要是由活性氧自由基引起的，這已在多種器官中得到的證明。在缺血組織中 具有清除自由基的抗氧化酶類合成能力發生障礙，從而加劇了自由基對缺血后再灌注組織 的損傷。使用S0D清除自由基對缺血再灌流組織損傷有保護作用。
[0004] 迄今為止，尚未見頭孢地尼及其藥物組合物與腦缺血再灌注損傷的相關性報道。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種頭孢地尼的藥物組合物，該藥物組合物中含有頭孢地 尼和一種天然產物，頭孢地尼和該天然產物可以協同保護腦缺血再灌注損傷。
[0006] 本發明的上述目的是通過下面的技術方案得以實現的：
[0007] 一種具有下述結構式的化合物（I)，
[0009] -種頭孢地尼的藥物組合物，包括頭孢地尼、如權利要求1所述的化合物（I)和藥 學上可以接受的載體，制備成需要的劑型。
[0010] 進一步地，藥學上可以接受的載體包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、 崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體或潤滑劑。
[0011] 進一步地，所述劑型包括片劑、膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、 膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。
[0012]上述化合物（I)的制備方法，包含以下操作步驟：（a)將矮地茶粉碎，用80~90%乙 醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃 取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中正丁醇取物用 大孔樹脂除雜，先用30 %乙醇洗脫6個柱體積，再用85 %乙醇洗脫12個柱體積，收集85 %洗 脫液，減壓濃縮得85%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中85%乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分 離，依次用體積比為100:1、50:1、25:1和12:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個組分；（d) 步驟(c)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為20:1、12:1和2:1的二氯甲烷-甲 醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體 積百分濃度為88%的甲醇水溶液等度洗脫，收集13~16個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮 得到化合物(I)。
[0013]進一步地，化合物（I)的制備方法中，步驟(a)用85%乙醇熱回流提取，合并提取 液。
[0014]進一步地，化合物（I)的制備方法中，所述大孔樹脂為D101型大孔吸附樹脂。
[0015]進一步地，化合物（I)的制備方法中，步驟(a)中用二氯甲烷代替乙酸乙酯進行萃 取，得到二氯甲烷萃取物。
[0016] 上述化合物(I)在制備保護腦缺血再灌注損傷的藥物中的應用。
[0017] 上述頭孢地尼的藥物組合物在制備保護腦缺血再灌注損傷的藥物中的應用。
[0018] 本發明的優點：
[0019] 本發明提供的頭孢地尼的藥物組合物中含有頭孢地尼和一種結構新穎的天然產 物，頭孢地尼和該天然產物單獨作用時，對腦缺血再灌注損傷具有保護作用;二者聯合作用 時，對腦缺血再灌注損傷的保護效果進一步提高，可以開發成保護腦缺血再灌注損傷的藥 物。本發明與現有技術相比具有突出的實質性特點和顯著的進步。
【具體實施方式】
[0020] 下面結合實施例進一步說明本發明的實質性內容，但并不以此限定本發明保護范 圍。盡管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對 本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質和范圍。
[0021 ]實施例1:化合物(I)分離制備及結構確證
[0022] 試劑來源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購自上海凌峰化 學試劑有限公司，甲醇，分析純，購自江蘇漢邦化學試劑有限公司。
