一種延胡索快速鑒別方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及中藥質量檢測的技術領域，特別是涉及一種延胡索快速鑒別方法。
【背景技術】
[0002] 延胡索為罌粟科紫堇屬植物延胡索（Corydalis yanhusuo W.T.Wang)的干燥塊 莖，為著名的"浙八味"之一，具有活血，行氣，止痛的功效。由于臨床用量不斷增加，國內外 市場需求量持續加大，導致偽劣混雜，不法商人以次充好，以假冒真。
[0003] 延胡索偽品來源多為其同屬植物，成分有相似，其中全葉延胡索為最常見的代替 品和原材料市場上的混淆品。僅僅靠傳統的形態分析已不能進行品種的科學鑒定和種源的 遺傳分析，并且檢驗時間長，檢驗成本較高，沒有一種可靠有效快速方法可將延胡索與其他 偽品區分開來。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供延胡索快速鑒別方法，該方法利用特征引物通過PCR技術 對延胡索進行快速鑒別，解決制藥過程中延胡索藥材快速質量控制的問題。
[0005] 本發明具體的技術方案如下：
[0006] -種延胡索快速鑒別方法，包括如下步驟:延胡索快速鑒別方法，其特征在于，通 過針對延胡索的一對特征引物的聚合酶鏈式反應，對延胡索進行快速鑒別，該方法包括以 下步驟和條件：
[0007] (1)將各批供試藥材，經95 %乙醇擦拭表面，晾干，用液氮冷凍研磨成粉末，取研碎 后的粉末60mg，用DNeasy Plant Mini Kit DNA提取試劑盒提取試劑盒提取總DNA，備用；
[0008] (2)取特征引物卩2 5'-(^6丁66〇0^01^61'1'1'-3'，？4 5'-6八6111^0：0^1^0：1'0^(：-3'加無菌水稀釋成ΙΟμ mol/μL，備用；
[0009] (3)PCR擴增:50μ1體系中含有濃度為ΙΟμL?οΙ的Ρ2、Ρ4上下游引物各lyL，模版DNA2y L，Prime STAR HS(Premix)聚合酶預混體系25yL，剩余體積用無菌蒸餾水補足； [0010]?〇?反應程序為：94°(：預變性21^11 ;94°(：變性1〇8,68°(：退火58,72°(：延伸3〇8,30個 循環;72°C延伸5min;獲得擴增產物；
[0011] (4)取步驟(3)擴增產物5yL，與6XLoading buffer l.OyL混勻后點于1.5%瓊脂 糖凝膠上，用1 X TAE電泳緩沖液在110V電壓恒壓電泳20min;
[0012] 取出凝膠，置于紫外燈下觀察，并用CAMAG成像系統拍照并保存；
[0013] (5)步驟(4)所得照片中顯示，正品延胡索在200~300bp之間有一條清晰條帶，其 他偽品在該位置均無條帶，陰性無干擾；
[0014] (6)對步驟(1)~(5)進行耐用性考察:分別考察DNA聚合酶、PCR儀對該延胡索快速 鑒別方法的影響，分別更換DNA聚合酶為Taq聚合酶，更換PCR儀為熒光定量PCR儀。
[0015] 本發明具有如下優點及用途，本發明延胡索快速鑒別方法能夠簡單、準確、直接地 鑒別延胡索，只需微量的用量即可檢測，并具有靈敏度高，穩定性好，特異性強的特點，用于 制藥過程中延胡索藥材快速質量控制。
[0016] 下面結合附圖與【具體實施方式】，對本發明進一步詳細說明。
【附圖說明】
[0017] 圖1，23批延胡索藥材及15批偽品凝膠電泳圖1;
[0018] 圖2,23批延胡索藥材及15批偽品凝膠電泳圖2;
[0019] 圖3,23批延胡索藥材及15批偽品凝膠電泳圖3;
[0020] 圖4,實施例2的凝膠電泳圖；
[0021] 圖5、圖6,特征引物在序列中的位置。
【具體實施方式】
[0022] 實施例，參見圖1~圖3，本實施例提供延胡索快速鑒別方法，通過針對延胡索的一 對特征引物P2、P4的聚合酶鏈式反應，對延胡索進行快速鑒別；
[0023] 延胡索快速鑒別方法包括以下步驟和條件：
[0024] (1)將各批供試藥材，經95 %乙醇擦拭表面，晾干，用液氮冷凍研磨成粉末，取研碎 后的粉末60mg，用DNeasy Plant Mini Kit DNA提取試劑盒提取試劑盒提取總DNA，備用;本 實施例共提供的供試藥材見表1的樣品名稱及來源；
