一種氮氣加壓乙醇置換提取洋蔥細胞中異蒜氨酸的方法
【專利摘要】本發明屬于農產品精深加工領域，公開了一種氮氣加壓乙醇置換提取洋蔥細胞中異蒜氨酸的方法；提取步驟依次是：洋蔥預處理、氮氣加壓乙醇置換提取異蒜氨酸、氮氣保護減壓蒸餾濃縮提取液、陽離子交換樹脂分離異蒜氨酸和多糖、重結晶得到異蒜氨酸；本發明的特點是不破碎洋蔥，不高溫或微波加熱，不滅活洋蔥中的酶，在氮氣保護下，將乙醇壓入洋蔥細胞中置換出細胞質中的異蒜氨酸，但不提取液泡中的酶，不發生異蒜氨酸的酶解反應，能得到純品異蒜氨酸，而不是酶解產物蒜素（洋蔥精油）。異蒜氨酸提取率可達到0.426 mg/g，是理論提取率的70%；經過重結晶得到純度為99%的異蒜氨酸。
【專利說明】
一種氮氣加壓乙醇置換提取洋蔥細胞中異蒜氨酸的方法
技術領域
[0001]本發明屬于農產品精深加工技術，是一種從洋蔥中提取活性成份的方法，具體涉及一種氮氣加壓乙醇置換提取洋蔥細胞中異蒜氨酸的方法。
【背景技術】
[0002]洋蔥，屬于多年生草本植物，是百合科蔥屬植物的一種，具有藥食兩用的功能。現代醫學研究表明，洋蔥具有殺菌、調血脂、抑制血小板聚集、降血壓、防治動脈粥樣硬化、降血糖、抗癌等功效，尤其是具有預防心血管疾病和抗癌等方面的生物活性。
[0003]洋蔥中的主要活性成份是異蒜氨酸，即反式S-烯丙基-L-半胱氨酸亞砜，S-allyl-L-cysteine sulfoxide,即allium cepa。它對多種病原菌有抑殺作用，是天然的植物殺菌素，對不少細菌性、真菌性和原蟲性感染，均有治療和預防價值，在生物醫藥研究開發方面具有很大的作用，被世界醫學界稱為“二十一世紀在天然藥物領域中的最偉大神奇發現之一”。近幾年來這一極性單體一一(異)蒜氨酸引起了各國學者的高度重視。
[0004]本領域的技術人員周知:異蒜氨酸在洋蔥細胞的細胞質中，蒜氨酸酶和催淚因子酶在細胞的液泡中，完整的細胞中，兩者是隔離開的，只有細胞破碎后，液泡中的酶釋放出來，蒜氨酸酶酶解異蒜氨酸，生成少量含硫化合物，稱為蒜素(硫代亞磺酸酯，TS)和催淚因子酶酶解異蒜氨酸生成大量揮發性催淚因子(LF)，是洋蔥自我保護的一種措施。因此，要提取異蒜氨酸，就不能和酶接觸。
[0005]純品異蒜氨酸的提取條件非常苛刻，技術難度很大，其化學性質極不穩定，在搗碎破損的情況下極易和洋蔥中的蒜氨酸酶和催淚因子酶反應轉化成蒜素和氣體物質，在空氣和高溫中極易氧化變質。這使得高純度異蒜氨酸的國際市場價格非常昂貴，異蒜氨酸標樣的價格為1200元/5 mg。因此，高純異蒜氨酸制品和高純藥用異蒜氨酸具有極高的商業價值。
[0006]目前洋蔥精油的提取方法主要有水蒸汽蒸餾法、溶劑浸提法、超臨界CO2萃取法和酶滅活法。
[0007]水蒸汽蒸餾法:常壓水蒸汽蒸餾法得到的洋蔥精油呈熟洋蔥氣味，主要成份是丙基、丙稀基二硫化合物，不是異蒜氨酸。減壓法能制得含新鮮洋蔥風味的精油蒜素(TS),但得率僅達到0.113%0。
[0008]溶劑浸提法:用乙醚、乙醇溶劑浸提時，獲得的是含有甲基、丙基二硫化合物，不是異蒜氨酸，以二氯甲烷為溶劑浸提時獲得了甲基、丙烯基蒜素(TS)，得率約為水蒸氣蒸餾法的3.5倍。
