一種耐高濃度葡萄糖的β-葡萄糖苷酶高通量篩選方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于β-葡萄糖苷酶耐葡萄糖抑制篩選領域，涉及基于顯色化合物平板培養基篩選的耐葡萄糖抑制的高通量篩選方法。
【背景技術】
[0002]β-葡萄糖苷酶是纖維素糖化最關鍵的限速酶，廣泛用于可再生生物質資源的能源應用領域以及食品工業領域。
[0003]纖維素的降解主要涉及到三種纖維素酶，分別是纖維素外切酶、纖維素內切酶和葡萄糖苷酶，纖維素外切酶主要作用于微晶纖維素的還原端或非原端生成纖維二糖，而纖維素內切酶主要作用于不定形纖維素的內部產生纖維二糖和纖維寡糖，葡萄糖苷酶主要作用于纖維二糖和纖維寡糖生成葡萄糖。為了實現二代生物燃料的工業化生產，節約生產成本以及提高反應器容積效率是首要任務，因此，增加預處理纖維素濃度是一種很好的解決方案，在高濃度生物質降解過程中，葡萄糖苷酶會受到高濃度葡萄糖抑制而失去活性，造成大量纖維二糖積累，因為競爭性抑制和非競爭性抑制的影響，同時導致纖維素外切酶和纖維素內切酶活性的完全喪失，纖維素停止了酶解反應。很多研究團隊已采用定向進化技術改造葡萄糖苷酶，但是主要用于獲得高活性、高穩定性的葡萄糖苷酶的篩選，因此，為了解決葡萄糖苷酶受高濃度抑制的問題，采用定向進化技術是一種不錯的選擇，然而目前尚未發現類似報道，其中很可能最主要原因是沒有找到一個合適的高通量篩選方法。
【發明內容】
[0004]基于以上所存在的問題，本發明提供了一種基于平板篩選技術用于獲得耐高濃度葡萄糖的葡萄糖苷酶高通量篩選方法，對比其它篩選方法，本發明方法簡便實用，特別適用于真菌和細菌葡萄糖苷酶的高通量篩選領域。
[0005]本發明是這樣實現的，一種耐高濃度葡萄糖抑制的β_葡萄糖苷酶高通量篩選方法，其特征在于采用顯色化合物平板培養基進行高通量篩選，其主要步驟:
[0006]I)將β_葡萄糖苷酶于含有七葉苷和枸櫞酸鐵銨的平板培養基上進行分泌表達；
[0007]2)挑取陽性克隆子于普通平板培養基上生長；
[0008]3)再將3-10mL的七葉苷、枸櫞酸鐵銨和一定濃度葡萄糖的溶液加入到長有陽性克隆子的普通平板培養基上，于25_70°C下反應l_2h，獲得能產生黑色光圈的突變酶。
[0009]所述的“含有七葉苷和枸櫞酸鐵銨的平板培養基”，其特征在于七葉苷濃度為0.Ι-Ο.2 % 、 枸櫞酸鐵銨濃度為0.25-2 %。
[0010]所述的“七葉苷、枸櫞酸鐵銨和一定濃度葡萄糖的溶液”，其特征在于七葉苷濃度為0.1-0.2%、枸櫞酸鐵銨濃度為1-2%和葡萄糖濃度為0-50%。
[0011]本發明的技術效果是:本發明所述的耐高濃度葡萄糖抑制的β-葡萄糖苷酶高通量篩選方法，可應用于基于定向進化的耐高濃度葡萄糖抑制葡萄糖苷酶的高通量篩選，使耐高濃度葡萄糖的β-葡萄糖苷酶更適合于再生生物質纖維素糖化的能源和食品工業的風味增加等領域。
【具體實施方式】
[0012]通過以下具體實施例，對本發明作詳細說明，本發明的保護內容不局限于以下實施例。本領域技術人員能夠想到的變化和優點都被包括在本發明中，并且以所附的權利要求書為保護范圍。實施本發明的過程、條件、試劑、實驗方法等，除本領域的普遍知識和公知常識外，本發明沒有特別限制內容。1、將本實驗室所保存的草酸青霉16β_葡萄糖苷酶基因與PGAPZaA載體連接，以2000伏電壓電轉到畢赤酵母GS115中；
