一種激活Nrf2-ARE通路的雙髻鯊魚肉抗氧化肽的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種抗氧化活性肽，具體涉及一種激活Nrf2-ARE通路的雙髻鯊魚肉抗氧化肽。
【背景技術】
[0002]鯊魚全身是寶，有的種類肉質鮮美，是餐桌上常見的菜肴。魚皮具有良好的韌性，是皮革加工業的原料。現代醫學證明鯊魚軟骨也具有很大的藥用價值，1992年美國首先將鯊魚軟骨粉直接用于臨床治療腫瘤。
[0003]雙髻藍(Sphyrna Iewini)為軟骨魚綱，真藍目，雙髻藍科，在我國主要分布于黃海、東海和南海。
【發明內容】
[0004]本發明所要解決的技術問題是提供一種具有激活Nrf2_ARE通路的雙髻鯊魚肉抗氧化肽。
[0005]本發明為解決上述技術問題所采取的技術方案為:一種具有激活Nrf2-ARE通路的雙髻鯊魚肉抗氧化肽，該抗氧化肽為六肽化合物，氨基酸序列為I Ie-1 Ie-Gly-Leu-Val-Pro(IIGLVP)，ES1-MS測定分子量為610.77 Da。
[0006]該雙髻鯊魚肉抗氧化肽的制備方法為:
1)雙髻鯊魚肉的預處理:取雙髻鯊魚肉用高速組織搗碎機處理成勻漿，加熱至90?95°C后保溫5?1min，然后按照料液比Ig: 2?4mL加入異丙醇，于25?30°C、功率450?500 W超聲提取2?3 h，然后于4°C、9000~10000 rpm離心10?15min除去異丙醇，收集脫脂雙髻鯊魚肉固形物；
2)脫脂雙髻鯊魚肉固形物的酶解:取脫脂雙髻鯊魚肉固形物，按固液比Ig:1OmL?15mL加入甘氨酸一氫氧化鈉緩沖液(0.05mol/L，pH 9.5)，用0.1 mol/L HCl或0.1 mol/LNaOH調節pH到9.0?10.0，得混合液;將混合物溫度調制55?65°C，按照脫脂雙髻鯊魚肉固形物質量的1.2 %?1.5 %加入堿性蛋白酶(酶活力2 1.95X 105 U/g)，酶解時間2 h?2.5h后，酶解液于90?95°C保溫10?15min，滅酶活;將酶解液溫度調至35?45°C，按照脫脂雙髻鯊魚肉固形物質量的1.0 %?1.2%加入胰蛋白酶(酶活力22.5\104 U/g)，酶解時間3 h?4 h，酶解液于90?95°C保溫10?15min后降至室溫，于10000?12000 rpm離心10?15 min，取上清液。
[0007])雙髻鯊魚肉抗氧化肽的分離制備:將上述上清液依次經超濾、大孔樹脂純化、凝膠柱層析和RP-HPLC純化，得雙髻鯊魚肉抗氧化肽。
[0008]作為優選，所述步驟3)的超濾、大孔樹脂純化、凝膠柱層析和RP-HPLC純化的具體過程為:
超濾:將上述酶解上清液采用I kDa超濾膜進行超濾處理，收集分子量小于I kDa部分，得超濾酶解液。
[0009]大孔樹脂精制:將超濾酶解液配成15?20mg/mL的溶液，緩慢加入到超濾酶解液與DlOl大孔樹脂比為1:10?15的玻璃柱中，用3?5倍柱體積的雙蒸水洗脫除去雜質，再用3?4倍柱體積的95%乙醇洗脫，收集95%乙醇洗脫物，噴霧干燥，即為大孔樹脂精制多肽。
[0010]凝膠柱層析:將上述大孔樹脂精制多肽溶于雙蒸水配成濃度為20?30mg/mL的溶液，經過葡聚糖凝膠Sephadex G-25柱層析分離，用雙蒸水進行洗脫，流速為0.8?1.2 mL/min，洗出溶液每3 min收集一管并于220 nm檢測，按峰合并試管內溶液，比較各峰的輕基自由基的清除活性，選擇活性最強組分凍干，即為凝膠層析酶解物；
RP-HPLC純化:將上述凝膠層析酶解物用雙蒸水配成90?100 yg/mL的溶液，利用RP-HPLC進行純化，根據對羥基自由基的清除活性得I個高抗氧化活性多肽Ile-1le-Gly-Leu-Val-Pro (IIGLVP)，ESI_MS測定分子量為610.77 Da。
