一種來源于馬克斯克魯維酵母的烷基過氧化物還原酶和硫氧還蛋白還原酶及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物基因工程應用領域，具體涉及包含提供來源于馬克斯克魯維酵 母的烷基過氧化物還原酶KmTPXl的基因和氨基酸序列，以及硫氧還蛋白還原酶KmTrxR的基 因和氨基酸序列。同時本發明也涉及了上述兩種酶在提高釀酒酵母脅迫耐受性方面的應 用。
【背景技術】
[0002] 酵母長期以來一直就是被人們廣泛關注的微生物，它可以廣泛應用與食品、醫藥、 釀酒等多種工業領域。特別是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，因其在最初在釀酒 工業的重要應用，一直以來都是研究最為廣泛的酵母之一，無論是傳統的釀酒工業，還是新 興的生物乙醇，甚至是基因工程領域，釀酒酵母的應用研究都取得了 了巨大的進展。近年 來，一種非傳統酵母，馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)越來越受到人們的關 注，因為它具有耐高溫條件、生長速率較快、利用底物種類廣泛等諸多優勢有望廣泛應用于 工業生物技術領域。盡管K.marxianus研究的較晚，而且許多問題仍待于進一步的理論研究 來解決，但是隨著基因組學和轉錄組學技術的不斷完善，越來越多來源于馬克斯克魯維酵 母的新基因或者新酶被報道（Lertwattanasakul et al.Biotechnol Biofuels.2015,8:l_ 14.)，為其進一步的研究與利用奠定了基礎。
[0003] 生物乙醇是目前為止研究最早、技術最為成熟的生物質能源產品，被公認為最有 可能替代化石能源的生物質能源之一。而纖維素乙醇以其廣泛的原料來源是國內外燃料乙 醇研發的重點。但是，纖維素結構復雜，需要對纖維素原料進行預處理和水解將其轉化成酵 母可直接利用的單糖。然而，當前高效的纖維素預處理方法(如蒸汽爆破法，酸法，堿法等） 在處理過程中都會產生多種抑制物，影響酵母菌的后續發酵過程，成為纖維素質能源工業 化生產的重要挑戰（Palmqvis et al.Bioresource Technol.2000,74,25-33.)〇
[0004] 纖維素水解液中的抑制物主要包括三類:弱酸(如甲酸、乙酸等），呋喃醛類(如糠 醛，5-輕甲基糠醛等），酸類化合物（如4-水楊酸，苯酸等）（Palmqvis et al .Bioresource Technol.2000,74,25-33.)。纖維素水解液中的多種抑制物對細胞的毒害作用機理是非常 復雜的，盡管可以通過一些技術對纖維素水解液進行脫毒反應（Lee et al.J Ind Eng Chem. 2013,19,2010-2015.)，但隨之導致的糖損失和成本增加使得脫毒并不是一種理想之 選。因此，探索不同的抑制物脅迫因子對細胞產生毒害的機理，從而獲得一些耐受性提高的 發酵菌株將是解決纖維素乙醇瓶頸問題的關鍵。
[0005] 酵母細胞生長需要氧，但是過量的通氣會產生對細胞有害的物質，被稱為活性氧 (R0S)，包括超氧化物、過氧化物以及氫氧自由基等（Arellan〇-Plaza，et al.World J Microbiol Biotechnol .2013，29:1279-1287.)。因此，為了防御活性氧的傷害，細胞具有一 套完善的防御機制，其中主要涉及一些氧化還原的酶類。之前的一些報道表明，細胞內活性 氧的水平或者一些氧化還原酶的表達與細胞對纖維素水解液中抑制物的耐受能力有關 (Kumar，et al.PloS 〇1^，2015，10(10):60139129.)。但是，目前關于馬克斯克魯維酵母來 源的氧化還原酶的報道十分有限，關于其功能的研究更少。本發明提供了兩種馬克斯克魯 維酵母來源的氧化還原酶，烷基過氧化物還原酶KmTPXl和硫氧還蛋白還原酶KmTrxR。
[0006] KmTPXl屬于過氧化物還原酶(Peroxiredoxins，Prx)家族，根據序列比對發現這種 酶與釀酒酵母中的硫醇特異的抗氧化蛋白（Tsai)同源性達到90% (Wong et al.J Biol Chem.2004,279:23207-23213·)，在細胞內的含量是最大的（Tachibana et al.J Biol Chem. 2009; 284:4464-72.); KmTrxR與硫氧還蛋白KmTrx在細胞內成對出現，Trx-TrxR系統 廣泛存在于酵母細胞的線粒體中，能夠保護細胞免受R0S的損傷。本發明提供的這兩種酶是 馬克斯克魯維酵母細胞內防御R0S的關鍵酶，同時也能夠有效地提高對多種抑制物或脅迫 因子的耐受能力。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的之一是提供一種來源于馬克斯克魯維酵母的烷基過氧化物還原酶 KmTPXl的基因和氨基酸序列。
[0008] 本發明的目的之二是提供一種來源于馬克斯克魯維酵母的硫氧還蛋白還原酶 KmTrxR的基因和氨基酸序列。
