利用腐敗希瓦氏菌選擇性加氫制備肉桂醇的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種肉桂醇的制備方法，特別涉及一種利用腐敗希瓦氏菌作用將肉桂 醛選擇性加氫制備肉桂醇的方法。 (二)
【背景技術】
[0002] 肉桂醇是一種高附加值的精細有機產品，可以作為香料、藥物、食品及其它化工產 品生產的重要原料和中間體，應用廣泛。例如，肉桂醇是合成抗癌藥物紫杉醇和抗生素綠霉 素必要成分，也是合成許多芳香性化學物的中間體。通常肉桂醇由肉桂醛合成。肉桂醛分子 中存在c=c、c=o和苯環結構，由于c=o的鍵能高于c=c的鍵能，c=c比c=o更容易加氫， 當二者與苯環共輒時，選擇加氫C = 0則更難進行。
[0003] 當前以肉桂醛加氫制備肉桂醇大致可分為三類，分別以氫負離子、H2和醇作為還 原劑，利用化學催化方法制備肉桂醇。存在著還原劑和催化劑昂貴、較難保證高選擇性加 氫、制備繁瑣、制備設備有特殊要求、操作條件苛刻、產物與還原劑、溶劑分離困難、產品后 處理繁瑣、產生大量廢物等最多不利因素。
[0004] 近年來，由于生物催化反應具有更好的選擇性和環境友好性，已被用在越來越多 的化合物合成中去。例如，利用阿魏酸微生物轉化合成天然香蘭素;利用微生物脂肪酶催化 合成多種芳香酯等。目前利用腐敗希瓦氏菌直接生物催化肉桂醛選擇性加氫制成肉桂醇的 研究國內外均未見報道。 (三)
【發明內容】
[0005] 本發明目的是提供一種在腐敗希瓦氏菌作用下，肉桂醛選擇性加氫制備肉桂醇的 方法，從而使肉桂醛簡易快捷高效地選擇性還原成肉桂醇。
[0006] 本發明采用的技術方案是：
[0007] 本發明提供一種利用腐敗希瓦氏菌選擇性加氫制備肉桂醇的方法，所述方法為： 以腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens)經擴大培養的菌懸液為催化劑，以肉桂醛為 底物，以吐溫-80為助劑，在pH值4.5-7.5、20-40°C、100-200rpm條件下進行催化加氫反應， 反應完全后，將反應液分離純化，獲得肉桂醇。
[0008] 進一步，所述腐敗希瓦氏菌優選為腐敗希瓦氏菌CICC22940,購自中國工業微生物 菌種保藏中心，菌種編號:CICC22940,保藏日期2013年10月31日。
[0009] 進一步，所述肉桂醛濃度為0.002-10g/L菌懸液(優選l_6g/L)，所述助劑濃度為5-20g/L(優選 10g/L)。
[0010] 進一步，所述菌懸液中腐敗希瓦氏菌濃度為1 〇8-l〇13CFU/mL。
[0011] 進一步，所述催化劑的制備方法為:將腐敗希瓦氏菌接種至TSB培養基，在30°C下 培養12小時，再以體積濃度0.1-0.5%的接種量(優選0.1 % )轉接到新鮮的TSB培養基中，30 °C培養12h，隨后以體積濃度0.1-0.5%的接種量(優選0.1 % )接種到新鮮TSB培養基中，30 °C培養5h至對數期，然后利用TSB培養基將培養液稀釋制成腐敗希瓦氏菌菌懸液;所述TSB 培養基質量濃度組成為:胰蛋白胨17g/L，大豆蛋白胨3g/L，氯化鈉5g/L，磷酸氫二鉀2.5g/ L，葡萄糖2.5g/L，pH 7.3±0.2,溶劑為水。
[0012] 進一步，本發明利用腐敗希瓦氏菌選擇性加氫制備肉桂醇過程中，所述吐溫-80先 與肉桂醛混合，在100Hz條件下超聲混合15min，制成肉桂醛乳化液，然后再將肉桂醛乳化液 加入腐敗希瓦氏菌經擴大培養的菌懸液中進行加氫反應。
[0013] 本發明所述分離純化方法為:反應完全后將反應液離心，棄沉淀，上清液加入等體 積二氯甲烷，搖床震搖2_3h進行萃取，離心，分出二氯甲烷層，旋轉蒸發后得肉桂醇。