[0009]超臨界CO2萃取法:九十年代以來，該法廣泛用于洋蔥精油的提取，獲得了具有新鮮洋蔥風味的精油蒜素(TS)，精油得率為0.23%。?0.38%o。
[0010]酶滅活法:在洋蔥打漿前先用沸水滅活蒜氨酸酶和催淚因子合成酶，再用二氯乙烷提取異蒜氨酸，然后用外源酶一一蒜酶分解異蒜氨酸，制備蒜素，避免變成催淚因子揮發掉，報道的精油得率是0.921%。，其中蒜素(TS)含量為71.3%。
[0011]新疆埃樂欣藥業有限公司提交的發明專利申請(申請號為201410622904.8、公開號為CN104498351A、發明名稱為低溫隔絕空氣大蒜辣素生產裝置及其使用方法)所公開的技術方案是通過蒜酶催化蒜氨酸裂合生物合成大蒜辣素，微濾和超濾純化大蒜辣素，循環萃取和分子蒸餾液液分離，物理除菌和充氬預裝，隔絕空氣，降低合成溫度，避免分解。
[0012]云南農業大學提交的申請號為201410354130.5的發明專利申請，公布了一種同時制備大蒜多糖和蒜氨酸的方法，采取的技術方案是應用微波滅活蒜氨酸酶，膜分離、離子交換和結晶，同時制得大蒜多糖和蒜氨酸。
[0013]齊魯工業大學提交的申請號為201410296457.1的發明專利申請，公布了一種超聲輔助雙水相提取蒜氨酸的方法，采取的技術方案是將大蒜粉加入雙水相中，用無機鹽的緩沖溶液和小分子有機溶劑制得雙水相，調節雙水相PH值為2.0-4.0，超聲提取，離心分離，靜置分層，雙相中都有蒜氨酸。
[0014]深圳勁創生物技術有限公司提交的申請號為201410101556.X的發明專利申請提出了一種制備蒜氨酸微乳液的方法，因蒜氨酸難溶于有機溶劑而影響使用，提出用水、油和表面活性劑制備微乳液，穩定且能防止空氣氧化。
[0015]江蘇大學的專利號為201210322853.8發明專利，公開了一種脈沖超聲輔助提取大蒜中蒜氨酸的方法。米取的技術方案是將大蒜用水浴加熱滅酶，打碎，脈沖超聲提取，超濾膜分離，得到蒜氨酸。
[0016]近年來，還提出了一些新的方法，如離子液體在洋蔥精油制取中的應用研究，洋蔥精油的多次精館if禹合提取，超臨界流體萃取技術在洋蔥精油尚效提取中的應用。所制備的洋蔥精油中主要物質為含硫化合物，即硫代亞磺酸酯TS，而不是異蒜氨酸純品。
[0017]綜上所述，洋蔥精油的提取米用兩類方法:酶解法制備蒜素和滅酶法制備異蒜氨酸。酶解法的缺點是生成大量揮發性催淚因子，嚴重浪費昂貴的異蒜氨酸;滅酶法的缺點是高溫導致部分異蒜氨酸變質。
【發明內容】
[0018]本發明的目的是提供一種氮氣加壓乙醇置換提取洋蔥細胞中異蒜氨酸的方法，該方法在室溫下氮氣保護制備純品異蒜氨酸，不破壞細胞結構，不發生酶解，氮氣保護，隔絕空氣，室溫提取，避免高溫，防止氧化變質。
[0019]為了實現上述目的，本發明采取的技術方案如下:一種氮氣加壓乙醇置換提取洋蔥細胞中異蒜氨酸的方法，提取步驟依次是:洋蔥預處理、氮氣加壓乙醇置換提取異蒜氨酸、氮氣保護減壓蒸餾濃縮提取液、陽離子交換樹脂分離異蒜氨酸和多糖、重結晶得到異蒜氨酸;具體方法如下:
(I)洋蔥預處理
將洋蔥去掉外皮，切頭去尾，一切兩半，立即用去離子水洗凈切口，避免切口酶殘留，分成瓣;按照洋蔥質量份/無水乙醇體積份為I /3的比例，將洋蔥稱重后，放入不銹鋼提取罐。
