定量檢測膠質瘤中herc2p2表達量的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于核酸的測定和檢測方法領域，具體是一種定量檢測膠質瘤中皿RC2P2 表達量的方法。
【背景技術】
[0002] 長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA, Inc RNA)是近年來發現的RNA家族重 要成員，是指長度在200ntW上，并且不編碼蛋白的RNA。最初，運些非編碼的轉錄本被認為 是"暗物質'或"噪音"。近年來，隨著RNA研究技術和水平的不斷提高，人們發現非編碼RNA在 生物體中發揮著十分重要的功能。Lnc RNA能夠參與免疫系統的調控，X染色體的沉默，蛋白 質功能的調控等一系列生理功能。近期發現，皿RC2P2也是一個IncRNA，位于15號染色體 上，是肥RC2的假基因，共有6075個堿基，其與腫瘤的關系也十分密切。所W定量測定 肥RC2P2的表達量對腫瘤的預防和治療具有重要的臨床意義。 化qman探針法是高度特異性的定量PCR技術。其核屯、是利用化q酶的3 ' -5 '外切酶活性， 切斷探針，產生巧光信號。由于探針與模板是特異性結合，所W巧光信號的強弱就代表了模 板的數量。
[0003] 在化qman探針法的定量PCR反應體系中，包括一對PCR引物和一條探針。探針只與 模板特異性結合，其結合位點在兩條引物之前。探針的5'端標記有報告基團（Reporter，!?）， 如FAM，VIC等，3 '端標記有巧光澤滅基團（Quencher，Q)，如TAMRA等。當探針完整的時候，報 告基團所發射的巧光能量被澤滅基團吸收，儀器檢測不到信號。隨著PCR的進行，Taqman酶 在鏈延伸過程中遇到與模板結合的探針，其3 ' -5 '外切核酸酶活性就會將探針切斷，報告 基因遠離澤滅基團，其能量不能被吸收，及產生巧光信號。所W，每經過一個PCR循環，巧光 信號也和目的片段一樣，有一個同步指數增長的過程，信號強度就代表了模板DNA的拷貝 數。
[0004] 普通的SYBR Green Real Time PCR，巧光染料非特異性的結合在雙鏈DNA上，容易 受到非特異性擴增和引物二聚體的影響，而化qman探針法能夠顯著提高PCR檢測的靈敏性 和準確度。并且還能夠利用多種巧光同時進行多重分析，運也是普通SYBR等DNA結合巧光基 團所不具備的。
【發明內容】
[0005] 本發明就是為了填補定量檢測皿RC2P2表達量方法領域的空白，所提出的一種定 量檢測膠質瘤中肥RC2P2表達量的方法。
[0006] 本發明是按照W下技術方案實現的。
[0007] -種用于定量檢測膠質瘤中皿RC2P2表達量的探針和引物，上游引物的核酸序列 如Seq ID N0.1所示；下游引物的核酸序列如Seq ID ^.2所示；了曰9111曰]1探針核酸序列如 SeqIDN0.3所示。
[000引一種應用上述的探針和引物定量檢測膠質瘤中皿RC2P2表達量的方法，包括W下 步驟： a. 檢測樣本RNA的提取； b. 將步驟a中獲得RNA逆轉錄為cDNA; C.W步驟b中獲得的cDNA為模板，應用權利要求1所述的引物和探針，進行巧光定量 PCR，測定樣本中肥RC2P2表達量。
[0009] 本發明獲得了如下的有益效果。
[0010] 本發明有效的填補定量檢測皿RC2P2表達量方法領域的空白，能夠快速、精確、有 效的檢測膠質瘤中肥RC2P2表達量，對臨床膠質瘤病人級別和生存期預測具有指導意義。
【附圖說明】
[0011] 圖1是本發明化qman探針PCR過程圖； 圖2是本發明肥RC2P2的表達量與膠質瘤級別之間的關系圖； 圖3是本發明肥RC2P2的表達量與病人存活率之間的關系圖。
【具體實施方式】
[0012] 1.肥RC2P2基因的核巧酸序列化ene ID: 400322)
ataattacac ccatt 6075 2.實驗方法與結果 2.1檢測樣本RNA的提取 取小塊臨床樣本，加入1ml Trizol，超聲波勻漿破碎儀（美國聲能學公司（Sonics)， CV18)研磨。再加入0.2ml Ξ氯甲燒，搖勻后4°C 13000巧m離屯、15min，小屯、取上層水相， 轉移至干凈的離屯、管中，加入等體積的異丙醇，-20°C沉淀過夜。4°C 130(K)rpm離屯、lOmin， 離屯、管底部少量膠狀沉淀為RNA。棄去上清，用1ml 75%的乙醇震蕩清洗RNA沉淀，4°C 13000巧m離屯、lOmin。棄去上清，1ml無水乙醇震蕩清洗RNA沉淀，4°C 13000巧m離屯、 lOmin。棄去上清，室溫干燥5-lOmin，dd出0溶解。
