一株基因vii型雞新城疫病毒毒株的分離鑒定和純化方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及動物病毒學領域，本發明提供了一株基因 VII型雞新城疫病毒毒株的 分離鑒定和純化方法及其應用。
【背景技術】
[0002] 新城疫病毒(NDV)隸屬于副粘病毒科中的I型禽副粘病毒，是一組單股負鏈的RNA 病毒。該病毒可導致家禽和野鳥的新城疫，對養禽業造成嚴重的危害。NDV基因組全長 15.化b，編碼6個主要的結構蛋白（3'-NP-P-M-F-HNA-5'）和2個非結構蛋白（V和W)dHN和F 蛋白位于病毒的表面，與病毒的感染性、致病性和抗原性密切相關。F蛋白還被廣泛的用于 NDV的系統進化分類。目前NDV統一的基因型分類系統將該病毒分為2個群（Class),其中 Class I分為2個基因型，多為野鳥中分離的毒株;Class II分為18個基因型。
[0003] 根據致病性和感染宿主后臨床癥狀的差異，可W將NDV分為強毒毒株，中等毒力毒 株和弱毒株。F蛋白裂解位點的氨基酸序列是NDV毒力劃分的分子基礎。若F蛋白裂解位點存 在多堿性氨基酸序列，則可被宿主的泛素樣蛋白酶所裂解，從而促進病毒在宿主體內的復 制和系統性感染。此外，雞胚平均死亡時間(MDT)和1日齡維雞腦內接種指數（ICPI)可用作 NDV對雞致病性的判斷標準。分子流行病學的資料表明，我國雞群和鴨群中流行的NDV強毒 株主要屬于Class II中的基因 νΠ 型，錯群中流行的NDV強毒株主要是Class II中的基因 VI 型，而野鳥中流行的主要是Class巧§毒株。
[0004] 中國W及其他很多國家采用疫苗免疫的方式來防控家禽新城疫。LaSota屬于 Class II中的基因 II型，是目前應用最為廣泛的NDV疫苗株。隨著NDV持續不斷的變異，有報 道表明該疫苗雖然能防止感染NDV后免疫家禽的發病，但是不能抑制排毒:病毒仍然能夠在 感染后數天內通過喉頭/泄殖腔排泄到環境中，從而導致病毒的持續傳播和感染;也有報道 稱在某些基因 νΠ 型NDV強毒株感染后，LaSota免疫的雞群仍然會有發病和死亡。因此，通過 持續的新城疫病毒流行病學研究及時的發現優勢流行毒株，研究其特性，并最終篩選出可 W作為疫苗株的毒株是保證新城疫疫苗效果的最重要方式之一。
【發明內容】
[0005] 本發明的發明人提供了一株基因 νΠ 型（Class II)的雞新城疫病毒株畑icken/ 化ina/SD06/2014,提供了該毒株的分離、鑒定和純化的方法W及該毒株的部分生物學性 質，分析了該毒株的系統進化和蛋白變異情況，W明確其作為新城疫疫苗侯選毒株和HA-HI 實驗抗原的可行性，從而為新城疫病毒的分子進化和流行病學研究提供資料。
[0006] 發明人對該毒株進行了生物保藏，其保藏編號為:CCTCC N0:V201544。
[0007] 該病毒的HN和F相關基因序列如序列表中所示化N核巧酸序列如Seq ID No: 1所 示，其氨基酸序列如Seq ID No:3所示;F基因核巧酸序列如Seq ID No:2所示，其氨基酸序 列如Seq ID No:4所示）。該毒株推導的F蛋白裂解位點的氨基酸序列為RRQKRF，含有多個堿 性氨基酸，因此可判定為一株NDV強毒株。該病毒在系統進化上隸屬于Class II中的基因 VII型。病毒與國內NDV優勢流行株具有相似的的表面蛋白特征，而與LaSota相比，其在F蛋 白功能域的多個區域存在氨基酸的變異，在HN蛋白的跨膜功能域和中和抗原表位也存在氨 基酸突變，因此與LaSo化相比更適合作為疫苗株。
[0008] 針對該病毒遺傳背景，發明人采用的分離及鑒定方法如下：
[0009] 取發病雞（山東省某肉雞養殖場）的內臟器官(肝、脾、腎等)加入適量的滅菌生理 鹽水研磨成勻漿，反復凍融3次，8000轉/分鐘(rpm)離屯、15分鐘，棄去上層脂肪，吸取中間的 液體。加入青霉素和鏈霉素4°C處理1小時后，再次8000轉/分鐘離屯、15分鐘，取上清經尿囊 腔接種11日齡的SPF雞胚，0.2ml/枚，置解化器中培養72小時。每天照胚兩次，棄除24小時內 的污染胚，收取死亡胚的尿囊液。通過血凝試驗檢測尿囊液的HA效價，并據此制備4單位病 毒，用標準的NDV陽性血清W及冊和H9亞型AIV陽性血清進行HI試驗，鑒定病毒為NDV。
