水楊酸鈉在發酵制備普魯蘭酶過程中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于發酵制備普魯蘭酶技術領域，具體設及水楊酸鋼在發酵制備普魯蘭酶 過程中的應用的專利申請。
【背景技術】
[0002] 普魯蘭酶巧C 3.2.1.41)專一性地水解支鏈淀粉分支點中的α-1，6糖巧鍵，由于其 能將最小單位的支鏈分解，最大限度的利用淀粉原料，因此在W淀粉為原料的食品發酵加 工業中有著重要的用途，廣泛應用于高葡萄糖漿、超高麥芽糖漿、啤酒及改性淀粉等的生產 中。
[0003] 克雷伯氏菌是目前普魯蘭酶的主要產生菌，然而，克雷伯氏菌在生長過程中合成 的芙膜多糖則不利于普魯蘭酶發酵生產，既消耗了培養基中的營養物質，增加了培養基的 粘度，降低了發酵液的溶氧速率，影響發酵產酶，也給酶的提取純化帶來困難。因此，減少克 雷伯氏菌芙膜多糖的合成，將有利于提高普魯蘭酶的發酵生產。然而如何抑制克雷伯氏菌 芙膜多糖的生成，及抑制芙膜多糖合成后普魯蘭酶的酶活等特性的改變情況尚未見到較為 詳細的研究報道。
【發明內容】
[0004] 本發明目的在于提供水楊酸鋼在發酵制備普魯蘭酶過程中的新應用，從而能夠較 好提高普魯蘭酶的酶活。
[000引本發明所采取的詳細技術方案如下所述。
[0006] 水楊酸鋼在發酵制備普魯蘭酶過程中的應用，利用克雷伯氏菌發酵制備普魯蘭酶 的過程中，將水楊酸鋼添加于產酶培養基中，可提高所制備的普魯蘭酶的酶活;產酶培養基 中水楊酸鋼濃度為大于0,但不超過100 μΜ;水楊酸鋼濃度具體例如為大于0并不超過50μΜ、 ΙΟμΜ、20μΜ、30μΜ、40μΜ、60μΜ、70μΜ、80μΜ、90μΜ、ΙΟμΜ~50μΜ、30μΜ~50μΜ、50μΜ~100μΜ等等。
[0007] 所述克雷伯氏菌具體例如為中國普通微生物菌種保藏管理中屯、（北京)保藏編號 為:CGMCC NO. 10357的克雷伯氏菌菌株。
[000引所述產酶培養基，Ww/v表示，配方為:懦米粉0.5%，蛋白腺0.5%，Κ也Κ)4 0.05%， MgS04·7也0 0.01%，pH自然。
[0009] 利用克雷伯氏菌發酵制備普魯蘭酶的過程中，發明人認為，水楊酸鋼能夠抑制克 雷伯氏菌芙膜多糖的合成，因而可W提高發酵液中的普魯蘭酶的酶活。實際檢測結果表明， 在普魯蘭酶產酶培養基中加入適量的水楊酸鋼，顯著提高了所制備的普魯蘭酶的酶活，表 現出了較好的應用效果，因而具有較好地推廣應用前景。
【附圖說明】
[0010] 圖1為產酶培養基中不同水楊酸鋼終濃度的發酵液酶活，其中1、2、3、4、5、6分別 表示水楊酸鋼的終濃度為0μΜ、50μΜ、100μΜ、200μΜ、500μΜ、1000μΜ，ν'表示與對照組有顯著 差異(p<0.05)。
【具體實施方式】
[0011] 下面結合實施例對本發明做進一步的解釋說明。在介紹具體實施例前，對下述實 施例中所設及部分物料情況簡要說明如下。
[0012] 菌株:下述實施例中所用克雷伯氏菌菌株，目前保藏于中國普通微生物菌種保藏 管理中屯、（北京），保藏編號為:CGMCC NO. 10357,該菌株的原始菌株由發明人篩選獲得，因 此發明人保藏有該菌株的備份。
[001引試劑； 水楊酸鋼母液（16.0111^/1111^，即11]1〇1/1):1.601邑水楊酸鋼溶于100毫升滅過菌的蒸 饋水中；使用時根據需要將水楊酸鋼母液稀釋成相應濃度即可； 0.5%普魯蘭糖溶液:稱取0.5g普魯蘭糖加入到100ml蒸饋水中； 3,5-二硝基水楊酸（DNS)試劑：將3.15 g DNS(3,5-二硝基水楊酸，化學純）溶于131 mL、2M化0H熱溶液中（10.48g化0H溶于131mL蒸饋水中），加入250 mL酒石酸鐘鋼熱溶液 (91 g酒石酸鐘鋼溶于250血蒸饋水中），再加2.5血苯酪(固體加熱)和2.5 g Na2S〇3,溶 解后定容到500毫升的棟色瓶中，放置7天后使用。
[0014] 培養基； 斜面培養基采用LB化uria-Bertani)培養基(w/v):膜蛋白腺1%，酵母提取物0.5 %， NaCl 1 %(固體培養基含2.0%瓊脂粉）； 種子培養基(w/v):蛋白腺1.0%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5%，pH 6.0; 產酶培養基(w/v):懦米粉0.5%，蛋白腺0.5%，K此P04 0.05%，MgS04·7出0 0.01%，pH 自然； 上述培養基均采用高壓蒸汽121°C滅菌20min。 實施例
[0015] 本實施例W發酵制備普魯蘭酶的過程為例，對水楊酸鋼在發酵制備普魯蘭酶過程 中的應用效果進行了具體檢驗，相關實驗過程介紹如下。
[0016] 發酵制備普魯蘭酶的過程，具體如下。
