一種利用重組大腸桿菌無外源l-脯氨酸發酵生產反式-4-羥脯氨酸的方法
【技術領域】
[0001]—種利用重組大腸桿菌無外源L-脯氨酸發酵生產反式-4-羥脯氨酸的方法，屬于微生物基因工程領域。
【背景技術】
[0002]反式-4-輕脯氨酸(trans-4-hydroxy-L_proline，Hyp)是L-脯氨酸輕基化后的產物，是亞氨基酸的一種。反式-4-羥脯氨酸最早發現于動物膠原蛋白中，因其有兩個不對稱碳原子而有四種立體異構體，是一個重要的手性合成元件，廣泛應用于醫藥、化工、食品、美容等行業。隨著反式-4-羥脯氨酸應用領域的不斷擴展，其生產方法也在逐漸發生變化，目前主要的生產方法是水解法和微生物發酵法。其中，由于水解法過程復雜、產生大量廢棄物、成本高等原因，逐漸被淘汰，而微生物發酵法能更好的解決這方面的問題，越來越受人們關注。
[0003]微生物發酵法是通過生物細胞表達的脯氨酸-4-羥化酶，將游離的脯氨酸轉化為反式-4-羥基-L-脯氨酸的生產方法。脯氨酸-4-羥化酶催化脯氨酸轉化為羥脯氨酸的過程中，需要以亞鐵離子作為催化輔因子，同時需要酮戊二酸和氧分子的參與。其中，在微生物體內，L-脯氨酸的生產過程是，由α-酮戊二酸形成的谷氨酸，經谷氨酸激酶(pr0B編碼)催化下由ATP提供磷酸基團形成谷氨酰磷酸，又在谷氨酸脫氫酶(proA編碼)作用下將谷氨酸的γ -羧基還原成谷氨酸-T -半醛，然后自發環化形成五元環化合物Λ ’ 二氫吡咯-5-羧酸，再由二氫吡咯還原酶(proC編碼)催化形成脯氨酸。其中脯氨酸能夠反饋抑制谷氨酸激酶，而且proB與proA是作為一個操縱子proBA進行表達的，將proBA突變成proB2A后能夠降低脯氨酸的反饋抑制，大量生產L-脯氨酸。
[0004]將谷氨酸激酶基因(ProB2A)與連有色氨酸串聯啟動子的反式-4-羥脯氨酸的脯氨酸羥化酶基因(hyp)構建成共表達體系，轉入到宿主菌中，獲得含有該共表達體系的重組菌，能夠在無外源L-脯氨酸的條件下，利用葡萄糖直接連續發酵生產反式-4-羥脯氨基酸，降低發酵生產成本，具有廣闊的應用前景。
【發明內容】
[0005]本發明旨在無外源L-脯氨酸的條件下，在微生物體內，提高利用葡萄糖直接連續發酵生產反式-4-輕脯氨基酸的產量，降低生產成本。
[0006]本發明所述的利用重組菌發酵生產反式-4-羥脯氨酸的方法，其特征在于，將proBA突變成?抓84后，其編碼的谷氨酸激酶能夠降低L-脯氨酸的反饋抑制，與經優化后的連有色氨酸串聯啟動子的反式-4-羥脯氨酸的脯氨酸羥化酶基因(hyp)構建成合適的共表達體系，將該共表達體系轉入到合適的宿主菌中，在無外源L-脯氨酸的條件下，能夠高效的利用葡萄糖直接連續發酵生產反式-4-羥脯氨酸。
[0007]本發明中的兩種基因只有脯氨酸羥化酶基因(hyp)含有獨立的高效啟動子-色氨酸串聯啟動子(Ptrp2)，該啟動子是從已有的重組載體上酶切獲得。
[0008]本發明中的proB2A、hyp共表達體系構建方法是，從已有的重組載體上酶切獲得ProB2A，然后將其連接到含有pET28a-Ptrp2-hyp的重組載體上，獲得pET28a-proB2A_Ptrp2-hyp，然后設計合適的酶切位點8&1^1、恥111，？0?獲得片段?抓84-?壯?2-1^?(8!0，將片段冊通過酶切位點連接到pUC19上，獲得共表達體系pUC19-proB2A-Ptrp2-hyp。
[0009]本發明中所用到的載體必須能夠在宿主內獨立復制，且插入的兩種片段要都能夠隨著載體的復制而各自復制。
[0010]本發明所述重組菌株在發酵反式-4-羥基-L-脯氨酸中的應用，其特征在于，所述的重組菌株在合適的發酵培養基中，于合適的發酵條件下進行培養，依發酵獲得的培養物、細胞體或它們的處理物作為酶源，依葡萄糖為底物，無需額外添加L-脯氨酸，高效利用葡萄糖直接連續發酵生產反式-4-羥基-L-脯氨酸，與之前的發酵生產反式-4-羥基-L-脯氨酸的方法相比，能夠降低發酵成本提高經濟效益。其中，所用的發酵培養不僅要滿足菌體的擴大生長的需求，而且要適合脯氨酸-反式-4-羥化酶基因的表達；用來羥基化L-脯氨酸的酶源不僅包括脯氨酸-反式-4-羥化酶基因直接編碼合成的酶，還包括依該酶為基礎，經修飾后的具有該酶類似催化活性的蛋白質。