[0010] 另外的，發明人提取上述病毒RNA，然后反轉錄為cDNA;分別使用NDV、AIV、雞傳染 性支氣管炎病毒（IBV)和雞傳染性法氏囊病毒（I抓V)的特異性擴增引物進行PCR擴增，結果 僅在使用NDV的特異性引物時出現PCR擴增產物，測序結果表明該產物為NDV的F基因核酸片 段。
[0011] 為了去除尿囊液中可能存在的未知病毒，從而得到盡量純化的病毒，本發明采用 了有限稀釋和隧斑純化相結合的技術方案對該病毒做了進一步純化。最終收獲的含毒尿囊 液再次通過HA-H巧日PCR方法進行鑒定，表明獲得了純化的NDV。通過上述方法得到的純化 毒，可W進行下述的各種操作，W確定其各種性質：
[0012] 1.病毒在雞胚中的生長特性該病毒在雞胚中可高滴度增殖，血凝素效價穩定在210 JjL -6" 〇
[001引2.病毒EIDso的測定將毒株10倍系列稀釋后，各取0.2ml接種1舊齡SPF雞胚。收集 96小時內死亡的雞胚尿囊液，測定HA效價，確定雞胚感染病毒的情況。計算EI化0,確定毒株 對雞胚的毒力。該病毒對雞胚的半數感染量化IDso)為l(T8'u/0.2ml，是一株NDV強毒株。
[0014] 3.病毒的系統進化和表面蛋白分析參考已發表的新城疫病毒基因序列資料，設計 并合成了 NDV的兩個表面蛋白基因片段化N和F)的RT-PCR引物。通過優化RT-PCR反應體系和 循環參數，分別擴增HN和F基因。RT-PCR產物進行膠回收，與祀ASY-T3載體連接，轉化D冊α感 受態細胞。挑取白色菌落擴增后提取質粒，酶切鑒定為陽性者進行雙向測序。
[0015] 其具體的ΗΝ和F相關基因序列如序列表中所示化Ν核巧酸序列如Seq ID No: 1所 示，其氨基酸序列如Seq ID No:3所示;F基因核巧酸序列如Seq ID No:2所示，其氨基酸序 列如Seq ID No:4所示）。據F基因所做的系統進化分析表明，該NDV分離株隸屬于Class II 中的基因 VII型，是目前國內雞群和鴨群中的NDV優勢流行基因型。該毒株推導的F蛋白裂解 位點的氨基酸序列為RRQKRF，含有多個堿性氨基酸，表現出NDV強毒株的分子特征。該病毒 與國內的基因 VII型NDV流行株具有相似的HN和F蛋白特征；而與LaSota相比，其F蛋白功能 域存在廣泛的氨基酸變異，HN蛋白功能域的跨膜區W及HN中和保護抗原位點也有多處氨基 酸的突變。
[0016] 通過該毒株生物學性質的測定可知化icken/化ina/SD06/2014屬于國內雞/鴨群 中NDV的優勢流行株。病毒在雞胚中高滴度增殖，可W作為新城疫疫苗侯選毒株用于滅活疫 苗或基因工程疫苗的研發，可采用現有的疫苗加工方法;也可W用作HA-HI實驗抗原，檢測 待檢血清中是否存在針對新城疫HN抗原的抗體。
[0017]發明人對本發明所公開的基因 VII型（Class II)的雞新城疫病毒株畑icken/ 化ina/SD06/2014進行了生物保藏，具體保藏信息如下：
[001引保藏信息
[0019] 保藏時間：2015年10月20日
[0020] 保藏單位名稱：中國典型培養物保藏中屯、CCTCC [0021 ]保藏編號:CCTCC N0:V201544
[0022] 保藏單位地址：中國武漢武漢大學
[0023] 分類命名：新城疫病毒Chicken/China/SD06/2014(基因 νΠ 型）
【附圖說明】
[0024] 圖1為本發明設及毒株F基因的系統進化樹。
【具體實施方式】 [002引實施例1
[0026] 一株基因 νΠ 型雞源新城疫病毒毒株化icken/化ina/SD06/2014,該病毒的分離和 鑒定方法如下：
[0027] 1.病毒的分離
[0028] 取發病雞的內臟器官(肝、腎、脾等)加入滅菌生理鹽水研磨成勻漿，反復凍融3次， 8000轉/分鐘(rpm)離屯、15分鐘，棄去上層脂肪，吸取中間的液體。加入青霉素和鏈