[0020](2)氮氣加壓乙醇置換提取異蒜氨酸
向不銹鋼提取罐加入無水乙醇，密封，用氮氣保護；用氮氣鋼瓶的減壓閥調節氮氣壓力至0.1?0.7 MPa，打開提取罐進氣閥，將壓力為0.1?0.7 MPa的氮氣通入提取罐中，使提取罐壓力達到設定壓力即0.I?0.7 MPa，保壓時間0.5?2.5h，打開提取罐上部放氣閥，泄壓至0.1MPa后，將提取液從下部取樣閥中全部放出，迅速轉移至旋轉蒸發儀中，用氮氣保護。[0021 ] (3)氮氣保護減壓蒸餾濃縮提取液
用旋轉蒸發儀減壓蒸餾濃縮提取液，真空度0.08MPa，溫度50°C，旋轉蒸發儀中通入氮氣隔絕空氣，防止異蒜氨酸高溫氧化，至乙醇溶劑回收約95%后，停止濃縮，得到粘稠狀黃色液體。
[0022](4)氮氣氛圍陽離子交換樹脂分離異蒜氨酸和多糖
將粘稠狀黃色液體20g加200mL超純水溶解后抽濾，去除纖維等大部分不溶性物質得淡黃色清液;量取200mL處理好的732樹脂裝柱，用超純水沖洗至流出液無色;再將淡黃色清液用HCl調節至pH為2，在氮氣氛圍下以0.5BV/h的流速上樣；之后用pH為3?4的鹽酸溶液以lBV/h的流速沖洗至墨式試劑檢測呈陰性，鹽酸溶液沖洗期間要用茚三酮溶液檢測在洗糖的過程中是否有氨基酸泄露;再改用清水清洗柱子至PH為7，清水清洗期間仍然要用茚三酮溶液檢測在洗糖的過程中是否有氨基酸泄露，流出液是多糖溶液;之后用0.5 mol/L氨水溶液將異蒜氨酸洗脫。
[0023](5)重結晶得到異蒜氨酸
將氨水洗脫液在氮氣保護下減壓蒸餾，真空度0.0SMPa，溫度50°C，得到濃縮液，用超純水溶解濃縮液，再次過濾上柱，用氨水洗脫，再次減壓蒸餾，加無水乙醇，重結晶得到純品異蒜氨酸。
[0024]步驟(I):洋蔥預處理時，其實質性特點是不破碎洋蔥，不加熱，不滅酶;步驟(2)其實質性特點是:在氮氣壓力下，乙醇通過細胞壁進入細胞中，將細胞質置換出來，異蒜氨酸隨之擴散到細胞外的乙醇中，溶于乙醇水溶液中，由于致密的液泡膜的阻礙，乙醇進不到液泡中，酶不會擴散出來;步驟(3)中旋轉蒸發儀中通入氮氣隔絕空氣，防止異蒜氨酸高溫氧化;步驟(4)其實質性特點是:將蒸餾液溶于適量超純水中，過濾后用處理過的732陽離子交換樹脂吸附分離多糖和異蒜氨酸，流出液是多糖，異蒜氨酸吸附在樹脂上，用氨水洗脫收集。
[0025]本發明用氮氣加壓無水乙醇置換提取法單獨提取異蒜氨酸，是在室溫下氮氣保護制備純品異蒜氨酸，不破壞細胞結構，不發生酶解，氮氣保護，隔絕空氣，室溫提取，防止氧化變質。特點是不破碎洋蔥，不高溫或微波加熱，不滅活洋蔥中的酶，在氮氣保護下，將乙醇壓入洋蔥細胞中置換出細胞質中的異蒜氨酸，但不提取液泡中的酶，不發生異蒜氨酸的酶解反應，能得到純品異蒜氨酸，而不是酶解廣物蒜素(洋蔥精油)O異蒜氨酸提取率可達到
0.426 mg/g，是理論提取率的70%;經過重結晶得到純度為99%的異蒜氨酸。
【附圖說明】
[0026]圖1是異蒜氨酸標準品工作曲線圖；
圖2是異蒜氨酸標準品尚效液相色譜圖，其中峰4是蒜氨酸:
圖3是提取壓力0.6MPa，提取時間1.5的提取液的高效液相色譜圖，其中峰5是異蒜氨酸；
圖4是不同壓力下，提取液中異蒜氨酸含量C與提取時間T的關系曲線圖；
