一種嗜酸乳桿菌抗菌肽的分離純化方法
【技術領域】
[0001 ]本發明涉及一種抗菌肽的分離純化方法。
【背景技術】
[0002]目前在食品、醫藥和畜牧養殖行業，由于傳統抗生素的大量使用及濫用，導致了大量耐藥性菌株的出現及藥物殘留，對人類健康造成了極大的威脅。而且隨著人們健康消費意識的提升，迫切需要開發不易產生耐藥性且無殘留、無安全隱患的新型天然抗菌物質。所以作為天然來源的蛋白類抗菌肽成為近年來研究的熱點，并在食品、醫藥和畜牧養殖行業具有較廣的應用。抗菌肽主要來源于昆蟲、哺乳動物、兩棲動物、植物、細菌等。
[0003]嗜酸乳桿菌是腸道的主要益生菌之一，屬革蘭氏陽性菌。它可以產生細菌素、有機酸、過氧化氫等多種天然抑菌物質。其產生的主要抑菌物質是細菌素，是一種多肽類抗菌物，具有廣泛的用途。在食品工業中可以替代部分化學防腐劑，防止食品變質;在飼料工業上可以作為添加劑改善動物的腸道微生物類群；在醫藥工業上可以調節胃腸道菌群平衡，改善腸道微環境。嗜酸乳桿菌抗菌肽常規的提取方法是通過鹽析法或有機溶劑沉淀法再經柱層析進行純化，但是采用鹽析法沉淀時會帶有大量的雜蛋白，有機溶劑則會該使蛋白變性。而膜過濾是根據物質的分子量不同進行過濾，可以除去雜蛋白且不會影響蛋白的性質，同時該法適用于工業上大規模生產。
【發明內容】
[0004]針對上述現有技術的不足之處，本發明解決的問題為:傳統方法會使制備的嗜酸乳桿菌抗菌肽里混有雜蛋白或者使蛋白變性。
[0005]為解決上述問題，本發明采取的技術方案如下:
一種嗜酸乳桿菌抗菌肽的分離純化方法，包括步驟如下:(1)嗜酸乳桿菌固體發酵，得到嗜酸乳桿菌發酵產物；(2)將嗜酸乳桿菌發酵產物溶于水后，取上清液分別經過多個不同規格的超濾膜，得到不同分子量的組分；(3)將各個組分的上清液凍干，測量各個組分的抑菌活性；(4)將抑菌活性最好的組分通過凝膠柱層析，得到了高純度的嗜酸乳桿菌抗菌肽；
[5]嗜酸乳桿菌抗菌肽熱穩定性測試。
[0006]進一步，所述步驟(I)中的發酵溫度為36°C?37°C，厭氧發酵，培養時間為47h?49h0
[0007]進一步，所述步驟(2)中的超濾膜包括陶瓷膜、10000 Da超濾膜和1000 Da超濾膜，得到四組不同分子量的組分。
[0008]進一步，所述步驟(3)中通過打孔法測抑菌活性。
[0009]進一步，所述步驟(3)中采用單層瓊脂打孔法，以大腸桿菌k99和金黃色葡萄球菌作為指示菌，根據抑菌圈推斷各個組分的抑菌活性。
[0010]進一步，所述步驟(4)中通過Sephadex G_50凝膠柱層析，得到了高純度的嗜酸乳桿菌抗菌肽。
[0011]進一步，所述的步驟(5 )中將嗜酸乳桿菌抗菌肽經過40 °C、70 °C、100 °C、121°C四個溫度處理，測量各個溫度階段的嗜酸乳桿菌抗菌肽的抑菌活性變化。
[0012]本發明的有益效果
嗜酸乳桿菌抗菌肽常規的提取方法是通過鹽析法或有機溶劑沉淀法再經柱層析進行純化，但是采用鹽析法沉淀時會帶有大量的雜蛋白，有機溶劑則會該使蛋白變性。而本發明采用的超濾膜過濾是根據物質的分子量不同進行過濾，可以除去雜蛋白且不會影響蛋白的性質，同時該法適用于工業上大規模生產。
【具體實施方式】
[0013]下面對本
【發明內容】
作進一步詳細說明。
