食品中單核細胞增生李斯特氏菌lamp檢測引物及方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于食品安全的分子生物學檢測方法領域，涉及食品中單核細胞增生李斯 特氏菌的LAMP檢測專用引物及其檢測方法。
【背景技術】
[0002] -直以來，食源性細菌中毒事件在我國乃至世界范圍內頻繁發生，對人類健康、社 會經濟發展造成很大的威脅。其中由單核細胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes) 引起的食源性細菌中毒事件逐漸引起人們的重視。單核細胞增生性李斯特氏菌最早是 Murray等人于1926年在英國從家兔和豚鼠體內分離得到的，因為接種此菌的家兔發生明顯 的單核細胞增多，故因此得名。單增李斯特菌在自然界中分布廣泛，并可以寄生在生物體 內，人畜感染后，主要表現為腦膜炎、敗血癥和血液中單核細胞增多等癥狀，死亡率高達so-so% ，對畜牧業的發展造成了十分嚴重的危害，對人和動物的生命安全構成了嚴重的威脅， 被世界衛生組織(WHO)列為20世紀90年代食品中四大致病菌之一。
[0003] 目前對該菌的檢測方法主要有傳統分離鑒定方法、免疫學方法和PCR方法。三種方 法各有優缺點，其中傳統分離鑒定方法準確性較高，但檢測周期長，不適用于現場快速檢測 需求;免疫學檢測周期短，但靈敏度較差;PCR的方法檢測時間短、靈敏性高，但對儀器設備 要求較高。研究新的快速、準確，操作簡便的單增李斯特氏菌檢測方法，具有重要的現實意 義。
[0004] 環介導等溫擴增技術（Loop-mediated Isothermal Amplification，簡稱LAMP)， 是2000年由日本的榮研株式會的Notomi T等人開發出來的一種新的核酸擴增方法。LAMP法 是針對靶基因的6個區域設計4種特異的引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶（Bst DNApolymerase)在恒溫條件(65°C左右)保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴增反應，具有高特 異性和等溫快速擴增的特點。本文通過優化LAMP反應條件，建立單增李斯特菌LAMP檢測方 法，并將其應用于冷鮮肉中單增李斯特菌快速檢測。
[0005] 單核細胞增生李斯特菌作為食品衛檢驗中一項重要的目的菌，提高其檢出限、縮 短檢測時間，對保證食品的安全和消費者的身體健康有著重要的意義。但是，迄今為止，市 場上還未見用于檢測單核細胞增生李斯特氏菌的LAMP的專用引物問世。
【發明內容】
[0006] 本發明的第一個目的是提供一種特異性和靈敏度高的用于單核細胞增生李斯特 氏菌的LAMP檢測專用引物。
[0007] 本發明所提供的用于對單核細胞增生李斯特氏菌進行LAMP檢測的專用引物，是根 據如序列表中序列1所示的單核細胞增生李斯特氏菌的溶血素基因（hlyA)靶基因設計的， 用以定性檢測待測樣品中的單核細胞增生李斯特氏菌。
[0008] 具體來講，所述用于對單核細胞增生李斯特氏菌進行LAMP檢測的專用引物為以下 4條引物的組合，由序列表SEQ ID No. 1至序列表SEQ ID No.4所示堿基序列的寡核苷酸組 成；其中SEQ ID No.1為正向外引物，SEQ ID No.2為反向外引物，SEQ ID No.3為正向內引 物，SEQ ID No.4為反向內引物。詳見表1。
[0009] 表1引物序列
[0010]
[0011] 本發明的第二個目的是提供一種食品中單核細胞增生李斯特氏菌的LAMP檢測方 法。
[0012] 本發明所提供的單核細胞增生李斯特氏菌的LAMP檢測方法，具體包括以下步驟：
[0 013 ] 1)取待測的食品樣品2 5 g (液體食品2 5 m L )，置于2 2 5m L滅菌水中，勾漿。取勻漿液 lmL，置于9mL的Li s增菌液體培養基中，37 °C培養6h。
[0014] 2)取lmL菌懸液以10，OOOrpm離心lmin，棄上清。加500yL TE (pH8 · 0)重懸菌液，加 入50yL SDS(10 % )混勻，加500yL酚：氯仿：異戊醇（25 : 24:1)，劇烈震蕩，12，OOOrpm離心 10min，取上清。加等體積的氯仿:異戊醇(24:1)，混勾，12,000rpm，離心lmin，取上清。加25μ L的乙酸鈉和500yL的無水乙醇，混勾，冰浴10min。12，OOOOrpm離心5min，棄去溶液，自然干 燥之后加50yL的TE溶液溶解，-20°C冷藏備用。
[0015] 3)建立LAMP反應體系如下：
[0016]
[0017]將建立的LAMP體系放入等溫擴增儀中，設定反應溫度63°C，反應時間為45min。根 據擴增曲線判定檢測結果，如出現擴增曲線則為陽性檢測，如無擴增曲線則為陰性樣品。
[0018] 本發明建立的快速檢測食品中單核細胞增生李斯特氏菌LAMP檢測引物及方法，本 發明與現有技術相比具有靈敏度高、特異性好，操作簡單等優點，適用于食品安全快速檢 測 。
【附圖說明】
[0019] 圖1 LAMP特異性分析
[0020] 圖2 LAMP檢測限分析
【具體實施方式】