[0023]分離方法：（a)將矮地茶(2kg)粉碎，用85%乙醇熱回流提取（15LX 3次），合并提取 液，濃縮至無醇味（3L)，依次用石油醚（3L X 3次）、乙酸乙酯（3L X 3次）和水飽和的正丁醇 (3LX3次）萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中 乙酸乙酯萃取物用D101型大孔樹脂除雜，先用30%乙醇洗脫6個柱體積，再用85%乙醇洗脫 12個柱體積，收集85%洗脫液，減壓濃縮得85%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中85%乙醇洗 脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為100:1 (12個柱體積）、50 :1 (10個柱體積）、25:1 (8個柱體積)和12:1(8個柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個組分；（d)步驟(c)中組 分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為20:1(6個柱體積）、12:1(8個柱體積)和2:1(6 個柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵 合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為88 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集13~16個柱體積 洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到化合物（I) (HPLC歸一化純度大于98% )。
[0024] 結構確證:冊431-1^顯示[1?1]+為111/2 317.2073，結合核磁特征可得分子式為 C20H28O3，不飽和度為7。核磁共振氫譜數據5H(ppm，pyridine_d5，500MHz):H-1 (6 ? 46，dd，J = 4.8，10.6Hz)，H-2a(3.39，m)，H-2b(3.10，m)，H-3(6.85，m)，H-5a(3.23，d，J=15.6Hz)，H-5b (2.98，dd，J=15.6,9.3Hz)，H-6(5.06，dd，J = 9.3，1.4Hz)，H-7(1.87，m)，H-8(1.46，m)，H-9a(2.13，dd，J = 16.1，2.6Hz)，H-9b(1.67，dd，J=16.1，7.3Hz)，H-ll(1.80，m)，H-12(0.93， d，J = 5.7Hz)，H-13(1 ? 13，d，J = 5.7Hz)，H-14(1 ? 19，d，J = 6.8Hz)，H-3'（7.01，m)，H-4' (1.65，(1，了 = 7.31^)，11-5'（1.84,8);核磁共振碳譜數據5(；(卩卩111，口5^1(1;[116-(15，1251他） ： 132.4(CH，1-C)，29.6(CH2,2-C)131.7(CH，3-C)，132.4(C，4-C)，28.3(CH2,5-C)，77.4(CH，6-C)，52.7(CH，7-C)，22.4(CH，8-C)，32.5(CH 2,9-C)，158.6(C，10-C)，26.4(CH，n-C)，22.1 (CH3，12-C)，23.8(CH 3，13-C)，18.4(CH3，14-C)，171.2(C，15-C)，201.1(C，r-C)，128.8(C， 2'-C)，138.5(CH，3'-C)，14.7(CH 3,4'-C)，13.3(CH3,5'-C)。紅外波譜中的1756cm-1 吸收帶 與UV譜中的236nm吸收帶表明該化合物含有a，不飽和內酯結構，紅外波譜中的1714cnf1與 1682cm- 1吸收帶表明結構中存在酮基與雙鍵片段。13C-NMR、DEPT和HSQC譜中顯示有20個碳 信號，包括五個甲基，三個亞甲基，七個次甲基（一個連氧碳和三個烯烴碳），以及五個季碳 (兩個羰基碳和三個烯烴碳），以上功能結構再結合不飽和數表明該化合物為雙環結構。 1H-NMR譜結合HSQC譜顯示五個甲基質子信號SH 0.93(3H，d，J = 5.7Hz)、l. 13(3H，d，J = 5.7Hz)、1.19(3H，d，J = 6.8Hz)、1.65(3H，d，J = 7.3Hz)、1.84(3H，s)，三組亞甲基質子信號 SH 3.39(lH，m)與3.10(111，111)、3.23(111，(1，了=15.61^)與2.98(111，(1(1，了=15.6,9.31^)、 2.13(111，(1(1，1=16.1，2.6抱）與1.67(111，(1(1，1=16.1，7.31^)，三個烯烴質子信號5[ 16.46 (111，(1(1，1 = 4.8，10.6泡）、6.85(111，111)與7.01(111，111)，一個連氧次甲基質子信號5[15.06 (111，(1(1，了 = 9.3，1.4抱），三個次甲基質子信號5[11.87(111，111)、1.46(111，111)、1.80(111，111)。 