圖5是提取液中異蒜氨酸含量C、壓力P與提取時間T的變化曲線圖。
【具體實施方式】
[0027]本部分提供的是本發明的35個對比試驗例，主要對比試驗數據是步驟2的提取時間與提取壓力，其中提取時間選擇:0.5 h、l h,l.5 h、2 11與2.5 h五個時間值;提取壓力選擇:0.1 MPa、0.2 MPa、0.3 MPa、0.4 MPa、0.5 MPa、0.6 MPa與 0.7MPa七個壓力值；35個試驗中，每個試驗使用一個洋蔥試樣即經過預處理的200g洋蔥；在0.1 MPa的壓力之下，分別作了0.5 h、l h,l.5 h、2 11與2.5 h五個時間值的試驗例，在0.2 MPa的壓力之下，又分別作了0.5 h、l h,l.5 h、2 11與2.5 h五個時間值的試驗例，以此類推，完成35個試驗例。
[0028]試驗例I;
1、洋蔥預處理
將洋蔥去掉外皮，切頭去尾，一剖兩半，分成散瓣，先用清水沖洗3遍，再用去離子水洗滌3次，洗凈切口汁液，避免切口殘留酶而發生酶解反應。
[0029]2、提取異蒜氨酸
選用無水乙醇作溶劑，氮氣加壓，將200 g洋蔥瓣放入裝有600 mL乙醇的不銹鋼提取罐中，用氮氣保護、加壓密閉提取。用減壓閥將氮氣鋼瓶的氮氣壓力調節至0.1MPa，打開提取罐進氣閥，將壓力為0.1MPa的氮氣通入提取罐中，保持提取罐壓力為0.1MPa，保壓時間
0.5h;而后打開提取罐放氣閥泄壓，而后將提取液從提取罐取樣閥口全部放出，迅速轉移至旋轉蒸發儀中，用氮氣保護。
[0030]3、提取液的處理
3.1從提取液中取出2 mL，在10000 rad/min下離心15 min，將離心后的液體_10°C保存，用于高效液相色譜分析；
3.2將提取液在氮氣保護的條件下，在溫度50°C真空度0.08 MPa的工藝條件下，用旋轉蒸發儀減壓蒸餾，去除95%的乙醇溶劑，得到黃色粘稠狀液體。旋轉蒸發儀中通入的氮氣隔絕空氣，防止異蒜氨酸高溫氧化。
[0031]4、氮氣氛圍陽離子交換樹脂分離異蒜氨酸和多糖
4.1將旋蒸得到的黃色粘稠狀液體20 g加200 mL超純水溶解后抽濾，去除纖維等大部分不溶性物質得淡黃色清液。量取200 mL處理好的732樹脂裝柱，用超純水沖洗至流出液無色，再將上述淡黃色清液用HCl調節至pH=2，在氮氣氛圍下以0.5 BV/h的流速上樣，之后用PH3.5的鹽酸溶液以I BV/h的流速沖洗至墨式試劑檢測呈陰性(期間要用茚三酮溶液檢測在洗糖的過程中是否有氨基酸泄露)，改用清水清洗柱子(期間仍然要檢測氨基酸是否泄露)至pH=7，流出液是多糖溶液。之后用0.5 mol/L氨水溶液將異蒜氨酸洗脫，洗脫過程中用TLC檢測，將相同的流分富集。
[0032]4.2異蒜氨酸的檢測(TLC):用玻璃毛細管在薄層色譜板上點樣后吹干，用正丁醇:冰乙酸:水=4:1:1作為展開液展開，至前沿約Icm時取出，吹干，蘸取茚三酮溶液，吹干后烘箱中75 °C烘干10 min，觀察斑點及斑點的顯色情況。
[0033]4.3異蒜氨酸含量的HPLC測定:采用反相高效液相色譜對提取物中異蒜氨酸的含量進行檢測。色譜柱為ODS C18 (250mmX4.6mm,5ym)，二極管點陣檢測器，檢測波長210nm，流動相的體積比為甲醇:水體系=3:7，流速為0.8 mL/min，柱溫為25°C，進樣量20yL。