[0013] 2.2 RNA逆轉錄為cDNA(普洛麥格公司，A5000) 反應體系為:RNA模板lug;01igo肌lul;出0 lOul; 65°C加熱5min，W打開二級結構，冰上冷卻； 繼續在反應體系中加入5X反應緩沖液4ul;RNA酶抑制劑lul;dNTP化1;逆轉錄酶 lul ； 42 °C反應1小時，70°C加熱5min，終止反應，得到膠質瘤臨床樣本cDNA。
[0014] 2.3引物和探針的設計 根據NCBI上皿RC2P2序列，設計化qman PCR引物及探針。根據引物設計原則，上下游引 物長度在15至30個堿基之間，GC含量在40%至60%，Tm值之間的差異在rC W內，上下游引物 之間無互補序列，且Real Time PCR序列的長度在300堿基W下。
[0015] 具體序列為： 肥 RC2P2 上游引物:GGCAGCACCTCCTACAG 肥 RC2P2 下游引物：CCTTTCAGTTTGGGCTTCAG 化qman探針一般設計原則為，探針位置盡可能地靠近上游引物;探針長度通常在25- 35個堿基，Tm值在65-70°C，通常比引物Tm高5-10°C，GC含量在40%-70%。探針的5'端應避免 使用堿基G。整條探針中，堿基C的含量要明顯高于G的含量。
[0016] 肥RC2P2探針：CGTCCTCTGTGTCCGAATCCTCCTCTGCTG 內參基因為GAPDH，其引物序列和換針序列為： GAPDH 上游引物：CCAACGTGTCAGTGGTGGAC GAPDH下游引物:TAGCCCAGGATGCCCTTGAG GAPDH 探針：TCCGACGCTGCTTCACCACCTCT 2.4巧光定量PCR測定樣本中肥RC2P2表達量(普洛麥格公司，A6001) 取lul膠質瘤樣本cDNA，稀釋至lOul，作為化qman探針PCR的模板。具體化qman探針 PCR的反應體系為： 稀釋后的cDNA板板 2ul 上游引物 lul 下游引物 lul Taqman 探針 lul Taqman mix lOul 出0 加1 PCR擴增程序為：95°C預變性10min:95°C變性20 s;58°C退火及延伸Imin;共40個循 環。
[0017]2.5臨床試驗 2.5.1肥RC2P2的表達量與膠質瘤級別之間的關系 用本發明所述方法在29例膠質瘤臨床樣本的cDNA中檢測肥RC2P2的表達，將編號為 1111的II級膠質瘤病人cDNA HERC2P2相對含量定義為1，得到其他膠質瘤病人cDNA 肥RC2P2的表達量，實驗結果如圖1、圖2和表1所示。
[0018] 實驗結果表明，其中II級14例，III級5例，IV級10例，肥RC2P2的表達量與 膠質瘤的級別負相關，其中II級與IV的表達量具有顯著性差異，P=〇.0318。
[0019] 1.5.2肥RC2P2的表達量與病人存活率之間的關系 用本發明所述方法在158例膠質瘤樣本中檢測肥RC2P2的表達量，對肥RC2P2高表達和 低表達與病人生存率之間的關系進行分析(結果如圖3所示）。實驗結果表明，肥RC2P2的表 達量與病人生存率成正相關。
[0020] 沈卵ENCE LISTING <110〉天津醫科大學總醫院 <120〉定量檢測膠質瘤中肥RC2P2表達量的方法 <130〉 1 <160〉 1 <170〉 Patentin version 3.5 <210〉 1 <211〉 17 <212〉DM <213〉 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum <220〉 <221〉肥RC2P2上游引物 <222〉 （1)..(17) <400〉 1 ggcagcacct cctacag 17 <130〉 2 <160〉 1 <170〉 Patentin version 3.5 <210〉 1 <211〉 20 <212〉DM <213〉 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum <220〉 <221〉肥RC2P2下游引物 <222> (1)..