一種茶樹花蛋白酶及其制備方法和應用
【技術領域】：
[0001] 本發明屬于食品加工技術領域，具體是一種茶樹花蛋白酶及其制備方法和應用。
【背景技術】：
[0002] 出于成本考慮，茶飲料的大部分原材料茶葉存在品質較低的現狀，使其口感較差。 隨著健康飲食價值觀的指導，無糖、無添加劑的茶飲料會越來越受消費者的青睞。鑒于此， 茶飲料風味亟需得到改善來滿足消費者的需求。已發現利用蛋白酶可將茶葉中的蛋白質水 解成各種氨基酸，從而可W提高茶葉或茶飲料的香氣和鮮爽度。目前使用的蛋白酶有木瓜 蛋白酶、渡蘿蛋白酶、中性蛋白酶、蛋白酶Μ和鮮味酶等系列蛋白酶，但因每種酶的酶學特性 及來源不同，在提高茶葉氨基酸的能力存在差異。各種蛋白酶水解茶葉蛋白能力如表1所 /J、- 〇
[0003] 表1各種蛋白酶水解茶葉蛋白能力
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[0006] 我國茶樹花資源非常豐富，每年可產約40億公斤的茶樹花，然而運些資源卻未被 利用。因為人們主要利用茶樹的芽葉制茶，對茶樹花卻讓其自生自滅。茶樹花是一種無需重 新培育、豐富且可再生的天然資源。茶樹花采摘后，可使次年茶葉增產、提質30% W上，還可 避免抑花劑的使用。
【發明內容】
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[0007] 本發明的目的是提供一種茶樹花蛋白酶及其制備方法，該方法是利用了廢棄與可 再生的茶樹花資源，制備得到的茶樹花蛋白酶活力非常高，可顯著增加茶飲料中氨基酸含 量，活力顯著強于商業化蛋白酶。
[0008] 本發明的茶樹花蛋白酶是通過W下方法制備的，該方法包括W下步驟：
[0009] 將茶樹花與聚乙締聚化咯燒酬混合研磨成粉末，然后加入抑5~10的緩沖液提取， 使蛋白溶于溶液中，離屯、取上清液，在上清液中加入硫酸錠，得到飽和度為20~70%硫酸錠 沉淀的蛋白，即為茶樹花蛋白酶。
[0010]優選，所述的緩沖液為抑5~7.5的緩沖液。
[0011] 進一步優選，所述的緩沖液為P冊.0的0.1M巧樣酸緩沖液。
[0012] 優選，將茶樹花與聚乙締聚化咯燒酬按照質量比10:1的比例混合，然后液氮條件 下研磨成粉末，按茶樹花:巧樣酸緩沖液為Ig: 5ml的比例，加入P冊.0的0.1M巧樣酸緩沖液， 4°C提取化，使蛋白溶于巧樣酸緩沖液中，離屯、，取上清，上清液加入硫酸錠，得到飽和度為 20~70 %硫酸錠沉淀的蛋白，即為茶樹花蛋白酶。
[0013] 本發明的第二個目的是提供上述茶樹花蛋白酶在水解茶葉蛋白中的應用。
[0014] 本發明的第Ξ個目的是提供上述茶樹花蛋白酶在制作氨基酸茶飲料中的應用。
[0015] 本發明使用聚乙締聚化咯燒酬與茶樹花混合研磨，聚乙締聚化咯燒酬和酪、生物 堿形成復合物，從而從植物樣品中把他們去除，然后提取溶解蛋白，用硫酸錠沉淀蛋白，得 到飽和度為20 % -70 %硫酸錠沉淀的蛋白，即為茶樹花蛋白酶。
[0016] 本發明利用了廢棄與可再生的茶樹花資源，同時發現該資源中富含活力非常高的 蛋白酶，即茶樹花蛋白酶，該茶樹花蛋白酶可顯著增加茶飲料中氨基酸含量，活力顯著強于 商業化蛋白酶。此外茶樹花蛋白酶制備步驟簡單、反應條件寬，與茶葉具有極高同源性，相 比添加外源酶更具安全性與實效性。
[0017] 因此利用廢棄與可再生的茶樹花資源，通過資源重組，生物轉化手段，對廢棄資源 的高效與可持續利用，可促進茶樹花新資源創新產業的快速發展，為我國茶產業拓展了一 個具有競爭力的新增長點，也為廣大茶農開辟了一條增收的新渠道;此外，茶樹花蛋白酶是 一種天然、生態、安全的原料，與茶葉具有極高同源性，相比添加外源酶更具安全性與實效 性，可應用于低品質茶葉（占全年產量60%)深加工增值產品的開發，為安全有效提高低質 化茶葉資源的品質提供了 一種新途徑。
【具體實施方式】：