[0025] (2)取特征引物卩2 5，-(^6丁66〇0^01^61'1'1'-3，，？4 5，-6八6111^0：0^1^0：1'0^(：-3'加無菌水稀釋成ΙΟμ mol/μL，備用；
[0026] (3)PCR擴增:50μ1體系中含有濃度為ΙΟμπιο 1的Ρ2、Ρ4上下游引物各lyL，模版DNA 2 yL，Prime STAR HS(Premix)聚合酶預混體系25yL，剩余體積用無菌蒸餾水補足；
[0027] ?〇?反應程序為：94°(：預變性21^11;94°(：變性108,68°(：退火58,72°(：延伸308,30個 循環;72°C延伸5min;
[0028] (4)取擴增產物5yL，與6XLoading buffer l.OyL混勻后點于1.5%瓊脂糖凝膠 上，用1 X TAE電泳緩沖液在110V電壓恒壓電泳20min;
[0029] 取出凝膠，至于紫外燈下觀察，并用CAMAG成像系統拍照保存；
[0030] (5)步驟(4)所得照片中顯示，正品延胡索在200~300bp之間有一條清晰條帶，其 他偽品在該位置均無條帶；
[0031]
[0032]
[0033] 表1樣品名稱來源
[0034]圖1中，Mark為lOOObp分子標記，編號1~39為延胡索各批樣品及偽品，空白為空白 對照；
[0035] 本實施例中，選用ABI Veriti梯度PCR儀，電子分析天平（METTLER-T0LED0 XS205DU)，熒光定量PCR儀(美國BI0-RAD)，水平電泳槽(美國BIO-RAD)，CAMAG成像系統(瑞 士）。
[0036] 選用DNeasy Plant Mini Kit DNA提取試劑盒（QIAGEN，批號：151028778)，Prime STAR HS(Premix)聚合酶預混合體系（TaKaRa公司，批號：A3601A)、Premix Taq聚合酶預混 合體系（TaKaRa公司，批號：A8801A)，瓊脂糖凝膠（Biowest，批號：111860)，50XTAE (GENVIEW科技有限公司，批號：5610010120)，PCR 引物(P2 5 ' -CTGTGGCCCTCCGGGTTT-3 '，P4 5 '-GAGTCGCCCCCATCCCTCTAC-3 '）（寶生物工程有限公司）。
[0037] 本實施例提供的延胡索快速鑒別方法還包括以下步驟：
[0038] (6)對步驟（1)~（5)進行耐用性考察，分別考察DNA聚合酶、PCR儀對該方法的影 響，分別更換DNA聚合酶為Taq聚合酶，更換PCR儀為熒光定量PCR儀。
[0039] 見圖2及圖3,圖2中，Mark為lOOObp分子標記，1~39延胡索各批樣品及偽品，空白 為空白對照，聚合酶更換為Taq聚合酶；圖3中，Mark為lOOObp分子標記，1~39延胡索各批樣 品及偽品，空白為空白對照，PCR儀使用熒光定量PCR儀。
[0040] 結果表明，該方法對PCR聚合酶、不同型號PCR儀適應性良好，均能有效區分正偽 品，可以作為延胡索PCR快速鑒別方法。
[0041]實施例2,本實施例為對實施例1的方法進行再驗證，收集除上述樣品外的其他樣 品，包括其他偽品（姜黃），延胡索炮制品。按照實施例1的方法進行試驗及耐用性考察，結果 見圖4,圖4中Mark為lOOObp分子標記，1為延胡索飲片樣品，2為姜黃飲片樣品，3為延胡索飲 片放置3年樣品，4~7為醋制延胡索樣品。放置3年的陳舊樣品延胡索飲片中DNA有所降解， 產生的條帶也較為模糊，其他樣品實驗結果與實施例1相符合。結果表明該發明方法適用于 大部分的延胡索鑒別。
[0042] 上述實施例中，涉及引物為專門設計的特征引物?45'-6六61^1^0：0^1^0：1'0^(：-3'，？2 5'-〇^660〇^〇1^61'1'1'-3'（反轉序列5'-八八八〇〇1^^666〇^〇八6-3'），引物位置如圖 5、圖6所不，使用National Center for Biotechnology Information網站的Primer-BLAST 功能進行查找，未查找出對應的片段，說明該對引物擴增目標的唯一性。