[0014]—種嗜酸乳桿菌抗菌肽的分離純化方法，包括步驟如下:(I)嗜酸乳桿菌固體發酵，得到嗜酸乳桿菌發酵產物；(2)將嗜酸乳桿菌發酵產物溶于水后，取上清液分別經過多個不同規格的超濾膜，得到不同分子量的組分；(3)將各個組分的上清液凍干，測量各個組分的抑菌活性;(4)通過凝膠柱層析，得到了高純度的嗜酸乳桿菌抗菌肽；(5)嗜酸乳桿菌抗菌肽熱穩定性測試。進一步優選，步驟(I)中的發酵溫度為36°C?37°C，厭氧發酵，培養時間為47h?49h。進一步優選，所述步驟(2)中的超濾膜包括陶瓷膜、10000 Da超濾膜和1000 Da超濾膜，得到四組不同分子量的組分。進一步優選，所述步驟(3)中通過打孔法測抑菌活性。進一步優選，所述步驟(3)中采用單層瓊脂打孔法，以大腸桿菌k99和金黃色葡萄球菌作為指示菌，根據抑菌圈推斷各個組分的抑菌活性，根據抑菌圈推斷分子量在1000?1000Da的組分為有效組分。進一步優選，所述步驟(4)中通過Sephadex G_50凝膠柱層析，得到了高純度的嗜酸乳桿菌抗菌肽。進一步優選，所述的步驟(5)中將嗜酸乳桿菌抗菌肽經過40°C、70°C、100°C、121°C四個溫度處理，測量各個溫度階段的嗜酸乳桿菌抗菌肽的抑菌活性變化，經測試，嗜酸乳桿菌抗菌肽經過40 °C、70 °C、100 °C、121°C四個溫度處理以后的抑菌活性表現的很穩定。
[0015]以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1.一種嗜酸乳桿菌抗菌肽的分離純化方法，其特征在于，包括步驟如下:(I)嗜酸乳桿菌固體發酵，得到嗜酸乳桿菌發酵產物；(2)將嗜酸乳桿菌發酵產物溶于水后，取上清液分別經過多個不同規格的超濾膜，得到不同分子量的組分；(3)將各個組分的上清液凍干，測量各個組分的抑菌活性；(4)將抑菌活性最好的組分通過凝膠柱層析，得到了高純度的嗜酸乳桿菌抗菌肽;(5)嗜酸乳桿菌抗菌肽熱穩定性測試。2.根據權利要求1所述的嗜酸乳桿菌抗菌肽的分離純化方法，其特征在于，所述步驟(1)中的發酵溫度為36°C?37°C，厭氧發酵，培養時間為47h?49h。3.根據權利要求1所述的嗜酸乳桿菌抗菌肽的分離純化方法，其特征在于，所述步驟(2)中的超濾膜包括陶瓷膜、10000Da超濾膜和1000 Da超濾膜，得到四組不同分子量的組分。4.根據權利要求1所述的嗜酸乳桿菌抗菌肽的分離純化方法，其特征在于，所述步驟(3 )中通過打孔法測抑菌活性。5.根據權利要求4所述的嗜酸乳桿菌抗菌肽的分離純化方法，其特征在于，所述步驟(3)中采用單層瓊脂打孔法，以大腸桿菌k99和金黃色葡萄球菌作為指示菌，根據抑菌圈推斷各個組分的抑菌活性。6.根據權利要求1所述的嗜酸乳桿菌抗菌肽的分離純化方法，其特征在于，所述步驟(4)中通過SephadexG_50凝膠柱層析，得到了高純度的嗜酸乳桿菌抗菌肽。7.根據權利要求1所述的嗜酸乳桿菌抗菌肽的分離純化方法，其特征在于，所述的步驟(5)中將嗜酸乳桿菌抗菌肽經過40°(:、70°(:、100°(:、121°(:四個溫度處理，測量各個溫度階段的嗜酸乳桿菌抗菌肽的抑菌活性變化。
【專利摘要】本發明公開了一種嗜酸乳桿菌抗菌肽的分離純化方法，包括步驟如下：（1）嗜酸乳桿菌固體發酵，得到嗜酸乳桿菌發酵產物；（2）將嗜酸乳桿菌發酵產物溶于水后，取上清液分別經過多個不同規格的超濾膜，得到不同分子量的組分；（3）將各個組分的上清液凍干，測量各個組分的抑菌活性；（4）將抑菌活性最好的組分通過凝膠柱層析；（5）嗜酸乳桿菌抗菌肽熱穩定性測試。本發明采用的超濾膜過濾是根據物質的分子量不同進行過濾，可以除去雜蛋白且不會影響蛋白的性質，同時該法適用于工業上大規模生產。
【IPC分類】C07K7/08, C07K7/06, C07K14/335, C07K1/16, C07K1/34, C07K1/36
【公開號】CN105566453
【申請號】CN201610046476
【發明人】李世超, 方華, 季春源, 朱校適, 郭子好
【申請人】江蘇鹽城源耀生物科技有限公司
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2016年1月25日