一種副溶血弧菌氟喹諾酮類藥物耐藥基因檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于病原菌檢測技術領域，具體涉及一種副溶血弧菌氟喹諾酮類藥物耐藥基因檢測方法。
[0002]
【背景技術】
[0003]氟喹諾酮類藥物對G-桿菌，包括綠膿桿菌均有良好抗菌作用，對G+球菌也具一定抗菌活性。在氟喹諾酮類較廣泛使用的品種中，對綠膿桿菌作用較強的為環丙氟哌酸，其次為氟嗪酸。氟嗪酸對一般陰性桿菌的作用與環丙氟哌酸相仿或稍弱，90年代后開發的新品種多氟哌酸類某些品種，不僅抗G-桿菌活性與環丙氟哌酸相似，而且抗G+球菌作用加強，對MRSA有效，對衣原體、支原體、厭氧菌亦有一定作用，明顯優于環丙沙星。
[0004]國內外的大量研究表明，由于氟喹諾酮藥物長期和大量使用，副溶血弧菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥性十分嚴重。常見的氟喹諾酮耐藥基因已經發現的有:GyrA，GyrB,ParC, ParE等。耐藥性產生的直接后果是嚴重影響了臨床療效，尤其在人畜同藥的情況下，耐藥性通過水產產品等途徑弓I起的交叉傳播，直接對人體健康構成威脅。
[0005]目前我國水產產品耐藥性檢測控制中，傳統方法是通過測定副溶血弧菌的最低抑菌濃度或抑菌圈大小測定副溶血弧菌的耐藥性。傳統的藥敏試驗必須經過繁瑣的副溶血弧菌分離純化、繁殖擴增等步驟，檢測周期長，最快也要48h左右。不利于臨床上及時的選藥治療。同時，藥敏試驗是在體外用藥物試探性的檢驗副溶血弧菌的表型耐藥特性，不能檢測副溶血弧菌的隱型耐藥性。
[0006]
【發明內容】
[0007]本發明的目的在于克服現有技術缺陷，提供一種副溶血弧菌氟喹諾酮類藥物耐藥基因檢測方法。
[0008]本發明的具體技術方案如下:
一種副溶血弧菌氟喹諾酮類藥物耐藥基因檢測方法，包括如下步驟:
(1)收集副溶血弧菌活菌體1.0-1.2g，用7?8mL去離子水重懸，反復凍融破碎細胞，離心后收集上清液，得到模板；
(2)將該模板與氟喹諾酮類藥物耐藥基因檢測引物GyrA-F、GyrA-R、GyrB-F、GyrB-R、ParE-F和ParE-R共同混合后，進行PCR擴增，該PCR擴增的反應體系中包括超純水、PCR緩沖液、終濃度均為0.3-0.5mmol/L的dNTP、終濃度為0.3-0.5mmol/L的GyrA_F、終濃度為0.3?
0.5mmol/L的GyrA-R、終濃度為0.5?0.8mmol/L的GyrB-F、終濃度為0.5?0.8mmol/L的GyrB-R、終濃度為0.5-0.6mmol/L的ParE-F、終濃度為0.5-0.6mmol/L的ParE-R和終濃度為0.02-
0.03U/uL 的 TaqDNA 聚合酶，其中 GyrA-F、GyrA-R、GyrB-F、GyrB-R、ParE-F 和 ParE-R 分別如SEQ ID 1、SEQ ID 2、SEQ ID 3、SEQ ID 4、SEQ ID 5和SEQ ID 6，上述PCR緩沖液的 10倍母液中包括 10?20mM氯化鉀、pH8.3的 12mMTris_HCl和0.01?0.02%氯化鈉，20?30mM MgCl2；
(3)步驟(2)的PCR擴增結束后，進行瓊脂糖凝膠電泳并送交測序。
[0009]在本發明的一個優選實施方案中，所述步驟(I)為:收集副溶血弧菌活菌體1.0?