[0011]本發明所生產的反式-4-羥基-L-脯氨酸，將發酵液離心后，分布于上清液中，可通過適當的后處理手段獲得結晶狀的產品。
[0012]本發明發酵液所生產的反式-4-羥基-L-脯氨酸，可通過氯胺-T法檢測，也可以利用高效液相色譜法精確測定。
【附圖說明】
[0013]圖1是單一表達載體pET28a_BH的構建。
[0014]圖2是單一表達載體pUC19-BH的構建。
[0015]圖3是含單一表達載體菌株的獲得。
【具體實施方式】
[0016]—般性說明:【具體實施方式】中所用到的酶全部從TaKaRa公司購買，sanprep柱式質粒DNA抽提試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒均購自上海生工，具體操作完全按照試劑盒的說明。
[0017]LB培養基:Tryptone 10g/L,Yeast extract 5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0_7.2ο
[0018]發酵培養基:GlucoselOg/L,Tryptone 8g/L，K2HP043g/L，NaCl 2g/L,MgSO40.2g/L，FeSO4ImM ,CaCl20.015g/L。
[0019]Amp抗性平板:I %Tryptone，0.5%Yeast extract, I %NaCl ,Ampicillin sodiumsalt 100yg/mLo
[0020]Kan抗性平板:I %Tryptone，0.5%Yeast extract, I %NaCl ,Kanamycin sulfate50yg/mLo
[0021]5XKCM緩沖液:0.5M KC1，0.15M CaCl2,0.25M MgCl2。
[0022]反式-4-羥脯氨酸的測定方法:將發酵液離心后，取上清，稀釋后取2.5mL于1mL試管中，加入ImL氯胺T(氯胺T溶液:將1.41g氯胺T溶于1mL水中，依次加入1mL正丙醇和80mL緩沖溶液，其中緩沖溶液配方為:將50g檸檬酸，26.3g NaOH和146.1g結晶乙酸鈉溶于水至1L，然后與200mL水以及300mL正丙醇混合)，搖勾后在室溫中放置20min;然后加入ImL顯色劑(顯色劑:稱取1g對二甲氨基苯甲醛，用35mL高氯酸溶解，緩慢加入65mL異丙醇)，搖勻后迅速將試管置于60°C水浴鍋中，20min后取出冷水冷卻，用分光光度計在560nm波長處測定吸光度值。
[0023]實施例1:含有proB2A的重組質粒(pET28a-proB2A)的獲得
[0024]將實驗室冷凍保存的含有pET28a-pr0B2A的菌株進行活化，于37°C，220rpm培養12-16小時，取培養后的菌液按照sanprep柱式質粒DNA抽提試劑盒說明書提取質粒。
[0025]實施例2:含有hyp的重組質粒(pUC19-Ptrp2_hyp)的獲得
[0026]將實驗室冷凍保存的含有pUC19-Ptrp2-hyp的菌株進行活化，于37°C，220rpm培養12-16小時，取培養后的菌液按照sanprep柱式質粒DNA抽提試劑盒說明書提取質粒。
[0027]實施例3:重組質粒 pET28a-proB2A-Ptrp2_hyp 的構建
[0028]利用限制性內切酶EcoR1、BamHI從重組質粒pUC19-Ptrp2-hyp中獲得片段Ptrp2-hyp ，然后用EcoR1、BamHI處理重組質粒pET28a_proB2A，將酶處理后的片段Ptrp2_hyp、pET28a-proB2A用T4DNA連接酶在16°C的條件下過夜連接，將1yL的連接液轉入JM109感受態中，挑取轉化后的單菌落培養提取質粒進行酶切驗證，驗證正確的重組質粒即為pET28a-proB2A-Ptrp2-hyp(pET28a-BH)。
[0029]實施例4:重組質粒pUC19-proB2A-Ptrp2_hyp的構建