[0017] 第一，制備發酵用種子液，具體為:用接種環從保存的斜面培養基上挑取少量保存 的克雷伯氏菌菌株(〔61〇：^.10357)，接種于1001^的種子培養基中；34°(3、220以111111培養 大約16h; 第二，液體發酵產酶，具體為:在250 mL的錐形瓶中置入產酶培養基100 mL，滅菌后，按 8%的體積比例接入第一步驟中所制備的種子液，然后加入適量水楊酸鋼母液;為獲得最適 的水楊酸鋼溶液濃度，發酵產酶時將發酵液分為6組，每組中水楊酸鋼濃度分別為0 μΜ、50 μΜ、100 μΜ、200 μΜ、500 μΜ、1000 μΜ;將各組發酵液置于200 r/min、30°C的搖床中發酵培 養2天，W進行產酶； 第Ξ，提取粗酶液，具體為:收集第二步驟中的發酵液，80(K)r/min、4°C離屯、20 min,取 上清，即為粗酶液。
[0018] 采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法對粗酶液中普魯蘭酶的酶活進行測定，具體的測 定過程為： (1) 繪制葡萄糖標準曲線，具體為： 配制Img/mL的葡萄糖標準液，取8支干凈的試管，分別標記為1、2、3、4、5、6、7、8，依次加 入0.0 1111^、0.11111^、0.15血、0.2血、0.25 1111^、0.3 1111^、0.351111^、0.4 111]^的葡萄糖標準液，然后 用蒸饋水將每支試管定容到3mL，再分別加入1.5 mL的DNS試劑，充分混合后在沸水中煮沸 10 min； 冷卻后在540nm下測吸光值，W1號管為對照； W葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，制作葡萄糖標準曲線； (2) 測定普魯蘭酶活力，具體為： 首先取兩支試管，分別加入所制備的普魯蘭酶粗酶液ImL和ImL的去離子水，將其中的 一只試管置于沸水浴中加熱lOmin，滅酶活作為對照； 然后，在上述兩只試管中分別加入lmL、0.5%的普魯蘭多糖溶液;再后，同時將兩只試管 置于45°C恒溫水浴鍋中保溫30 min; 最后，在每只試管中再分別加入1.5 mL DNS(3,5-二硝基水楊酸)試劑，然后置于沸水 浴中lOmin顯色；顯色后將試管冷卻，540nm波長下進行比色（W滅活酶液對照）； 根據測定的吸光度值查上述所繪制的葡萄糖標準曲線得到反應體系中的葡萄糖含量， 然后代入下述公式計算普魯蘭酶酶活，
[0019] 酶活定義:在45°C條件下，每分鐘產生相當于ΙμL?ο?萄萄糖還原力的酶活定義為1個酶 活單位。
[0020] 對含有不同濃度水楊酸鋼的發酵液中的普魯蘭酶的酶活測定結果如下表所示(表 中數據僅為平均值），同時依據測定數據繪制柱狀圖如圖1所示；
[0021] 從上表數據及圖1可W看出，當產酶培養基中水楊酸濃度不超過100 μΜ時，均能較 為明顯的提高普魯蘭酶的酶活，尤其是當產酶培養基中水楊酸濃度為50 μΜ時，普魯蘭酶的 發酵活力較不采用水楊酸鋼的發酵液中的普魯蘭酶酶活提高159%，表現出了較好地應用效 果。
【主權項】
1. 水楊酸鈉在發酵制備普魯蘭酶過程中的應用，其特征在于，利用克雷伯氏菌發酵制 備普魯蘭酶的過程中，將水楊酸鈉添加于產酶培養基中；產酶培養基中水楊酸鈉濃度大于 〇,但不超過1〇〇 μΜ。2. 如權利要求1所述水楊酸鈉在發酵制備普魯蘭酶過程中的應用，其特征在于，產酶培 養基中水楊酸鈉濃度為50 μΜ。3. 如權利要求1所述水楊酸鈉在發酵制備普魯蘭酶過程中的應用，其特征在于，所述克 雷伯氏菌采用中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏編號為:CGMCC NO. 10357的克雷伯氏 菌菌株。4. 如權利要求1所述水楊酸鈉在發酵制備普魯蘭酶過程中的應用，其特征在于，所述產 酶培養基，以w/v表示，配方為：糯米粉0.5%，蛋白胨0.5%，KH 2P〇4 0.05%，MgS〇4*7H20 0·01%，ρΗ 自然。
【專利摘要】本發明屬于發酵制備普魯蘭酶技術領域，具體涉及水楊酸鈉在發酵制備普魯蘭酶過程中的應用的專利申請。具體為：利用克雷伯氏菌發酵制備普魯蘭酶的過程中，將水楊酸鈉添加于產酶培養基中；產酶培養基中水楊酸鈉濃度大于0，但不超過100？μM。水楊酸鈉能夠抑制克雷伯氏菌莢膜多糖的合成，因而可以提高發酵液中的普魯蘭酶的酶活。實際檢測結果表明，在普魯蘭酶產酶培養基中加入適量的水楊酸鈉，顯著提高了所制備的普魯蘭酶的酶活，表現出了較好的應用效果，因而具有較好地推廣應用前景。
【IPC分類】C12N9/44, C12R1/22
【公開號】CN105543198
【申請號】CN201610039332
【發明人】焦國寶, 許苗苗, 邱立友, 王明道, 孫利鵬, 劉仲敏
【申請人】河南仰韶生化工程有限公司
【公開日】2016年5月4日
【申請日】2016年1月21日