1.2g，用7?8mL去離子水重懸，反復凍融破碎細胞，10000?12000rpm離心10?15min后收集上清液，得到模板。
[0010]在本發明的一個優選實施方案中，所述PCR擴增的反應體系中包括超純水、PCR緩沖液、終濃度均為0.4mmo 1/L的dNTP、終濃度為0.4mmol/U^GyrA-F、終濃度為0.4mmo 1/L的GyrA-R、終濃度為0.7mmol/L 的 GyrB-F、終濃度為 0.7mmol/L 的 GyrB-R、終濃度為 0.5mmol/L的ParE-F、終濃度為0.5mmol/L的ParE-R和終濃度為0.02U/uL的TaqDNA聚合酶。
[0011]在本發明的一個優選實施方案中，所述PCR緩沖液的10倍母液中包括15mM氯化鉀、pH8.3的 12mMTris-HCl和0.01%氯化鈉，30mM MgCl2。
[0012]在本發明的一個優選實施方案中，所述PCR擴增的反應條件如下:90?93°C預變性8?1min，然后進入如下循環:90?93 °C變性40s?50s、50?53°C退火40?50s、72?74 °C延伸50s?lmin，共30~35個循環，循環結束后于72°C延伸5~10min，2?4°C保存。
[0013]進一步優選的，所述PCR擴增的反應條件如下:93°C預變性1min，然后進入如下循環:93 °0變性508、531退火508、72 °C延伸lmin，共35個循環，循環結束后于72°C延伸10min，4°C 保存。
[0014]在本發明的一個優選實施方案中，所述步驟(3)的電泳條件為:2%瓊脂糖凝膠，80V電壓，時間40min。
[0015]本發明的有益效果是:
1、本發明的檢測方法敏感、特異、快速，可以檢測極微量的目的基因進行檢測，而不需要經過費時的副溶血弧菌培養階段；
2、本發明的檢測方法在同一反應體系中加入多對引物對多個氟喹諾酮耐藥基因同時進行擴增，在檢測基因過程中可設立內部對照；可指示出模板的數量;可同時擴增幾個目的基因:消耗的時間和試劑少，減少準備時間提尚效率;可大量地進彳丁樣品和目的基因的檢測。
[0016]
【附圖說明】
[0017]圖1為本發明實施例1的電泳檢測結果圖。
[0018]
【具體實施方式】
[0019]以下通過【具體實施方式】結合附圖對本發明的技術方案進行進一步的說明和描述。
[0020]
實施例1
(I )LB培養基搖瓶培養增殖副溶血弧菌，搖瓶培養條件為30°C，18h，120rpm，搖瓶培養結束后離心收集副溶血弧菌活菌體1.0g，用8mL去離子水重懸，反復凍融5次破碎細胞，12000pm離心I Omin后收集上清液，得到模板； (2)將該5uL模板與氟喹諾酮類藥物耐藥基因檢測引物GyrA-F、GyrA-R、GyrB-F、GyrB-R、ParE-F和ParE-R(引物濃度分別為25mmol/L，用ImM Tris-HCl—0.1mM EDTA緩沖液稀釋)共同混合后，進行PCR擴增，該PCR擴增的反應體系中包括超純水、PCR緩沖液、終濃度均為
0.4mmol/L 的 dNTP、終濃度為 0.4mmol/L 的 GyrA_F、終濃度為 0.4mmol/L 的 GyrA-R、終濃度為
0.7mmol/L的GyrB-F、終濃度為0.7mmol/L的GyrB-R、終濃度為0.5mmol/L的ParE-F、終濃度為0.5mmol/L 的 ParE-R 和終濃度為0.02U/uL 的TaqDNA 聚合酶，其中GyrA-F、GyrA-R、GyrB-F、GyrB-R、ParE-F和ParE-R分別如SEQ ID USEQ ID 2^SEQ ID 3^SEQ ID 4^SEQ ID 5和SEQID 6,上述PCR緩沖液的1倍母液中包括15mM氯化鉀、pH8.3的12mMTr i s_HCl和0.0I %氯化鈉，30mM MgCl2;
上述PCR擴增的反應體系為50uL，反應條件如下:93°C預變性1min，然后進入如下循環:93 °C變性50s、53°C退火50s、72 °C延伸lmin，共35個循環，循環結束后于72°C延伸10min，4°C 保存；
(3)步驟(2)的PCR擴增結束后，取5uLPCR產物，與IuL Loading buffer混勻后，點樣于2%瓊脂糖凝膠電泳板孔中，80V電壓，電泳40min，于紫外熒光成相儀下拍照判定，電泳結果如圖1所示，結果可見600bp左右、850bp左右、700bp左右的條帶，分別指示GryA基因、GryB基因、ParE基因。
[0021]同時將經過純化的PCR產物50uL和20uL三基因的上下游引物一起送深圳華大基因有限公司進行DNA測序。
[0022]以上所述，僅為本發明的較佳實施例而已，故不能依此限定本發明實施的范圍，SP依本發明專利范圍及說明書內容所作的等效變化與修飾，皆應仍屬本發明涵蓋的范圍內。