(20) <400〉 1 cctttcagtt tgggcttcag 20 <130〉 3 <160〉 1 <170〉 Patentin version 3.5 <210〉 1 <211〉 30 <212〉DM <213〉 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum <220〉 <221〉肥RC2P2 探針 <222〉 （1)..(30) <400〉 1 cgtcctctgt gtccgaatcc tcctctgctg 30 <130〉 4 <160〉 1 <170〉 Patentin version 3.5 <210〉 1 <211〉 6075 <212〉DM <213〉 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum <220〉 <221〉肥 RC2P2 基因 <222〉 (1)..(6075) <400〉 1 tc邑邑ccc邑cc cctc邑邑邑cc邑c邑曰邑曰邑邑c邑c c邑邑邑曰tc邑c邑邑邑c邑cc邑邑ct邑曰邑cc曰邑egg 60
【主權項】
1. 一種用于定量檢測膠質瘤中HERC2P2表達量的探針和引物，其特征在于:上游引物的 核酸序列如Seq ID N0.1所示;下游引物的核酸序列如Seq ID勵.2所示汀&9111&11探針核酸 序列如Seq ID NO.3所示。2. -種應用權利要求1所述的探針和引物定量檢測膠質瘤中HERC2P2表達量的方法，其 特征在于:包括以下步驟： a. 檢測樣本RNA的提取； b. 將步驟a中獲得RNA逆轉錄為cDNA; c. 以步驟b中獲得的cDNA為模板，應用權利要求1所述的引物和探針，進行熒光定量 PCR，測定樣本中HERC2P2表達量。3. 根據權利要求2所述的定量檢測膠質瘤中HERC2P2表達量的方法，其特征在于:所述 步驟a中提取樣本RNA的步驟為:取小塊樣本，加入Tr i zo 1溶液并研磨;按照體積比為Trizol 溶液:三氯甲烷=5:1的比例加入三氯甲烷，2-8°C，12000-13000rpm離心12-18 min;取上層 水相加入等體積的異丙醇，2-8°C，12000-13000rpm離心10min;棄上清，先后用與Trizol溶 液等體積的75%乙醇和無水乙醇洗滌沉淀，干燥，用ddH 20溶解沉淀。4. 根據權利要求2所述的定量檢測膠質瘤中HERC2P2表達量的方法，其特征在于:所述 步驟b中RNA逆轉錄為cDNA的步驟為：取步驟a中獲得的RNA模板lug;01igo dT lul;H20 10ul，60-70°C保溫5min，冰上冷卻;再向上述混合液中加入5 X反應緩沖液4ul ;RNA酶抑 制劑 lul;dNTP 2ul;逆轉錄酶 lul，40-42°C保溫lh，70°C保溫5-15 min。5. 根據權利要求2所述的定量檢測膠質瘤中HERC2P2表達量的方法，其特征在于:所述 步驟c中熒光定量PCR的擴增體系為：稀釋后的步驟b中獲得的cDNA模板2ul;上游引物 lul;下游引物 lul;Taqman探針 lul;Taqman mix 10ul;H2〇 5ul。6. 根據權利要求2所述的定量檢測膠質瘤中HERC2P2表達量的方法，其特征在于:所述 步驟c中熒光定量PCR的擴增程序為:95°C 10min;95°C 20s;58°C lmin;40個循環。
【專利摘要】本發明公開了一種定量檢測膠質瘤中HERC2P2表達量的方法，包括以下步驟：a.檢測樣本RNA的提取；b.將步驟a中獲得RNA逆轉錄為cDNA；c．以步驟b中獲得的cDNA為模板，應用上、下游引物和探針，進行熒光定量PCR，測定樣本中HERC2P2表達量。所述上游引物的核酸序列如Seq？ID？NO.1所示；下游引物的核酸序列如？Seq？ID？NO.2所示；Taqman探針核酸序列如Seq？ID？NO.3所示。本發明有效的填補定量檢測HERC2P2表達量方法領域的空白，能夠快速、精確、有效的檢測膠質瘤中HERC2P2表達量，對臨床膠質瘤病人級別和生存期預測具有指導意義。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開號】CN105671162
【申請號】CN201610119988
【發明人】康春生, 王琦雪, 韓磊, 周俊虎
【申請人】天津醫科大學總醫院
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2016年3月3日