[0030]由于質粒pUC19與pET_28a(+ )的多克隆位點內的酶切點不盡相同，因此設計兩端分別帶有BamH1、KpnI酶切位點的引物，通過PCR來獲得帶有合適酶切位點的proB2A-Ptrp2-hyp(BH)片段。然后用EC0R1、BamHI分別處理pr0B2A-Ptrp2-hyp(BH)片段以及pUC19質粒，用T4DNA連接酶在16°C的條件下過夜連接，將1yL的連接液轉入JM109感受態中，挑取轉化后的單菌落培養提取質粒進行酶切驗證，驗證正確的重組質粒即為pUC19-proB2A-Ptrp2-hyp(PUC19-BH)。
[0031]實施例5:利用重組菌株JM109/pUC19-BH、JM109/pET28a-BH的發酵生產反式-4-羥脯氨基酸
[0032]種子液的獲得:將實施例3、4獲得的重組菌株JM109/pUC19-BH、JM109/pET28a-BH分別在Amp與Kan抗性平板上劃線，挑單菌落分別接種到含有相應抗生素的LB培養基中，在37°C，220rpm的條件下培養8h。
[0033]發酵培養:按照6%的接種量將獲得的種子液接種到發酵培養基中，在30°C，220rpm的條件下培養24h。
[0034]發酵液中反式-4-羥脯氨基酸的測定:取發酵培養后的發酵液按照實施例一中反式-4-羥脯氨基酸的測定方法測定發酵液中反式-4-羥脯氨基酸的產量，測定結果顯示重組菌株JM109/pET28a-BH的反式-4-羥脯氨酸產量為0.9g/L，重組菌株JM109/pUC19-BH的反式-4-羥脯氨酸產量為1.lg/Lo
【主權項】
1.一株在無外源L-脯氨酸條件下發酵生產反式-4-羥脯氨酸的重組菌的構建方法，是將 proB2A、Ptrp2_hyp 重組到質粒 pUC19、pET28a 上，構建重組質粒 pUC19-proB2A-Ptrp2_hyp(PUC19-BH)、pET28a-proB2A-Ptrp2-hyp(pET28a-BH)，然后該重組質粒轉化到大腸桿菌中，實現pr0B2A、hyp在大腸桿菌中的共表達，該重組菌能夠在無外源L-脯氨酸條件下發酵生產反式-4-羥脯氨酸。2.權利要求1所述的ProB2A、hyp共表達體系，僅hyp需要優化后的組成型的色氨酸啟動子的啟動，proB2A并不需要啟動子啟動。3.權利要求1所述的?抓84是由proBA定點突變獲得的，其中proB基因突變了三個堿基，使編碼的氨基酸發生改變。4.權利要求1、2、3所述的口1'01324與口1'01^的區別僅僅在于口1'013發生突變41'04并未發生任何改變。5.權利要求1所述的重組載體所用的宿主菌為JM109或者BL21，同樣發酵條件下JM109作為宿主菌的產量較高。6.權利要求1、2所述的hyp是經優化后能在大腸桿菌中高效表達的基因。7.反式-4-羥脯氨酸的生產方法，其特征是將權利要求1所述的重組微生物在培養基上培養，將得到的培養物、菌體或者它們的處理物作為酶源，依葡萄糖為底物，生成L-脯氨酸，然后在2-酮戊二酸和亞鐵離子的存在下，使L-脯氨酸轉化為反式-4-羥基-L-脯氨酸。
【專利摘要】本發明公開了一種利用重組大腸桿菌直接從葡萄糖發酵生產反式-4-羥脯氨酸的方法，該方法是先將突變后的γ-谷氨酸激酶基因(proB2A)與連有色氨酸串聯啟動子的反式-4-羥脯氨酸的脯氨酸羥化酶基因(hyp)重組到合適的載體上，構建proB2A與hyp的共表達體系，然后將此共表達體系導入到大腸桿菌中，得到的重組菌能夠實現在無外源L-脯氨酸的條件下，能夠高效的利用葡萄糖直接發酵生產反式-4-羥脯氨酸，從而降低了發酵生產反式-4-羥脯氨酸的成本，提高了經濟效益。本發明還公開了所述大腸桿菌在羥脯氨酸生產中的應用。
【IPC分類】C12P13/24, C12N15/70
【公開號】CN105567720
【申請號】CN201610034465
【發明人】張震宇, 姚動邦, 王曉姣, 黃建華, 魏照輝
【申請人】江南大學
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2016年1月19日