一種吡唑[5，6-d]并嘧啶類EGFR抑制劑及其抗腫瘤活性的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于藥物化學領域，具體而言，本發明涉及一種有良好抗腫瘤活性的吡唑 [5,6-d]并嘧啶類化合物。另外，本發明還涉及含有該種化合物的藥物組合物及其在制備抗 腫瘤藥物中的用途等。
【背景技術】
[0002] 肺癌是發病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，在世界范圍內每年因肺癌導致的死 亡超過100萬人；在我國，肺癌的發病率和死亡率在惡性腫瘤中長期居于首位，其中以非小 細胞肺癌（NSCLC)最為普遍，占發病總數的85%以上。目前，經典的手術切除或放化療往往 存在術后復發率高、毒副作用大、轉移和耐藥等多種缺陷。鑒于EGFR信號途徑在誘發NSCLC 腫瘤生長和血管增生中的重要作用，EGFR已經成為NSCLC靶向治療的重要靶點，其相應的 小分子抑制劑成為各大醫藥公司爭相研發的重要領域。
[0003] 目前，已有近20種EGFR抑制劑藥物進入臨床試驗階段或陸續上市。其中，被認為 是第一代EGFR抑制劑的易瑞沙（Gefinitib)、特羅凱（Erlotinib)和我國自主研發上市的 凱美納（Icotinib，2012年上市）等已在臨床NSCLC病人治療中獲得巨大成功。但經6~12 個月的治療后往往會發生明顯的繼發性耐藥，極大的限制了患者生存時間的延長，目前研 究認為這種耐藥通常是由于EGFR 20號外顯子T790M錯位突變所引起。2013年，Boehringer Ingelheim公司成功開發了首個第二代EGFR抑制劑Afatinib (BIBW2992)，其主要特點是可 以顯著抑制EGFR??，有效逆轉T790M所引起的耐藥。但是，Afatinib同時也強烈抑制野生 型EGFR(EGFR WT)，阻止體內正常組織EGFRWT激酶的磷酸化和相關信號通路的激活，從而帶 來較大的藥物毒副作用，臨床上表現為皮疹、嘔吐等藥物毒副反應。因此，開發具有高特異 性EGFR??突變體抑制劑已成為研發新一代抑制劑的首要目標。
[0004] 目前，EGFR抑制劑的構效關系并不明朗，有的結構差別很小的化合物，其針對 EGFR抑制的效果卻相差很大。本發明人經過艱苦努力，令人意外地設計并合成出一種新的 吡唑[5,6-d]并嘧啶類化合物，其具有優良的EGFR??抑制效果和選擇性，屬于第三代EGFR 抑制劑，能用于治療各種EGFR??高表達的腫瘤。
【發明內容】
[0005] 本發明要解決的技術問題是提供新的EGFR抑制劑類抗腫瘤化合物及其藥物。
[0006] 具體而言，本發明提供了式（WZ00411)所示的化合物或者其藥學上可接受的鹽：
[0007]
[0008] 化合物（WZ00411)為：
[0009] N6-(1H-吲哚-5)-N2-(4-(4-氮甲基哌嗪苯基）-1Η-吡唑[5,6-d]并嘧啶-4,6-二 胺
[0010] N4-(lH-indol-5-yl)-N6-[4-(4-methylpiperazin-1-yl) phenyl]-ΙΗ-pyrazolo[3,4-d]pyrimidine-4,6-diamine
[0011] 本發明要解決的技術問題在于提供新的含吲哚的嘧啶[5,6-d]并咪唑類化合物 和/或提供其在治療或預防腫瘤（尤其是EGFR依賴性或EGFR??突變高表達類腫瘤）方 面的新用途。
[0012] 本發明的目的之一是提供一種新型的吡唑[5,6-d]并嘧啶類EGFR抑制劑。
[0013] 本發明的目的之二是提供一種新型的吡唑[5,6-d]并嘧啶類EGFR抑制劑的制備 方法及抗腫瘤活性。
