一種產阿維菌素高產菌的高通量篩選方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物領域；更具體地，本發明涉及一種產阿維菌素高產菌的高通量 篩選方法。
【背景技術】
[0002] 阿維菌素（Avermectin，AVM)是由日本靜岡±壤放線菌--阿維鏈霉菌 (Str巧tomyces avermitilis)產生的一類十六元大環內醋類抗生素，具有廣泛的殺蟲和抗 寄生蟲等生物活性，主要用于農業害蟲和禽畜寄生蟲的防治，在我國農業上具有重要的應 用價值和意義。美國默克公司又通過對阿維菌素結構的改造，得到兩個新品種的農藥一 伊維菌素和埃瑪菌素。2011年，阿維菌素全球銷售額達到3. 35億美元，我國市場年產量為 3500噸左右。中國國內注冊生產阿維菌素的公司有十多家，發酵周期為24化左右，但是阿 維菌素的效價不高，為4000 μ g/ml左右。送對產阿維菌素菌株的誘變篩選提出了要求。
[0003] 從當前我國生物技術產業來看，目前我國高產的工業生產菌種的獲得主要還是采 用隨機選育，包括自然選育、誘變育種和W原生質體融合為代表的雜交育種技術，篩選工作 量大，費時費力。送是因為產量性狀受多基因決定，一次誘變和篩選很難有大幅度提高，需 要多輪誘變篩選才能獲得穩定、高產的單菌落培養物（菌株），每輪都是一個大量篩選的過 程，送一點不同于W發現化合物為目標的菌種篩選。因此，擴大篩選量可W有效減少隨機篩 選的盲目性特點，是提高育種效率的一個重要方面，可W說篩選是菌種選育過程成敗的一 個關鍵步驟，但無論是隨機篩選還是推理選育，都受到人力物力等諸多因素的限制，使得篩 選效率很低，勢必造成漏篩。因此，需要建立新的篩選方法W提高篩選效率。
[0004] 近幾年用于微生物菌種高通量篩選裝置及其相關技術不斷發展和成熟。特別是歐 美等發達國家開發出全自動高通量篩選工作站，應用最先進的計算機技術和機器人技術， 能夠實現高效高通量篩選，但是此類大型設備價格相當昂貴，即使在發達國家，也只有財力 雄厚的大型實驗室具備購買能力，國內企業近期內根本無法承受。因此，使用現有的通用低 成本儀器設備，自主開發簡便、快速、精準、高效的高通量篩選技術具有重要現實意義。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種產阿維菌素高產菌的高通量篩選方法。
[0006] 在本發明的第一方面，提供一種高通量篩選阿維菌素高產菌的方法，包括：
[0007] (1)將待篩選的阿維菌素生產菌分別接種于深孔板中，在孔板發酵培養基中 培養使其生產阿維菌素；其中，所述的孔板發酵培養基包括：玉米淀粉7±lg/L、豆餅粉 1. 25 + 0. 2g/L、酵母粉 0. 5 + 0. 08g/L、硫酸倭 0. 0125 + 0. 002g/L、碳酸巧 0. 04 + 0. 006g/L、 氯化鉆 0. 0011 + 0. 0002g/L、鋼酸鋼 0. 0011 + 0. 0002g/L、硫酸儘 0. 00011 + 0. 000025g/L、 淀粉酶 0.005 + 0. 0008g/L ;
[0008] (2)采用比濁法檢測深孔板各孔的阿維菌素的產量，鑒定阿維菌素高產菌。
[0009] 在一個優選例中，所述的待篩選的阿維菌素生產菌是經誘變處理的菌株。
[0010] 在另一優選例中，所述的誘變處理包括：W阿維菌素生產菌為出發菌進行誘變，獲 得經誘變的菌株。
[0011] 在另一優選例中，獲得經誘變的菌株后，還包括：在經誘變的菌株（較佳地，還進 行平板培養）中，挑選單克隆分別轉接于種子深孔板各孔中進行培養（每孔一個克隆），之 后分別轉接于發酵深孔板各孔（每孔一個克隆）中。
[0012] 在另一優選例中，所述的孔板發酵培養基的抑7. 5 + 0. 2。
[0013] 在另一優選例中，所述的深孔板為24孔、48孔或96孔深孔板。