[0043] 以上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并 不能因此而理解為對本發明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員 來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變動和改進，這些都屬于本發明的保 護范圍。因此，本發明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。
【主權項】
1. 一種延胡索快速鑒別方法，其特征在于，通過針對延胡索的一對特征引物的聚合酶 鏈式反應，對延胡索進行快速鑒別，該方法包括以下步驟和條件： (1) 將收集的各批供試藥材，經乙醇擦拭表面，晾干，用液氮冷凍研磨成粉末，取研碎后 的粉末60mg，用DNeasy Plant Mini Kit DNA提取試劑盒提取試劑盒提取總DNA，備用； (2) 取特征引物P2，P4加無菌水稀釋成ΙΟμπιο 1/yL，備用； (3) PCR擴增：50μ1體系中含有濃度為ΙΟμ mol的P2、P4上下游引物各lyL，模版DNA2yL， Prime STAR HS聚合酶預混體系25yL，剩余體積用無菌蒸餾水補足;通過PCR反應程序獲得 擴增產物； (4) 取步驟(3)擴增產物5yL，與6 X Loading buf f er 1. OyL混勻后點于1.5 %瓊脂糖凝 膠上，用1 X TAE電泳緩沖液在110V電壓恒壓電泳20min; 取出凝膠，置于紫外燈下觀察，并用CAMAG成像系統拍照并保存； (5) 步驟(4)所得照片中顯示，正品延胡索在200~300bp之間有一條清晰條帶，其他偽 品在該位置均無條帶，陰性無干擾。2. 根據權利要求1所述的延胡索快速鑒別方法，其特征在于，其還包括以下步驟： (6) 對步驟（1)~(5)進行耐用性考察:分別考察DNA聚合酶、PCR儀對該延胡索快速鑒別 方法的影響，分別更換DNA聚合酶為Taq聚合酶，更換PCR儀為熒光定量PCR儀。3. 根據權利要求1所述的延胡索快速鑒別方法，其特征在于，所述的特征引物P25'-CTGTGGCCCTCCGGGTTT-3 '， P2反轉序列5 '-AAACCCGGAGGGCCACAG-3 '， P45 '-GAGTCGCCCCCATCCCTCTAC-3 '。4. 根據權利要求1所述的延胡索快速鑒別方法，其特征在于，所述乙醇為95%乙醇。5. 根據權利要求1所述的延胡索快速鑒別方法，其特征在于，步驟(3)所述的PCR反應程 序為：94°C預變性2min;94°C變性10s，68°C退火5s，72°C延伸30s，并進行30個循環；72°C延 伸5min;獲得擴增產物。
【專利摘要】本發明公開了一種延胡索快速鑒別方法，通過針對延胡索的一對特征引物，對延胡索進行快速鑒別，該方法包括以下步驟和條件：(1)將收集的各批供試藥材取總DNA；(2)取特征引物P2，P4加無菌水稀釋；(3)通過PCR反應程序獲得擴增產物；(4)擴增產物與6×Loading？buffer混勻后點于瓊脂糖凝膠上，置于紫外燈下觀察，拍照并保存；(5)照片中顯示正品延胡索在200～300bp之間有一條清晰條帶，其他偽品在該位置均無條帶，陰性無干擾。本發明方法屬于快速測定方法，基于PCR技術鑒別延胡索，方法簡單、準確，靈敏度高，取樣量少、穩定性好、檢測速度快、特異性強，非常有利于在制藥過程中延胡索藥材快速質量控制中的應用。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105624305
【申請號】CN201610091330
【發明人】孫冬梅, 畢曉黎, 羅文匯, 胥愛麗, 陳昭, 陳偉韜, 李養學, 李素梅, 江潔怡, 許燦新
【申請人】廣東省第二中醫院（廣東省中醫藥工程技術研究院）
【公開日】2016年6月1日
【申請日】2016年2月18日