[0009] 本發明的目的之三是提供一株過表達KmTpXl基因的釀酒酵母。
[0010]本發明的目的之四是提供一株過表達KmTrxR基因的釀酒酵母。
[0011]本發明的目的之五是證明烷基過氧化物還原酶KmTPXl和硫氧還蛋白還原酶 KmTrxR能夠提高釀酒酵母細胞對一種或多種抑制物或脅迫因子的耐受性，包括過氧化氫、 甲酸、乙酸、糠醛、乙醇、苯酚、愈創木酚、氯化鈉等。
[0012] 本發明的技術方案：
[0013] 一種來源于馬克斯克魯維酵母的烷基過氧化物還原酶KmTPXl，該烷基過氧化物還 原酶KmTPXl的核苷酸序列為：
[0014] 1 ATGGTTGCCC AAGTCCAAAA GCCAGCCCCA GAGTTCAAGA AGACCGCTGT
[0015] 51 CATTGACGGT GTTTTCGACG AAGTTTCCCT AGAAAAATAC AAGGGTAAGT
[0016] 101 ACGTTGTCTT GGCCTTCATT CCATTGGCCT TCACCTTCGT GTGCCCAACT
[0017] 151 GAAATCATTG CCTTCTCTGA AGCTGCCAAG AAGTTCGAAG AAATTGGTGC
[0018] 201 TCAAGTTTTG TTCGCTTCCA CTGACTCCGA ATACTCCTTG TTGGCATGGA
[0019] 251 CCAACGTTGC TAGAAAGGAC GGTGGTCTAG GTCCAGTCAA CATTCCATTG
[0020] 301 ATTGCTGACA CCAACCACTC CTTGTCCAGA GACTACGGTG TCTTGATCGA
[0021] 351 AGAAGAAGGT ATTGCCTTGA GAGGTTTGTT CTTGATCGAT CCAAAGGGTA
[0022] 401 TTGTGAGACA CATCACCATC AACGACTTGC CAGTCGGTAG AAACGTTGAA
[0023] 451 GAAGCTTTGA GATTGGTCGA AGGTTTCCAA TGGACCGACA AGAACGGTAC
[0024] 501 CGTCTTGCCA TGTAACTGGA CTCCAGGTTC CGCTACCATC AAGCCAGACG
[0025] 551 TCGAAGCTTC TAAGGAATAC TTCGCTGCCG CTAACAAGGA ATAA
[0026]該核苷酸序列中含有594個核苷酸，編碼197個氨基酸。
[0027] -種來源于馬克斯克魯維酵母的硫氧還蛋白還原酶KmTrxR，該硫氧還蛋白還原酶 KmTrxR的核苷酸序列為：
[0028] 1 ATGGTTCATC ACAAGGTAAC AATTATTGGT TCCGGCCCAG CAGCCCACAC
[0029] 51 CGCCGCCATT TACTTGGCTA GAGCAGAAAT CAAGCCTACC CTATACGAAG
[0030] 101 GTTTCATGGC TAATGGTATC GCCGCCGGTG GTCAACTAAC AACCACCACT
[0031] 151 GAAATCGAAA ACTTCCCAGG TTTCCCAGAA GGTTTGACCG GTAGTGAATT
[0032] 201 GATGGATAAG ATGAAGGCTC AATCTGTCAA GTTTGGTACC GAGGTGATTA
[0033] 251 CCGAAACCGT TGCAAAGGTG GACTTGTCTA GCAAGCCATT CAAGTTCTGG
[0034] 301 ACCGAATTCA ACGAGGACCA AGAACCAGAA ACTACCGATG CCATTATCTT
[0035] 351 GGCTACCGGT GCCTCCGCTA AGCGTCTACA CTTGCCAGGT GAAGAGAAGT
[0036] 401 ACTGGCAACA GGGTATCTCC GCCTGTGCCG TTTGTGACGG TGCAGTGCCA
[0037] 451 ATCTTCAGAA ACAAGCCATT GGCTGTCATC GGTGGTGGTG ACTCTGCCTG
[0038] 501 TGAAGAAGCA CAATTTTTGA CCAAGTACGG TTCCAAGGTG TACATGCTTG
[0039] 551 TCAGAAAGGA CCACTTGCGT GCCTCTCAAA TCATGCAAAG ACGTGCTGAA
[0040] 601 CAAAACGAAA AGATCGAAAT CTTGTACAAC CACGTCACCT TGGAAGCCAA
[0041 ] 651 GGGTGACGAC AAGTACTTGA ATGCATTGAA GGTCAAGAAC GTAAAGACCA
[0042] 701 ATGAAGAATA CGACTTGCCA GTTAACGGAT TATTCTACGC CATTGGTCAC