[0014] 在另一優選例中，所述的深孔板為24孔的方形深孔板，每孔裝液體積為 1. 4-1. 8ml (最佳地為1. 6ml)，發酵培養接種量是5 %，搖床轉速250 + 20巧m，培養溫度 28 ± rC ;種子培養42 ± 4小時，發酵周期240 ± 20小時。
[0015] 在另一優選例中，步驟（2)中，采用酶標儀檢測深孔板各孔的阿維菌素的產量。
[0016] 在本發明的另一方面，提供一種用于高通量篩選阿維菌素高產菌的孔板發酵培 養基，所述培養基包括；玉米淀粉7±lg/L、豆餅粉1. 25 + 0. 2g/L、酵母粉0. 5 + 0. 08g/L、 硫酸倭 0. 0125 + 0. 002g/L、碳酸巧 0. 04 + 0. 006g/L、氯化鉆 0. 0011 + 0. 0002g/L、鋼酸鋼 0. 0011 + 0. 0002g/L、硫酸儘 0. 00011 + 0. 000025g/L、淀粉酶 0. 005 + 0. 0008g/L。
[0017] 在一個優選例中，所述的孔板發酵培養基包括：玉米淀粉7g/L、豆餅粉1. 25g/L、 酵母粉0. 5g/L、硫酸倭0. 0125g/L、碳酸巧0. 04g/L、氯化鉆0.0 Ollg/L、鋼酸鋼0.0 Ollg/L、 硫酸儘 0.0 OOllg/L、淀粉酶 0. 005g/L。
[0018] 本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見 的。
【附圖說明】
[0019] 圖1、發酵液HPLC檢測圖譜。
【具體實施方式】
[0020] 本發明提供了 一種用于微生物誘變育種、發酵工程領域W實現對菌種高通量篩選 的方法，尤其是一種產阿維菌素高產菌的高通量篩選方法。基于現有技術的方法，本發明人 在篩選工藝上進行了改進，優化了用于篩選的培養基的配方，實現了簡便、快速、精準、高效 且高通量的篩選。
[0021] 傳統的菌種篩選先從平板上挑取單菌落接種于斜面培養基，待斜面上菌體長成 后，發酵搖瓶初篩，再進行搖瓶發酵復篩，阿維菌素效價用高效液相色譜檢測。篩選過程具 有一定的盲目性，容易漏篩，造成篩選效率低且費時費力費材。本發明對ARTP誘變后的菌 懸液進行涂布平板，待平板上菌落長成熟后用單克隆挑選儀挑選菌落接種于24孔板進行 發酵培養，應用優化的孔板發酵培養基進行發酵培養，發酵周期結束后采用酶標儀檢測阿 維菌素產量，整個篩選過程每一環節都實現了高通量。本發明有效增加了篩選樣本，降低篩 選工作強度，節約原料，提高篩選效率。
[0022] 培養基優化
[0023] 現有技術中，阿維菌素生產菌的發酵培養基的碳氮源是工業上使用的豆餅粉和酵 母粉，然而，當將之應用于深孔板中作為高通量篩選用培養基時，本發明人發現常規的發酵 培養基并不適用，無法進行有效的培養和檢測，篩選得率和準確性很差。為此，本發明人進 行了大量的研究試驗，最終發現，應用本發明的配方的孔板發酵培養基進行培養，不僅孔與 孔之間的平行性得到了改善，而且阿維菌素的效價也有了顯著的提高。
[0024] 所述的孔板發酵培養基包括：玉米淀粉7± Ig/L、豆餅粉1. 25 + 0. 2g/L、 酵母粉 0. 5 + 0. 08g/L、硫酸倭 0. 0125 + 0. 002g/L、碳酸巧 0. 04 + 0. 006g/L、氯化鉆 0. 0011 + 0. 0002g/L、鋼酸鋼 0. 0011 + 0. 0002g/L、硫酸儘 0. 00011 + 0. 000025g/L、淀粉酶 0. 005 + 0. 0008g/L。作為本發明的優選方式，所述的孔板發酵培養基的抑7. 5 + 0. 2。
[00幼深孔板
[0026] 本發明根據阿維鏈霉菌高好氧、易結球、培養過程蒸發量大的特點，選用深孔板， 從而可較好地進行供氧。作為本發明的優選方式，所述的深孔板為24孔、48孔或96孔深孔 板等適用于酶標儀批量檢測的深孔板。作為更優選的方式，采用方底24孔深孔板。
[0027] 在本發明的優選實施方式中，將誘變好的菌懸液進行平板涂布，菌落長成后用挑 選單克隆（較佳地，應用單克隆挑選儀進行挑選）接種于深孔板進行培養，發酵