[0011]再優選，所述RP-HPLC條件為:進樣量15?20 yL;色譜柱Zorbax SB- Cis(250 mmX4.6 mm,5 μπι)；流動相:水-乙腈梯度洗脫(O?45min乙腈濃度由O勻速升至45%);洗脫速度
0.8~1.0 mL/min;紫外檢測波長220 nm。
[0012]本發明所提供的一種激活Nrf2_ARE通路的雙髻鯊魚肉抗氧化肽，Ile-1le-Gly-Leu-Val-Pro (IIGLVPWfDPPHg由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除作用；同時I Ie-1Ie-Gly-Leu-Val-Pro (IIGLVP)還可促進Nrf 2蛋白質積累，激活Nrf 2-ARE通路，進而上調抗氧化酶和II相解毒酶清除有害物，保護機體免受毒物的損傷。因此，Ile-1Ie-Gly-Leu-Val-Pro (IIGLVP)可用作治療肝損傷、皮膚光老化、動脈硬化、中風、糖尿病和肥胖等與Nrf2-ARE通路密切相關疾病治療的藥物或功能產品。
【附圖說明】
[0013]圖1是本發明的葡聚糖凝膠SephadexG_25層析圖。
[0014]圖2葡聚糖凝膠Sephadex G-25制備酶解物的RP-HPLC色譜圖。
[0015]圖3IIe-1Ie-Gly-Leu-Val-Pro (IIGLVP)對Nrf2 蛋白質水平的影響。
【具體實施方式】
[0016]以下結合附圖實施例對本發明作進一步詳細描述。
[0017]實施例:
雙髻鯊魚肉抗氧化肽的制備方法，制備工藝流程如下:雙髻鯊魚肉〃雙酶酶解〃酶解物"超濾〃大孔樹脂純化〃凝膠過濾層析〃高效液相色譜制備〃抗氧化肽。
[0018])雙髻鯊魚肉的預處理:取雙髻鯊魚肉用高速組織搗碎機處理成勻漿，加熱至95°(:后保溫811^11，然后按照料液比18:3 mL加入異丙醇，于25°C、功率500 W超聲提取3 h，然后于4°C、10000 rpm離心10 min除去異丙醇，收集脫脂雙髻鯊魚肉固形物；
2)脫脂雙髻鯊魚肉固形物的酶解:取脫脂雙髻鯊魚肉固形物，按固液比I g:12 mL加入甘氨酸一氫氧化鈉緩沖液(0.05mol/L，pH 9.5)，用0.1 mol/L HCl或0.1 mol/L NaOH調節pH到9.5，得混合液;將混合物溫度調制60 0C，按照脫脂雙髻鯊魚肉固形物質量的1.2%加入堿性蛋白酶(酶活力2 1.95 X 105 1]/^)，酶解時間2.5 h后，酶解液于95°C保溫15min，滅酶活;將酶解液溫度調至40 V，按照脫脂雙髻鯊魚肉固形物質量的1.0%加入胰蛋白酶(酶活力> 2.5 X 14 U/g)，酶解時間34 h，酶解液于95°C保溫15min后降至室溫，于12000 rpm離心10 min，取上清液。
[0019])雙髻鯊魚肉抗氧化肽的分離制備:將上述上清液依次經超濾、大孔樹脂純化、凝膠柱層析和RP-HPLC純化，得雙髻鯊魚肉抗氧化肽。
[0020]①超濾:將上述酶解上清液采用采用IkDa超濾膜進行超濾處理，收集分子量小于
IkDa部分，得超濾酶解液。
[0021]②大孔樹脂精制:將超濾酶解液配成20mg/mL的溶液，緩慢加入到濾酶解液與D1I大孔樹脂重量體積比(mg/mL )為1: 15的玻璃柱中，用3倍柱體積的雙蒸水洗脫除去雜質，再用4倍柱體積的95%乙醇洗脫，收集95%乙醇洗脫物，噴霧干燥，即為大孔樹脂精制多肽。
[0022]③凝膠柱層析:將上述大孔樹脂精制多肽溶于雙蒸水配成濃度為25mg/mL的溶液，經過葡聚糖凝膠Sephadex G-25柱層析分離，用雙蒸水進行洗脫，流速為1.0 mL/min，洗出溶液每3 min收集一管并于220 nm檢測，按峰合并試管內溶液，比較各峰的羥基自由基的清除活性，選擇活性最強組分凍干，即為凝膠層析酶解物Fr.3(圖1);