【主權項】
1.一種副溶血弧菌氟喹諾酮類藥物耐藥基因檢測方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)收集副溶血弧菌活菌體1.0-1.2g，用7?8mL去離子水重懸，反復凍融破碎細胞，離心后收集上清液，得到模板； (2)將該模板與氟喹諾酮類藥物耐藥基因檢測引物GyrA-F、GyrA-R、GyrB-F、GyrB-R、ParE-F和ParE-R共同混合后，進行PCR擴增，該PCR擴增的反應體系中包括超純水、PCR緩沖液、終濃度均為0.3-0.5mmol/L的dNTP、終濃度為0.3-0.5mmol/L的GyrA_F、終濃度為0.3?0.5mmol/L的GyrA-R、終濃度為0.5?0.8mmol/L的GyrB-F、終濃度為0.5?0.8mmol/L的GyrB-R、終濃度為0.5-0.6mmol/L的ParE-F、終濃度為0.5-0.6mmol/L的ParE-R和終濃度為0.02-0.03U/uL 的 TaqDNA 聚合酶，其中 GyrA-F、GyrA-R、GyrB-F、GyrB-R、ParE-F 和 ParE-R 分別如SEQ ID 1、SEQ ID 2、SEQ ID 3、SEQ ID 4、SEQ ID 5和SEQ ID 6，上述PCR緩沖液的 10倍母液中包括 10?20mM氯化鉀、pH8.3的 12mMTris_HCl和0.01?0.02%氯化鈉，20?30mM MgCl2； (3)步驟(2)的PCR擴增結束后，進行瓊脂糖凝膠電泳并送交測序。2.如權利要求1所述的一種副溶血弧菌氟喹諾酮類藥物耐藥基因檢測方法，其特征在于:所述步驟(I)為:收集副溶血弧菌活菌體1.0?1.2g，用7?SmL去離子水重懸，反復凍融破碎細胞，10000?12000rpm離心1?15min后收集上清液，得到模板。3.如權利要求1所述的一種副溶血弧菌氟喹諾酮類藥物耐藥基因檢測方法，其特征在于:所述PCR擴增的反應體系中包括超純水、PCR緩沖液、終濃度均為0.4mmo I /L的dNTP、終濃度為 0.4mmol/L 的 GyrA-F、終濃度為 0.4mmol/L 的 GyrA-R、終濃度為 0.7mmol/L 的 GyrB_F、終濃度為0.7mmol/L 的 GyrB-R、終濃度為 0.5mmol/L 的 ParE_F、終濃度為 0.5mmol/L 的 ParE-R 和終濃度為0.02U/uL的TaqDNA聚合酶。4.如權利要求1所述的一種副溶血弧菌氟喹諾酮類藥物耐藥基因檢測方法，其特征在于:所述PCR緩沖液的10倍母液中包括15mM氯化鉀、pH8.3的12mMTris_HCl和0.01%氯化鈉，30mM MgCl2o5.如權利要求1至4中任一權利要求所述的一種副溶血弧菌氟喹諾酮類藥物耐藥基因檢測方法，其特征在于:所述PCR擴增的反應條件如下:90?93°C預變性8?1min，然后進入如下循環:90-93 °C變性40s?50s、50?53°C退火40?50s、72?74 °C延伸50s?Imin，共30?35個循環，循環結束后于72°C延伸5?10!1^11，2~41保存。6.如權利要求5所述的一種副溶血弧菌氟喹諾酮類藥物耐藥基因檢測方法，其特征在于:所述PCR擴增的反應條件如下:93°C預變性1min，然后進入如下循環:93 °C變性50s、53°C退火50s、72 °C延伸lmin，共35個循環，循環結束后于72°C延伸10min，4°C保存。7.如權利要求1所述的一種副溶血弧菌氟喹諾酮類藥物耐藥基因檢測方法，其特征在于:所述步驟(3 )的電泳條件為:2%瓊脂糖凝膠，80V電壓，時間40min。
【專利摘要】本發明公開了一種副溶血弧菌氟喹諾酮類藥物耐藥基因檢測方法，該方法包括如下步驟：（1）收集副溶血弧菌活菌體1.0~1.2g，用7~8mL去離子水重懸，反復凍融破碎細胞，離心后收集上清液，得到模板；（2）將該模板與氟喹諾酮類藥物耐藥基因檢測引物GyrA-F、GyrA-R、GyrB-F、GyrB-R、ParE-F和ParE-R共同混合后，進行PCR擴增；（3）步驟（2）的PCR擴增結束后，進行瓊脂糖凝膠電泳并送交測序。本發明的檢測方法敏感、特異、快速，可以檢測極微量的目的基因進行檢測，而不需要經過費時的副溶血弧菌培養階段。
【IPC分類】C12Q1/68, C12Q1/02
【公開號】CN105567813
【申請號】CN201511011330
【發明人】黃升謀
【申請人】湖北文理學院
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2015年12月30日