[0013]2、將上述重組菌畢赤酵母GS115涂布于含有0.1%七葉苷和0.25%枸櫞酸鐵銨的YPG(碳源僅有2%甘油)平板培養基中，于30°C培養3-7天，挑取菌落周圍有黑色光圈的陽性克隆子；
[0014]3、將陽性克隆子分別接種到4塊相同的YPG(碳源僅有2%甘油)平板培養基中，于30 °C分別培養2-5天；
[0015]4、將4mL的0.16 %七葉苷、1.2%枸櫞酸鐵銨和O %葡萄糖加入到I塊陽性克隆子平板上，將4mL的0.16 %七葉苷、1.2 %枸櫞酸鐵銨和0.5 %葡萄糖加入到第2塊陽性克隆子平板上，將4mL的0.16%七葉苷、1.2%枸櫞酸鐵銨和20%葡萄糖加入到第3塊陽性克隆子平板上，于40°C分別培養2-3h，第4塊陽性克隆子平板保存。
[0016]5、加了20%葡萄糖的第3塊平板完全受到抑制，陽性克隆子周圍沒有形成黑色光圈，而其它兩塊平板都有黑色光圈形成。
[0017]6、前期研究表明(論文已發表)，草酸青霉16β_葡萄糖苷酶在0-1%葡萄糖濃度下不會受到抑制，當在>5%葡萄糖時會受到抑制，我們實驗完全證實平板高通量篩選耐高濃度葡萄糖的可靠性和方便性。
【主權項】
1.一種耐高濃度葡萄糖的β-葡萄糖苷酶高通量篩選方法，其特征在于采用顯色化合物平板培養基進行高通量篩選耐糖β-葡萄糖苷酶，其特征是主要步驟: 1)將β-葡萄糖苷酶于含有七葉苷和枸櫞酸鐵銨的平板培養基上進行分泌表達； 2)挑取陽性克隆子于普通平板培養基上生長； 3)再將3-10mL的七葉苷、枸櫞酸鐵銨和一定濃度葡萄糖的溶液加入到長有陽性克隆子的普通平板培養基上，于25-70°C下反應l_2h，獲得能產生黑色光圈的突變酶。2.根據權利要求1所述的一種耐高濃度葡萄糖的β_葡萄糖苷酶高通量篩選方法，其特征在于，所述步驟I中的七葉苷濃度為0.1-0.2%、枸櫞酸鐵銨濃度為0.25-2%。3.根據權利要求1所述的一種耐高濃度葡萄糖的β_葡萄糖苷酶高通量篩選方法，其特征在于，所述步驟3的七葉苷濃度為0.1-0.2%、枸櫞酸鐵銨濃度為1-2%和葡萄糖濃度為0-50%。
【專利摘要】本發明涉及一種耐高濃度葡萄糖的β-葡萄糖苷酶高通量篩選方法，主要步驟：將β-葡萄糖苷酶于含有七葉苷和枸櫞酸鐵銨的平板培養基上進行分泌表達，挑取陽性克隆子于普通平板培養基上生長，再將一定體積的七葉苷、枸櫞酸鐵銨和一定濃度葡萄糖的溶液加入到普通平板培養基上，于一定溫度下反應1-2h，獲得能產生黑色光圈的突變酶。本發明所述的耐高濃度葡萄糖抑制的β-葡萄糖苷酶高通量篩選方法，可應用于基于定向進化的耐高濃度葡萄糖抑制β-葡萄糖苷酶的高通量篩選，使耐高濃度葡萄糖的β-葡萄糖苷酶更適合于再生生物質纖維素糖化的能源和食品工業的風味增加等領域。
【IPC分類】C12Q1/34, C12N9/42
【公開號】CN105624266
【申請號】CN201610095165
【發明人】趙喜華, 易拾, 涂宗財
【申請人】江西師范大學
【公開日】2016年6月1日
【申請日】2016年2月22日