④RP-HPLC純化:將上述凝膠層析酶解物用雙蒸水配成95 yg/mL的溶液，利用RP-HPLC進行純化(再優選，所述RP-HPLC條件為:進樣量20 yL;色譜柱Zorbax SB- Cis(250 mmX4.6mm, 5 μπι);流動相:水-乙腈梯度洗脫(O?45min乙腈濃度由O勻速升至45%);洗脫速度0.8mL/min;紫外檢測波長220 nm)，根據對羥基自由基的清除活性得I個高抗氧化活性多肽(圖
2)0
[0023]⑤結構檢測:收集羥自由基清除活性最高的多肽DCPE-B，經RP-HPLC檢測為單一峰，利用蛋白/多肽序列分析儀測定氨基酸序列為Ile-1le-Gly-Leu-Val-Pro (IIGLVP)，ES1-MS測定分子量為610.77 Da。
[0024]自由基清除實驗:將制得的雙髻鯊魚肉抗氧化肽Ile-1le-Gly-Leu-Val-Pro(IIGLVP)進行自由基清除實驗。實驗結果表明= Ile-1le-Gly-Leu-Val-Pro (IIGLVP)對DPPH自由基(EC50 1.89 mg/mL)、輕基自由基(ECso 0.28 mg/mL)和超氧陰離子自由基(ECso
0.13 mg/mL)具有良好的清除作用。
[0025]抗氧化肽對激活Nrf2/ARE通路的作用:取對數生長期的人胚腎細胞株HEK293細胞接種于60mm皿24小時后，分別加入ΙΟμΜ的酶解液和11 e_I Ie-Gly-Leu-Val-Pro(IIGLVP)，繼續培養4小時。棄去上清，細胞用RIPA緩沖液(上海碧云天生物技術有限公司)裂解，BCA法測定蛋白濃度。每個樣品取20yg蛋白經SDS-PAGE分離，然后按常規免疫印跡方法檢測Nrf2的蛋白水平。結果表明Ile-1le-Gly-Leu-Val-Pro (IIGLVP)可促進Nrf2蛋白質積累(圖3)，激活Nrf2-ARE通路，進而上調抗氧化酶和II相解毒酶清除有害物，保護機體免受毒物的損傷。因此，Ile-1le-Gly-Leu-Val-Pro (IIGLVP)可用作治療肝損傷、皮膚光老化、動脈硬化、中風、糖尿病和肥胖等與Nrf2-ARE通路密切相關疾病治療的藥物或功能
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[0026]最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的一個具體實施例。顯然，本發明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。
【主權項】
1.一種激活Nrf 2-ARE通路的雙髻鯊魚肉抗氧化肽，其特征在于該抗氧化肽為四肽化合物，氨基酸序列為Ile-1le-Gly-Leu-Val-Pro，ESI_MS測定分子量為610.77 Da。
【專利摘要】本發明公開了一種激活Nrf2-ARE通路的雙髻鯊魚肉抗氧化肽。本發明以雙髻鯊魚肉為原料，通過雙酶酶解得酶解液，酶解液采用超濾、大孔樹脂純化、凝膠柱層析和反相高效液相色譜分離純化得到抗氧化肽Ile-Ile-Gly-Leu-Val-Pro？(IIGLVP)，ESI-MS測定分子量為610.77？Da；制備的高活性抗氧化肽對DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除作用；同時亦可促進Nrf2蛋白質積累，激活Nrf2-ARE通路，可用作治療肝損傷、皮膚光老化、動脈硬化、中風、糖尿病和肥胖等與Nrf2-ARE通路密切相關疾病治療的藥物和功能產品。
【IPC分類】A61P3/04, A61P39/06, A61P3/10, A61P1/16, A23L33/18, A61P9/10, C07K7/06, A61P17/00, A61K38/08
【公開號】CN105622720
【申請號】CN201610098099
【發明人】王斌, 趙玉勤, 孫坤來
【申請人】浙江海洋學院
【公開日】2016年6月1日
【申請日】2016年2月23日