[0034]本實驗考察不同流動相配比對異蒜氨酸分離度的影響，采用甲醇:水=1: 99?99: I(體積比)范圍內。結果表示甲醇:水體系=3:7時分離效果最好。
[0035]5、重結晶得到異蒜氨酸
將氨水洗脫液在氮氣保護下減壓蒸餾，真空度0.08 MPa，溫度50°C，得到濃縮液，用超純水溶解濃縮液，再次過濾上柱，用氨水洗脫，再次減壓蒸餾，加無水乙醇，重結晶得到純品異蒜氨酸。
[0036]試驗例2;
1、洋蔥預處理:同試驗例I;
2、提取異蒜氨酸:保壓時間1.0h;余同試驗例I;
3、提取液的處理:同試驗例I；
4、陽離子交換樹脂分離異蒜氨酸和多糖:同試驗例I;
5、重結晶得到異蒜氨酸；同試驗例I。
[0037]試驗例3;
1、洋蔥預處理:同試驗例I;
2、提取異蒜氨酸:保壓時間1.5h;余同試驗例I;
3、提取液的處理:同試驗例I；
4、陽離子交換樹脂分離異蒜氨酸和多糖:同試驗例I;
5、重結晶得到異蒜氨酸；同試驗例I。
[0038]試驗例4;
1、洋蔥預處理:同試驗例I;
2、提取異蒜氨酸:保壓時間2.0h;余同試驗例I ；
3、提取液的處理:同試驗例I；
4、陽離子交換樹脂分離異蒜氨酸和多糖:同試驗例I;
5、重結晶得到異蒜氨酸；同試驗例I。
[0039]試驗例5;
1、洋蔥預處理:同試驗例I;
2、提取異蒜氨酸:保壓時間2.5h;余同試驗例I ；
3、提取液的處理:同試驗例I；
4、陽離子交換樹脂分離異蒜氨酸和多糖:同試驗例I;
5、重結晶得到異蒜氨酸；同試驗例I。
[0040]試驗例6;
1、洋蔥預處理:同試驗例I;
2、提取異蒜氨酸:用減壓閥將氮氣鋼瓶的氮氣壓力調節至0.2MPa，打開提取罐進氣閥，將壓力為0.2MPa的氮氣通入提取罐中，保持提取罐壓力為0.2MPa，保壓時間0.5h;余同試驗例I;
3、提取液的處理:同試驗例I；
4、陽離子交換樹脂分離異蒜氨酸和多糖:同試驗例I;
5、重結晶得到異蒜氨酸；同試驗例I。
[0041 ]試驗例7;步驟2中:保壓時間1.0h，余同試驗例6ο其它步驟同試驗例I。
[0042]試驗例8;步驟2中，保壓時間1.5h，余同試驗例6。其它步驟同試驗例I。
[0043]試驗例9;步驟2中，保壓時間2.0h，余同試驗例6。其它步驟同試驗例I。
[0044]試驗例10;步驟2中，保壓時間2.5h，余同試驗例6。其它步驟同試驗例I。
[0045]試驗例11;步驟2中:用減壓閥將氮氣鋼瓶的氮氣壓力調節至0.3MPa，打開提取罐進氣閥，將壓力為0.3MPa的氮氣通入提取罐中，保持提取罐壓力為0.3MPa，保壓時間0.5h;余同試驗例I ο其它步驟同試驗例I。
[0046]試驗例12;步驟2中:保壓時間1.0h，余同試驗例11。其它步驟同試驗例I。
[0047]試驗例13;步驟2中:保壓時間1.5h，余同試驗例11。其它步驟同試驗例I。
[0048]試驗例14;步驟2中:保壓時間2.0h，余同試驗例11。其它步驟同試驗例I。
[0049]試驗例15;步驟2中:保壓時間2.5h，余同試驗例11。其它步驟同試驗例I。
