一種分離純化植物絨氈層組織的方法
【技術領域】
[0001]本發明是一種從植物花藥分離絨氈層組織的方法，涉及絨氈層組織分離和獲取，屬于發育生物學及細胞生物學領域。
【背景技術】
[0002]絨氈層細胞存在于植物花藥內側，為小孢子發育提供必要的營養物質，在小孢子發育成熟后降解。絨氈層參與了小孢子發育、花粉與柱頭識別等眾多生理過程，是發育生物學等相關研究領域研究重點。
[0003]目前，研究相關基因在組織中的特異表達是國際研究趨勢。但是絨氈層存在于花藥內部，要開展相關研究首先需要分離絨氈層組織，而目前未見相關技術。為了解決上述問題，我們發明了一種快速酶解技術，并運用該技術成功分離出花藥絨氈層組織。在這一技術中，我們利用白菜20個花蕾獲得的花藥，經過酶解、過濾后，獲得足量絨氈層組織，并利用該組織進一步提取該組織DNA和RNA。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供簡便、快速分離花藥絨氈層方法，為進一步研究相關基因在絨氈層組織中表達調控奠定基礎。
[0005]本發明一種從植物花藥分離絨氈層組織的方法，包括花藥處理、酶解、分離、收集等步驟，最后得較少雜質的絨氈層組織。
[0006]具體包括下列步驟(圖1):
[0007]I)花藥的采集:采集花前三天的花蕾20個，收集化藥;本步驟確定了分離花藥所需最少花蕾數。
[0008]2)清洗液的制備:含有50mM Hepes,0.5M蔗糖，并用KOH調節pH值至7.5;本步驟確定絨氈層分離合適的緩沖液濃度及糖濃度，保證分離過程中組織細胞不會受到傷害；
[0009]3)酶解液的制備:向清洗液中加入最終濃度為5%纖維素酶RS和0.1 %果膠酶Y23;本步驟確定了絨氈層分離合適酶種類和濃度；
[0010]4)花藥前處理:用解剖刀去除花藥兩端，并在剩余部位中間切開以便絨氈層細胞的提取;本步驟解決花藥小孢子去除的問題，并保證酶解液與花藥組織充分接觸；
[0011]5)小孢子去除:將處理后的花藥放入1.5ml離心管中，加入清洗液lml，渦旋20min，過濾，包含小孢子溶液經過過濾后丟棄，花藥其他部位依然儲存于離心管中，重復上述清洗、分離步驟;花藥剩余部分等待進一步處理；
[0012]6)絨氈層細胞的分離:將600μ1酶解液加入到過濾后儲存剩余花藥部分的離心管，渦旋12min，通過過濾得到上清，絨氈層組織包含于上清液中；
[0013]7)絨氈層細胞的收集:將上清液在4°C、12000g條件下離心15min，沉淀即為絨氈層(圖 2)。
[0014]本發明的有益效果體現在:
[0015]I)首次從植物花藥中分離出絨氈層細胞，可以用于研究絨氈層組織特性；
[0016]2)應用本發明的方法分離絨氈層細胞，可進一步用于絨氈層細胞DNA、RNA提取，研究與花粉發育、識別相關基因在絨氈層中的表達與調控；
[0017]3)本發明操作簡單，耗時短，分離絨氈層組織雜質少，純度高，可以廣泛用于不同植物絨氈層組織分離、純化。
【附圖說明】
[0018]圖1花藥絨氈層分離純化流程圖。
[0019]圖2分離得到的絨氈層組織。T:絨氈層;M:小孢子。標尺=500μπι。從圖中可以看出，分離的絨氈層純度較高。
[0020]圖3SPll在不同組織表達分析。SPll基因在白菜花藥中特異表達。G:基因組DNA;T:絨氈層RNA反轉錄得到cDNA ； D:分離過程中其他花藥組織RNA反轉錄得到cDNA。
[0021]圖4SPll啟動子區域在S基因型為S8S44白菜中DNA甲基化率分析。
【具體實施方式】
[0022]分離植物絨氈層組織，是研究小孢子發育、花粉與柱頭識別相關基因在絨氈層中特異表達、調控的必要前提之一。我們應用本發明的方法，獲取了足量、少雜質的植物絨氈層組織，為開展相關研究奠定基礎。我們相關方法的建立，也填補相關空白。
[0023]本實例用20個白菜花前3天的花蕾分離出絨氈層細胞，實驗過程如下(圖1):
[0024]1.收集花前三天白菜花蕾20個，取出花藥；
[0025]2.切除花藥兩端，并將剩余部分從中間切開，便于去除小孢子；
[0026]3.將處理后的花藥放入1.5ml離心管中，加入清洗液lml，渦旋20min，過濾，包含小孢子溶液經過過濾后丟棄，花藥其他部位依然儲存于離心管中，重復上述清洗、分離步驟；花藥剩余部分等待進一步處理；
[0027]4.將600μ1酶解液加入到過濾后儲存剩余花藥部分的離心管，渦旋12min，通過過濾得到上清，絨氈層組織包含于上清液中；
[0028]5.將上清液在4°C、12000g條件下離心15min，沉淀即為絨氈層(圖2);
[0029]利用獲得絨氈層進一步提取RNA和DNA，RNA反轉錄后用于檢測BrSPll表達(圖3);DNA用于檢測BrSPll-S44啟動子區域甲基化情況檢測(圖4)。
【主權項】
1.一種分離純化植物絨氈層組織的方法，其特征在于包括下列步驟: 1)花藥的采集:采集花前三天的花蕾20個，收集化藥； 2)清洗液的制備:含有50mMHepes,0.5M蔗糖，并用KOH調節pH值至7.5; 3)酶解液的制備:向清洗液中加入最終濃度為5%纖維素酶RS和0.1%果膠酶Y23; 4)花藥前處理:用解剖刀去除花藥兩端，并在剩余部位中間切開以便絨氈層細胞的提取； 5)小孢子去除:將處理后的花藥放入1.5ml離心管中，加入清洗液lml，渦旋20min，過濾，包含小孢子溶液經過過濾后丟棄，花藥其他部位依然儲存于離心管中，重復上述清洗、分離步驟;花藥剩余部分等待進一步處理； 6)絨氈層細胞的分離:將600μ1酶解液加入到過濾后儲存剩余花藥部分的離心管，渦旋12min，通過過濾得到上清，絨氈層組織包含于上清液中； 7)絨氈層細胞的收集:將上清液在4°C、12000g條件下離心15min，沉淀即為絨氈層。
【專利摘要】本發明涉及一種分離純化植物絨氈層組織的方法，屬于發育生物學及細胞生物學領域。本發明通過對花藥的采集、清洗液的制備、酶解液的制備、花藥前處理、去除花藥小孢子、絨氈層細胞的分離和收集步驟。利用合適的酶種類及濃度酶解分離絨氈層組織，再通過過濾離心純化收集絨氈層。本方法具有步驟簡單、操作方便、耗時較短等優點，分離效率好，得到的絨氈層組織可用于后續實驗。
【IPC分類】C12N5/04
【公開號】CN105602885
【申請號】CN201510797285
【發明人】王春雷, 高季平, 葉蘊靈, 趙貝貝, 張盼盼
【申請人】揚州大學
【公開日】2016年5月25日
【申請日】2015年11月18日