[0018] W下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。
[0019]實施例1:
[0020] 1)將lOg茶樹花加入Ig聚乙締聚化咯燒酬（PVPP)，液氮研磨成粉末。加入50mL 0.1M巧樣酸緩沖液(pH 6.0)，4°C提取化。將提取液轉移到50mL離屯、管中，10000g，4°C離屯、 30min，取上清。加入硫酸錠，使上清液的飽和度為20%，4°C沉淀化，10000g，4°C離屯、30min， 取上清。加入硫酸錠，使上清液的飽和度達到70%，過夜沉淀，10000g，4°C離屯、30min，去上 清，沉淀即為茶樹花蛋白酶。用0.1M巧樣酸緩沖液(pH 6.0)溶解，得到飽和度為20%-70% 硫酸錠沉淀的茶樹花蛋白酶液。獲得的茶樹花蛋白酶液中未檢測出游離氨基酸。如要大規 模使用，可考慮超濾(IF)技術進行脫鹽。
[0021] 2)在lOOmL茶飲料中加入Img的茶樹花蛋白酶，考慮到較高溫度反應可能會影響茶 飲料其他成分的變化，因此在實際應用采用37°C反應24h后，茶飲料氨基酸含量可從原先的 59.53 ±0.52mg總量增加到172.9 ± 3.07mg，氨基酸含量增加200 %，遠遠高于現有技術中蛋 白酶，主要增加的游離氨基酸為天冬氨酸、谷氨酸、天冬酷胺、絲氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮 氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、賴氨酸和精氨酸。
[0022] 實施例2:實施例1制備的茶樹花蛋白酶的酶學性質
[0023] 1、茶樹花蛋白酶不同pH值酶活性測定
[0024] 250μ1含1 %偶氮酪蛋白的不同pH值的緩沖液(pH 5.0,5.5,6.0和6.5的50mM巧樣 酸鋼緩沖液;pH 7.0,7.5,8.0和8.5的50mM Tris-肥 1 緩沖液;pH 9.0,9.5和 10.0的50mM碳 酸鋼緩沖液）中加入15化1的茶樹花蛋白酶液(3.81mg/ml)，37°C水浴化。加入1.2ml 10% TCA終止反應，反應液在室溫靜置15min，8000g離屯、8min，取上清，加入1.4ml 1M化0H，空白 W先加入TCA，再加入蛋白酶的反應為對照。反應結束后用分光光度計測其在490nm處的吸 光值。W每小時在490nm處的0.01個吸光值變化為一個酶活力單位U;
[002引其結果如表2所示
[0026] 表2茶樹花蛋白酶不同pH值酶活性測定
[0027]
[0028] 從表2可W看出，本發明分離得到的茶樹花蛋白酶適用性較廣，pH值范圍可從5到 7.5。
[0029] 2、茶樹花蛋白酶不同溫度下酶活性測定
[0030] 250μ1含1%偶氮酪蛋白的抑6.0的50mM巧樣酸鋼緩沖液加入15化1的茶樹花蛋白 酶液（3.81mg/ml)，分別在30°C，40°C，50°C，60°C，和70°C的恒溫水浴鍋中水浴化。加入 1.2ml 10 % TCA終止反應，反應液在室溫靜置15min，8000g離屯、8min，取上清，加入1.4ml IM NaOH，空白W先加入TCA，再加入蛋白酶的反應為對照。反應結束后用分光光度計測其在 490nm處的吸光值。W每小時在490nm處的0.01個吸光值變化為一個酶活力單位U;
[0031] 其結果如表3所示
[0032] 表3茶樹花蛋白酶不同溫度下酶活性測定
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[0035] 從表3可W看出，本發明分離得到的茶樹花蛋白酶適用性較廣，溫度范圍為30-60 °C，其中50°C其酶活力達到最大。
[0036] 實施例3:
[0037] 將lOg茶樹花加入Ig聚乙締聚化咯燒酬(PVPP)，液氮研磨成粉末。加入50mL 50mM 巧樣酸鋼緩沖液(pH 5.0)，4°C提取化。將提取液轉移到50mL離屯、管中，10000g，4°C離屯、 30min，取上清。加入硫酸錠，使上清液的飽和度為20%，4°C沉淀化，10000g，4°C離屯、30min， 取上清。加入硫酸錠，使上清液的飽和度達到70%，過夜沉淀，10000g，4°C離屯、30min，去上 清，沉淀即為茶樹花蛋白酶。
[003引實施例4:
[0039] 將lOg茶樹花加入Ig聚乙締聚化咯燒酬(PVPP)，液氮研磨成粉末。加入50mL 50mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)，4°C提取化。將提取液轉移到50mL離屯、管中，10000g，4°C離屯、 30min，取上清。加入硫酸錠，使上清液的飽和度為20%，4°C沉淀化，10000g，4°C離屯、30min， 取上清。加入硫酸錠，使上清液的飽和度達到70%，過夜沉淀，10000g，4°C離屯、30min，去上 清，沉淀即為茶樹花蛋白酶。
[0040] 實施例5:
[0041] 1)將lOg茶樹花加入Ig聚乙締聚化咯燒酬（PVPP)，液氮研磨成粉末。加入50mL 50mM碳酸鋼緩沖液(pH 10.0)，4°C提取化。將提取液轉移到50血離屯、管中，10000g，4°C離屯、 30min，取上清。加入硫酸錠，使上清液的飽和度為20%，4°C沉淀化，10000g，4°C離屯、30min， 取上清。加入硫酸錠，使上清液的飽和度達到70%，過夜沉淀，10000g，4°C離屯、30min，去上 清，沉淀即為茶樹花蛋白酶。
【主權項】
1. 一種茶樹花蛋白酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 將茶樹花與聚乙烯聚吡咯烷酮混合研磨成粉末，然后加入PH5~10的緩沖液提取，使蛋 白溶于溶液中，離心取上清液，在上清液中加入硫酸銨，得到飽和度為20~70 %硫酸銨沉淀 的蛋白，即為茶樹花蛋白酶。2. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的緩沖液為pH5~7.5的緩沖液。3. 根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述的緩沖液為pH6.0的0.1M檸檬酸 緩沖液。4. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，將茶樹花與聚乙烯聚吡咯烷酮按照質 量比10:1的比例混合，然后液氮條件下研磨成粉末，按茶樹花:檸檬酸緩沖液為lg:5ml的比 例，加入PH6.0的0.1M檸檬酸緩沖液，4°C提取2h，使蛋白溶于檸檬酸緩沖液中，離心，取上 清，上清液加入硫酸銨，得到飽和度為20~70%硫酸銨沉淀的蛋白，即為茶樹花蛋白酶。5. -種按照權利要求1、2、3或4所述的制備方法制備得到的茶樹花蛋白酶。6. 權利要求5所述的茶樹花蛋白酶在水解茶葉蛋白中的應用。7. 權利要求5所述的茶樹花蛋白酶在制作氨基酸茶飲料中的應用。
【專利摘要】本發明公開了一種茶樹花蛋白酶及其制備方法和應用。將茶樹花與聚乙烯聚吡咯烷酮混合研磨成粉末，然后加入pH5～10的緩沖液提取，使蛋白溶于溶液中，離心取上清液，在上清液中加入硫酸銨，得到飽和度為20～70％硫酸銨沉淀的蛋白，即為茶樹花蛋白酶。本發明利用了廢棄與可再生的茶樹花資源，同時發現該資源中富含活力非常高的蛋白酶，即茶樹花蛋白酶，該茶樹花蛋白酶可顯著增加茶飲料中氨基酸含量，活力顯著強于商業化蛋白酶。此外茶樹花蛋白酶制備步驟簡單、反應條件寬，與茶葉具有極高同源性，相比添加外源酶更具安全性與實效性。
【IPC分類】A23F3/16, C12N9/50
【公開號】CN105543199
【申請號】CN201610067080
【發明人】楊子銀, 傅秀敏, 陳義勇, 梅鑫, 周瀛
【申請人】中國科學院華南植物園
【公開日】2016年5月4日
【申請日】2016年1月29日