111 COSY譜中存在H-1 /H2-2/H-3、H2-5/H-6/H-7/H-8/H2-9、H-7/H-11 /H3-12、H-11 /H3-13 以 及H-8/H3-14相關信號，結合HMBC譜中顯示的H2-2和H2-9與C-1以及H 2-2、H2-5和H-6與C-4相 關信號可以構建吉馬烷型倍半萜骨架。HMBC譜中H-3'與C-2'和C-4'相關信號可以構建2'-甲基_2'_ 丁烯酮基片段。另外HMBC譜H-3、H2-5和H-6與C-15相關信號暗示C-6與C-15之間存 在一個內酯環結構。N0ESY譜中，H-8為構型，H-9b與H-8存在相關信號，所以H-9a與H-2a以 及H_9a與H_5a的相關性表明H-2a、H_5a和H_9a皆為a構型，同時H_2a與H_5a相關信號表明 A 3(4)雙鍵為E構型。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和N0ESY譜，以及文獻關于相關類型核磁數據， 可基本確定該化合物如下所示，立體構型進一步通過ECD試驗確定，理論值與實驗值基本一 致。該化合物化學式及碳原子編號如下：
[0026] 實施例2:藥理作用
[0027] 1、材料與方法
[0028] 1.1動物
[0029] 60只成年健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，SPF級，體重280_300g，由北京維通 利華實驗動物技術有限公司提供。實驗過程中大鼠的飼養環境穩定，室溫(25±2)°C，相對 濕度(55 ± 5) %，燈光控制12h晝夜交替。
[0030] 1.2試劑與樣品
[0031] 頭孢地尼購自中國食品藥品檢定研究院。化合物（I)自制，制備方法見實施例1。依 達拉奉注射液（國藥集團國瑞藥業有限公司）。兔抗鼠 GFAP抗體，兔抗鼠 Iba 1抗體購自 Ve c tor公司；兔抗鼠 TNF-a抗體、兔抗鼠 IL-1 、兔抗鼠 VCAM-1抗體、兔抗鼠 I CAM-1抗體購自 San-ta-Cruz;辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG購自美國Pierce Biotechnology公司。
[0032] 1.3儀器
[0033] SZX16型顯微鏡（日本Olympus公司）；冰凍切片機（萊卡，德國）；PowerGen 125型組 織勻漿機(塞默飛世爾公司）;GS-15R離心機(Beckinan公司，美國）。
[0034] 1.4動物分組與給藥
[0035] 60只成年健康雄性SD大鼠，隨機分為假手術組、缺血再灌注模型組、伊達拉奉給藥 組（3mg ? kg-:)、頭孢地尼組（20mg ? kg-:)、化合物（I)組（20mg ? kg-:)、頭孢地尼與化合物 (I)組合物組【l〇mg ? kg<頭孢地尼+10mg ? kg<化合物（I)】，每組10只。各組分別于再灌注 即刻由尾靜脈注射給藥，假手術組與模型組給予2ml生理鹽水。
[0036] 1.5MCA0法建立大鼠腦缺血/再灌注模型
[0037] SD大鼠術前12h禁食，10%水合氯醛(350mg ? kg<)腹腔注射麻醉，仰臥位固定。參 照Longa等的大腦中動脈線栓法，造成左側大腦中動脈阻塞。缺血2h后，將栓線向外拉出至 頸內實現再灌注。假手術組只進行術前麻醉和血管分離術，不結扎及導入線栓。
[0038] 1.6神經功能缺損評分
[0039] 再灌注24h后進行大鼠神經行為學觀察。參照Longa等的5級4分制：0分，無神經功 能缺失癥狀;1分，不能完全伸展對側前爪;2分，爬行時出現對側轉圈；3分，行走時向對側傾 倒;4分，不能自發行走，意識喪失。
[0040] 1.7Western Blot檢測TNF-a、IL-10、VCAM-l、ICAM_l的表達
[0041] 動物行I/R手術24h后，4%多聚甲醛灌注固定，斷頭取腦，冠狀切取前囪前1.0mm至 前囪后3.0臟的腦組織，進行勻漿。在冰上加蛋白裂解液裂解，然后在4°(：下1200(^?1^1^離 心5min，進行蛋白含量的測定，SDS-PAGE電泳，轉膜，封閉，TNF-a(l:500)，IL-lf3(l:200)， VCAM-1 (1:200)、ICAM-1 (1:200)-抗4°C 下孵育24h后TBST洗滌3次;二抗37°C孵育lh，ECL化 學發光，暗室顯影，定影，對膠片進行掃描與拍照并進行分析。
[0042] 1.8統計學方法
[0043]實驗數據用SPSS 11.5統計軟件分析，所得結果以x±s表示，組間均數的比較采用 t檢驗，2組以上均數的比較采用方差分析，P〈0.05為差異有統計學意義。
[0044] 2實驗結果
[0045] 2.1對腦缺血再灌注大鼠神經癥狀學的影響