[0014] 在本發明中，我們首先利用化學方法合成了一種新型的吡唑[5,6-d]并嘧啶類化 合物WZ00411。利用體外激酶層次上的活性篩選實驗證實了化合物WZ00411具有強烈的 EGFR??抑制活性，同時對EGFR "具有一定選擇性并對其他激酶抑制活性較弱，具備良好的 激酶選擇性和第三代EGFR抑制劑特點（詳情見實施例1)。細胞層面上實驗也證實該化合 物可以有效抑制EGFR及其下游信號p-Akt和p-Erk的磷酸化水平（詳情見實施例2)。
【附圖說明】：
[0015] 這里所列舉的化合物只是為了更好地說明本發明的化合物類別和結構形式，并非 限制本發明。
[0016] 圖1說明合成的化合物WZ00411化學結構；
[0017] 圖2說明激酶選擇性抑制測試；
[0018] 圖3說明化合物細胞水平上化合物的抗腫瘤活性驗證。
[0019] 圖4說明化合物在H1975細胞水平上對下游信號通路蛋白磷酸化抑制作用。
[0020] 實施例1化合物體外抑制EGFR的活性和選擇性
[0021] EGFR激酶體外活性篩選：實驗采用方法為Caliper Mobility Shift Assay，該方 法是以微流體芯片技術的迀移率檢測技術為核心的檢測平臺。實驗步驟：配置1. 25x激酶 反應緩沖液（62. 5mmol/L HEPES，pH 7. 5 ;0· 001875% Brij-35 ;12· 5mmol/LMgC12 ;2· 5mM DTT)和激酶反應終止液（100mmol/L HEPES，pH 7· 5 ;0· 015 % Brij-35 ;0· 2 % Coating Reagent#3);在5 μ 1的5x濃度的化合物溶液中（用DMS0溶解，用水稀釋10倍）加入10 μ 1 的2. 5χ的FGFR1激酶溶液（在1. 25χ激酶反應緩沖液中加激酶），室溫孵育10min后再加 入10 μ 1的2. 5x底物肽溶液（在1. 25x激酶反應緩沖液中加 FAM標記肽和ATP)，在28°C下 反應特定的時間后加入25 μ 1激酶反應終止液。在Caliper上測試收集數據，對激酶活性 的抑制率=(max-conversion) / (max-min) *100。"max" 為未加化合物的 DMSO 對照，"min" 為低對照。測定IC5。時每種樣品設10個稀釋度各2個復孔，3次重復。
[0022] 激酶選擇性抑制測試：將WZ00411依照上述激酶抑制活性測定方法，測定對 VEGFR1、EGFR、TOGFR、FGFR1~2和C-Met等6種常見激酶的抑制活性，同時比較EGFRWT/ EGFR??激酶1C 5。活性比值，以表征這些化合物對EGFR WT和其他激酶的選擇性。以表征該 化合物對激酶的選擇性。
[0023] 激酶實驗表明：化合物WZ00411對EGFRWT/EGFR??抑制1C 5。分別為21. 33和 1156. 62nMol。對其它常見5種激酶的抑制活性均大于5000nMol (實驗數據見圖2)，因此具 有良好的EGFR??抑制活性和EGFR WT/EGFR?°M及其他激酶選擇性。（見圖2)
[0024] 實施例2細胞水平上化合物的抗腫瘤活性驗證
[0025] 采用MTT法化合物WZ00411在細胞層面上的抗腫瘤活性，選用含EGFR??高表達 的人NSCLC細胞株〇11975)46?1^高表達的人大細胞肺癌細胞株（A549)以及EGFR原發性 錯位突變的人肺癌細胞株（HCC827)等7種細胞進行增殖抑制活性測試。測定時以PBS為 空白對照，EGF為陰性對照，（EGF+WZ4002)為陽性對照，（EGF+待測樣品）為實驗組，每種樣 品設6個濃度梯度，計算IC 5。值。
[0026] 活性化合物對胞內EGFR促增殖信號通路的影響：選取化合物WZ00411，用EGF聯 合不同濃度的WZ00411分別處理含EGFR??高表達的非小細胞肺癌H1975細胞；提取細胞 總蛋白后，經Western blotting檢測細胞內EGF/EGFR信號通路中促增殖信號分子EGFR、 ERK和AKT磷酸化水平的變化。