[0021]實施例在以本發明技術方案為前提下進行實驗，給出了詳細的實施方式和具體的 操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。
[0022] 實施例1: LAMP檢測引物設計
[0023] 根據單核細胞增生李斯特氏菌的溶血素基因 (hlyA)為靶基因設計，利用LAMP在線 設計軟件Primer Explorer V4(http: //primerexplorer · jp/e/)針對相對保守序列區設計 LAMP引物，序列如下：
[0024] F3：CGTTGTAAAAAATGCTACTAAATCG；SPSEQ ID N0：1
[0025] B3:CGCCGAAGTTTACATTCAAAC;即SEQ ID N0:2
[0026] FIP:GCACTTACATTCGGATAAGCTTGAG-CAACGCAGTAAATACATTAGTGG;即SEQ ID NO:3
[0027] BIP:ATGATGACGAAATGGCTTACAGT-AGCTTTAAATGCAGTACCAAAT;即SEQ ID NO:4
[0028] 實施例2:樣品增菌及基因組DNA提取
[0029] 取待測的食品樣品25g(液體食品25mL)，置于225mL滅菌水中，勻漿。取勻漿液lmL， 置于9mL的Lis增菌液體培養基中，37°C培養6h。取lmL菌懸液以10,000rpm離心lmin，棄上 清。加500yL TE(pH8.0)重懸菌液，加入50yL SDS( 10%)混勻，加500yL酚:氯仿：異戊醇（25: 24:1)，劇烈震蕩，12，OOOrpm離心1 Omin，取上清。加等體積的氯仿:異戊醇(24:1)，混勻，12， OOOrpm，離心lmin，取上清。加25yL的乙酸鈉和500yL的無水乙醇，混勾，冰浴10min。12， OOOOrpm離心5min，棄去溶液，自然干燥之后加50yL的TE溶液溶解，-20°C冷藏備用。
[0030] 實施例3: LAMP檢測體系建立 [0031] 擴增體系如下：
[0032]
[0033]
[0034]將建立的LAMP體系放入等溫擴增儀中，設定反應溫度63°C，反應時間為45min。根 據擴增曲線判定檢測結果，如出現擴增曲線則為陽性檢測，如無擴增曲線則為陰性樣品。 [0035] 實施例4: LAMP特異性分析
[0036]分別以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌0157、痢疾志賀氏菌、枯草芽孢桿菌、傷寒沙門 氏菌為模板，以雙蒸水為陰性對照，對本發明的LAMP法的特異性進行檢測。檢測結果如圖1， 5種致病菌均未出現陽性結果，表明本發明建立的單核細胞增生李斯特氏菌的LAMP方法特 異性強。
[0037]實施例5:檢測限分析
[0038]按照本方法提取單核細胞增生李斯特氏菌基因組DNA，對基因組DNA進行定量分 析。然后將提取得到的基因組DNA(227ngAU)進行10倍梯度，再以經梯度稀釋的DNA為模板， 分別用本發明建立的LAMP檢測方法進行靈敏度檢驗。結果如圖2所示，本方法建立的LAMP檢 測引物及方法能夠檢測到22.7fg的基因組DNA，經本方法能夠檢測到每克食品中10個以內 的單核細胞增生李斯特氏菌污染。
【主權項】
1. 一種用于檢測食品中單核細胞增生李斯特菌的LAMP引物組，其特征在于，由序列表 SEQ ID No. 1至序列表SEQ ID No.4所示堿基序列的寡核苷酸組成；其中SEQ ID No. 1為正 向外引物，SEQ ID No.2為反向外引物，SEQ ID No.3為正向內引物，SEQ ID No.4為反向內 引物。2. -種食品中單核細胞增生李斯特菌的LAMP檢測方法，其特征在于，該方法包括以下 步驟： (1) 待測食品樣品的取樣、增菌及DNA提取； (2) 進行LAMP反應;反應條件為63 °C恒溫反應45min。3. 根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于，步驟(2)中，進行LAMP反應時，使用的 引物為序列表SEQ ID No. 1所示的正向外引物，序列表SEQ ID No.2所示的反向外引物，序 列表SEQ ID No.3所示的正向內引物，序列表SEQ ID No.4所示的反向內引物。
【專利摘要】本發明名稱為食品中單核細胞增生李斯特氏菌LAMP檢測引物及方法。本發明涉及食品安全檢測技術領域，針對單核細胞增生李斯特氏菌的溶血素基因(hlyA)開發一套LAMP快速檢測引物，其包含有如序列表SEQ？ID？NO：1，SEQ？ID？NO：2，SEQ？ID？NO：3和SEQ？ID？NO：4所示的核苷酸序列，并建立LAMP快速檢測方法。本發明的突出優點在于：采用本發明中的引物及方法，能夠實現食品中單核細胞增生李斯特氏菌的快速檢測，本方法具有快速高效、操作簡便、特異性高、靈敏性高的特點，可用于食品中單核細胞增生李斯特氏菌的快速檢測，適于推廣應用。
【IPC分類】C12R1/01, C12N15/11, C12Q1/68, C12Q1/04
【公開號】CN105567864
【申請號】CN201610154623
【發明人】謝遠紅, 張紅星, 顧思宇, 賈淼
【申請人】北京農學院
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2016年3月18日