[0046] 再灌注24h，各組大鼠無死亡，模型組大鼠表現出嚴重的神經功能缺損(P〈0.01)， 化合物（I)組、頭孢地尼組、依達拉奉組均能顯著降低缺血再灌注造成的神經損害(P〈〇.05， P〈0.05，P〈0.05)，頭孢地尼和化合物（I)組效果更顯著，P〈0.01。見表1。
[0047] 表1對腦缺血再灌注大鼠神經癥狀學的影響
[0049] 2.2對腦缺血再灌注大鼠TNF-a、IL-HVCAM-1、ICAM-1表達的影響
[0050] 腦缺血/再灌注24h后，缺血區皮層組織中細胞因子TNF-a、IL-ie以及黏附分子 VCAM-1、ICAM-1蛋白表達顯著增加，頭孢地尼組、化合物（I)組于缺血后早期給藥對于了冊-a、IL-lf3、VCAM_l、ICAM-1的表達均有不同程度的抑制作用，差異顯著(P〈0.05);頭孢地尼與 化合物（I)組合物組進一步抑制各蛋白表達(P〈〇.01)，效果更顯著。見表2。
[0051 ] 表2各組大鼠腦組織中TNF-a、IL-10、VCAM-l、ICAM-l蛋白表達量
[0053]以上結果表明，頭孢地尼、化合物（I)均能明顯提高腦缺血再灌注大鼠的神經功能 評分及明顯降低炎性細胞因子TNF-a、IL-1P和黏附分子VCAM-1、ICAM-1的表達水平，兩者合 用效果優于單用，可以開發成為保護腦缺血再灌注損傷的藥物。
[0054]上述實施例的作用在于說明本發明的實質性內容，但并不以此限定本發明的保護 范圍。對本發明技術方案進行修改或者等同替換不脫離本發明技術方案的實質和保護范 圍。
【主權項】
1. 一種具有下述結構式的化合物α)，2. -種頭孢地尼的藥物組合物，其特征在于:包括頭孢地尼、如權利要求1所述的化合 物(I)和藥學上可以接受的載體，制備成需要的劑型。3. 根據權利要求2所述的頭孢地尼的藥物組合物，其特征在于:藥學上可以接受的載體 包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體 或潤滑劑。4. 根據權利要求2所述的頭孢地尼的藥物組合物，其特征在于:所述劑型包括片劑、膠 囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、 栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。5. 權利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于，包含以下操作步驟：（a)將矮 地茶粉碎，用80~90%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙 酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b) 步驟(a)中正丁醇取物用大孔樹脂除雜，先用30%乙醇洗脫6個柱體積，再用85%乙醇洗脫 12個柱體積，收集85%洗脫液，減壓濃縮得85%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中85%乙醇洗 脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為100:1、50:1、25:1和12:1的二氯甲烷-甲醇梯度 洗脫得到4個組分；（d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為20:1、12:1 和2:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的 反相硅膠分離，用體積百分濃度為88 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集13~16個柱體積洗脫 液，洗脫液減壓濃縮得到化合物(I)。6. 根據權利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:步驟(a)用85%乙醇熱回 流提取，合并提取液。7. 根據權利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:所述大孔樹脂為D101型 大孔吸附樹脂。8. 根據權利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:步驟(a)中用二氯甲烷代 替乙酸乙酯進行萃取，得到二氯甲烷萃取物。9. 權利要求1所述的化合物（I)在制備保護腦缺血再灌注損傷的藥物中的應用。10. 權利要求2~4任一所述的頭孢地尼的藥物組合物在制備保護腦缺血再灌注損傷的 藥物中的應用。
【文檔編號】A61K31/343GK105820144SQ201610258309
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年4月23日
【發明人】吳珺
【申請人】吳珺