[0027] 細胞實驗表明：化合物WZ00411體現了良好的EGFRWT/EGFR?° M選擇性。對EGFR ?°M 激酶抑制活性均達到20nMol，具有潛在的優化前景，并且擁有比WZ4002更優秀的激酶選 擇性，化合物WZ00411對EGFR WT/EGFR?°M選擇性為55倍（見圖3)。此外，WZ00411具有較 好的抗腫瘤增殖活性，并在1、10、100和ΙΟΟΟηΜοΙ四種濃度下均可強烈抑制H1975細胞中 p-EGFR，ρ-ΑΚΤ 和 p-ERK 水平（見圖 4)。
【主權項】
1. 具有下列化學結構的化合物及其可藥用鹽：化合物（WZ00411)為： N6- (1H-日引噪-5) -N2- (4- (4-氮甲基贓嗦苯基）-1H-化挫[5,6-d]并喀晚-4,6-二胺護- (lH-indol-5-yl) -妒- [4- (4-methylpiperazin-1-yl) phenyl] -IH-pyrazolo [3,4-d] pyrimi dine-4,6-diamine 譜圖表征為： iHNMR 化OOMHz，DMS0-d6) δ (ppm) :12. 758(s，IH，-NH-)，11. 079(s，IH，-NH-)，9. 484(s， IH，-NH-)，8. 786(s，IH，-NH-)，8. 031 (s，IH，-NH-)，7. 629(d，J = 7. 2Hz，2H，Ar-H)， 7. 391 (d，J = 8. 4Hz，3H，Ar-H)，7.352(s，lH，Ar-H)，6. 83 (d，J = 8. 4Hz，2H，Ar-H)，6. 415 (s， IH，Ar-H)，3. 135 (s，4H，N-CH2-) ,2.730 (s，4H，N-CH2-) ,2.412 (s，3H，N-Og.ESI-MS m/z : (M+Hr，calcd for〔2化5成:440. 33。2. 權利要求上述化合物，其用于治療腫瘤（如，肺癌、乳腺癌等）相關的疾病。3. 用于治療腫瘤（如，肺癌、乳腺癌等）或與腫瘤相關的疾病的藥物組合物，其包括權 利要求1所述的化合物和藥學上可接受的載體。4. 權利要求3所述的藥物組合物，其被制成片劑、膠囊、口服液、注射劑、粉劑、膏劑或 外用藥液。5. 權利要求1中所述的化合物在制備用于治療腫瘤（如，肺癌、乳腺癌等）或與腫瘤相 關的疾病的藥物中的應用。6. 用于治療腫瘤（如，肺癌、乳腺癌等）或與腫瘤相關的疾病的方法，其包括向患者施 用有效量的權利要求1中之任一所述的化合物。7. 權利要求3、4所述的化合物、藥物組合物、權利要求5所述的應用或權利要求6所 述的方法，其中腫瘤或與腫瘤相關的疾病是由表皮生長因子受體巧GFR)或T790M突變體 巧GFR??)超出正常量表達和釋放而導致的疾病。8. 權利要求1所述的化合物、權利要求3所述的藥物組合物、權利要求6所述的應用或 權利要求7所述的方法，其中腫瘤或與腫瘤相關的疾病選自肺癌、非小細胞肺癌、乳腺癌、 骨肉瘤、皮膚癌、陰莖癌、膀脫癌、前列腺癌、宮頸癌、子宮肌瘤、膽管癌、膜腺癌、肝癌、胃癌、 大腸癌、腎癌、鼻咽癌、食管癌、白血病、腦膜瘤、淋己瘤及其并發癥。
【專利摘要】本發明提供了一種EGFR抑制劑類具有抗腫瘤作用的吡唑[5，6-d]并嘧啶類化合物。另外，本發明還提供了該化合物的藥物組合物以及抗腫瘤用途等。
【IPC分類】A61P35/00, A61P35/02, C07D487/04, A61K31/519
【公開號】CN105566329
【申請號】CN201410635578
【發明人】張穎, 張喬喬, 葉清清, 何帆, 潘愷凌, 劉志國, 梁廣, 李校堃
【申請人】溫州醫科大學
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2014年11月7日