[0050]試驗例16;步驟2中:用減壓閥將氮氣鋼瓶的氮氣壓力調節至0.4MPa，打開提取罐進氣閥，將壓力為0.4MPa的氮氣通入提取罐中，保持提取罐壓力為0.4MPa，保壓時間0.5h;余同試驗例I ο其它步驟同試驗例I。
[0051]試驗例17;步驟2中:保壓時間1.0h，余同試驗例16。其它步驟同試驗例I。
[0052]試驗例18;步驟2中:保壓時間1.5h，余同試驗例16。其它步驟同試驗例I。
[0053]試驗例19;步驟2中:保壓時間2.0h，余同試驗例16。其它步驟同試驗例I。
[0054]試驗例20;步驟2中:保壓時間1.5h，余同試驗例16。其它步驟同試驗例I。
[0055]試驗例21;步驟2中:用減壓閥將氮氣鋼瓶的氮氣壓力調節至0.5MPa，打開提取罐進氣閥，將壓力為0.5MPa的氮氣通入提取罐中，保持提取罐壓力為0.5MPa，保壓時間0.5h;余同試驗例I ο其它步驟同試驗例I。
[0056]試驗例22;步驟2中:保壓時間1.0h，余同試驗例21。其它步驟同試驗例I。
[0057]試驗例23;步驟2中:保壓時間1.5h，余同試驗例21。其它步驟同試驗例I。
[0058]試驗例24;步驟2中:保壓時間2.0h，余同試驗例21。其它步驟同試驗例I。
[0059]試驗例25;步驟2中:保壓時間2.5h，余同試驗例21。其它步驟同試驗例I。
[0060]試驗例26;步驟2中:用減壓閥將氮氣鋼瓶的氮氣壓力調節至0.6MPa，打開提取罐進氣閥，將壓力為0.6MPa的氮氣通入提取罐中，保持提取罐壓力為0.6MPa，保壓時間0.5h;余同試驗例I ο其它步驟同試驗例I。
[0061]試驗例27;步驟2中:保壓時間1.0h，余同試驗例26。其它步驟同試驗例I。
[0062]試驗例28;步驟2中:保壓時間1.5h，余同試驗例26。其它步驟同試驗例I。
[0063]試驗例29;步驟2中:保壓時間2.0h，余同試驗例26。其它步驟同試驗例I。試驗例30;步驟2中:保壓時間2.5h，余同試驗例26。其它步驟同試驗例I。試驗例31;步驟2中:用減壓閥將氮氣鋼瓶的氮氣壓力調節至0.7MPa，打開提取罐進氣閥，將壓力為0.7MPa的氮氣通入提取罐中，保持提取罐壓力為0.7MPa，保壓時間0.5h;余同試驗例I。其它步驟同試驗例I。
[0064]試驗例32;步驟2中:保壓時間1.0h，余同試驗例31。其它步驟同試驗例I。
[0065]試驗例33;步驟2中:保壓時間1.5h，余同試驗例31。其它步驟同試驗例I。試驗例34 ；步驟2中:保壓時間2.0h，余同試驗例31 ο其它步驟同試驗例I。
[0066]試驗例35;步驟2中:保壓時間2.5h，余同試驗例31。其它步驟同試驗例I。
[0067]試驗結果分析如下:
1、提取中加入提取罐的純乙醇為600 mL，得到的提取液為640?650 mL，說明提取過程中有部分水分從洋蔥細胞中浸出到乙醇溶液中，部分乙醇進入細胞中置換出了水分。
[0068]2、異蒜氨酸標準工作曲線
將異蒜氨酸標準品分別配制成濃度為25yg/mL，37.5yg/ mL，50yg/mL，62.5yg/mL，7 5yg/mL，100yg/mL，125yg/mL，150yg/mL的水溶液，采用高效液相色譜分別測量其積分面積，以濃度為橫坐標，積分面積為縱坐標做出工作曲線如圖1所示。
[0069]3、異蒜氨酸標準品和提取樣品高效液相色譜圖
異蒜氨酸標準品高效液相色譜圖如圖2所示，峰4是異蒜氨酸；圖3所示是提取壓力0.6MPa，提取時間1.5h的提取液高效液相色譜圖，峰5是異蒜氨酸。
[0070]4、提取液中異蒜氨酸含量和提取壓力及提取時間的關系
不同壓力下提取液中異蒜氨酸含量隨提取時間變化關系如圖4所示，1.5 h以后提取率不再上升，異蒜氨酸濃度在洋蔥細胞內外的乙醇溶液中達到平衡。壓力對提取率的影響如圖5所示，壓力0.6 MPa時，提取率最高，當壓力達到0.7 MPa時，提取率反而下降，原因是細胞中的液泡破裂，酶釋放出來，將部分異蒜氨酸酶解，提取率比0.6MP下降明顯。
【主權項】
1.一種氮氣加壓乙醇置換提取洋蔥細胞中異蒜氨酸的方法，其特征在于提取步驟依次是:洋蔥預處理、氮氣加壓乙醇置換提取異蒜氨酸、氮氣保護減壓蒸餾濃縮提取液、氮氣氛圍陽離子交換樹脂分離異蒜氨酸和多糖、重結晶得到異蒜氨酸;具體方法如下: (1)洋蔥預處理 將洋蔥去掉外皮，切頭去尾，一切兩半，立即用去離子水洗凈切口，避免切口酶殘留，分成瓣;按照洋蔥質量份/無水乙醇體積份為I /3的比例，將洋蔥稱重后，放入不銹鋼提取罐； (2)氮氣加壓乙醇置換提取異蒜氨酸 向不銹鋼提取罐加入無水乙醇，密封，用氮氣保護；用氮氣鋼瓶的減壓閥調節氮氣壓力至0.1?0.7 MPa，打開提取罐進氣閥，將壓力為0.1?0.7 MPa的氮氣通入提取罐中，使提取罐壓力達到0.1?0.7 MPa，保壓時間0.5?2.5h，打開提取罐上部放氣閥，泄壓至0.1MPa后，將提取液從下部取樣閥中全部放出，迅速轉移至旋轉蒸發儀中，用氮氣保護； (3)氮氣保護減壓蒸餾濃縮提取液 用旋轉蒸發儀減壓蒸餾濃縮提取液，真空度0.08MPa，溫度50°C，旋轉蒸發儀中通入氮氣隔絕空氣，至乙醇溶劑回收約95%后，停止濃縮，得到粘稠狀黃色液體； (4)氮氣氛圍陽離子交換樹脂分離異蒜氨酸和多糖 將粘稠狀黃色液體20g加200mL超純水溶解后抽濾，去除纖維等大部分不溶性物質得淡黃色清液;量取200mL處理好的732樹脂裝柱，用超純水沖洗至流出液無色;再將淡黃色清液用HCl調節至pH為2，在氮氣氛圍下以0.5BV/h的流速上樣；之后用pH為3?4的鹽酸溶液以lBV/h的流速沖洗至墨式試劑檢測呈陰性，鹽酸溶液沖洗期間要用茚三酮溶液檢測在洗糖的過程中是否有氨基酸泄露;再改用清水清洗柱子至PH為7，清水清洗期間仍然要用茚三酮溶液檢測在洗糖的過程中是否有異蒜氨酸泄露;之后用0.5 mol/L氨水溶液將異蒜氨酸洗脫； (5)重結晶得到異蒜氨酸 將氨水洗脫液在氮氣保護下減壓蒸餾，真空度0.0SMPa，溫度50°C，得到濃縮液，用超純水溶解濃縮液，再次過濾上柱，用氨水洗脫，再次減壓蒸餾，加無水乙醇，重結晶得到純品異蒜氨酸。
【文檔編號】C07C317/48GK105820097SQ201610336758
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年5月20日
【發明人】常彥龍, 于桂琴, 余楚舒, 常曦元, 呂靜
【申請人】蘭州大學