[0014] 與現有技術相比，本發明有益效果主要體現在：
[0015] 本發明所述的利用腐敗希瓦氏菌催化由肉桂醛選擇性加氫制備肉桂醇的方法與 現有技術相比，具有反應條件溫和，成本低廉，選擇性好，轉化率高等優點，肉桂醇的得率在 80%以上。 (四）
【附圖說明】
[0016] 圖1為肉桂醛在腐敗希瓦氏菌作用下定向轉化為肉桂醇反應式。
[0017] 圖2為含207yg/mL肉桂醛的腐敗希瓦氏菌反應液Omin時的總離子流圖（a，肉桂醛； b，肉桂醇）。
[0018] 圖3為含207yg/mL肉桂醛的腐敗希瓦氏菌反應液180min時的總離子流圖（a，肉桂 醛;b，肉桂醇）。 (五)
【具體實施方式】
[0019] 下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于 此：
[0020] 實施例1.乳化肉桂醛加入量不同
[0021] 將2g肉桂醛加入100mL吐溫80溶液（10g/L)中，超聲（100Hz，15min)乳化，制成乳化 肉桂醛。
[0022] 腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens)CICC22940購自中國工業微生物菌種 保藏中心，菌種編號：CICC22940,保藏日期2013年10月31日。將腐敗希瓦氏菌CICC22940接 種至胰蛋白胨大豆肉湯培養基(TSB)，在30°C下培養12小時，再轉接體積濃度0.1 %到新鮮 的TSB培養基中30°C培養12h，隨后接種體積濃度0.1 %到新鮮TSB培養基中，30°C培養5h至 對數期，然后利用TSB培養基將培養液稀釋，獲得菌體濃度為108CFU/mL的腐敗希瓦氏菌菌 懸液100mL，pH值為7。
[0023] 按表1所需濃度，加入不同體積的乳化肉桂醛于腐敗希瓦氏菌菌懸液中，混勻，25 °(3于搖床中，以180rpm速度振蕩培養反應6h后，離心分離，用GC-MS進行定性分析，條件如 下：色譜柱：TG-5，30m X 0.25mm X 0.25μπι;載氣：氮氣，流速：lmL/min;程序升溫：初始溫度 100°C，以20°C/min的速率升溫至130°C，再以5°C/min的速率升溫至170°C，再以50°C/min的 速率升溫至230°C;進樣口溫度;230°C;進樣量：ΙμL。質譜條件：電離方式:EI;傳輸線溫度： 230°C ;電離能量:70eV;掃描質量范圍：40-500m/z;溶劑延遲:3min。用HPLC進行定量分析， 條件如下:流動相：乙腈-水(〇-l〇min內由35 :65線性變化到38:62，在10-1511^11內由38:62線 性變化到50:50);流速：lmL/min;檢測波長：肉桂醛:290nm，肉桂醇：250nm;柱溫:30°C;進樣 量：1〇μ1。
[0024] 反應時間6h，不同加入量肉桂醛下肉桂醛的轉化率和得率見表1。
[0025] 表1不同肉桂醛加入量下肉桂醛的轉化率和得率
[0027]實施例2.腐敗希瓦氏菌催化反應時間不同
[0028] 將2g肉桂醛加入100mL吐溫80溶液（10g/L)中，超聲（100Hz，15min)乳化，制成肉桂 醛乳化液。
[0029] 向pH值為6.8、108CFU/mL腐敗希瓦氏菌菌懸液100mL (制備方法同實施例1)中加入 lmL肉桂醛乳化液，混勾，30°C于搖床中以180rpm速度振蕩培養反應5min-6h(見表2)，離心， 去除腐敗希瓦氏菌沉淀，用GC-MS進行定性分析，測定分析上清夜。GC-MS條件、質譜條件同 實施例1。用HPLC進行定量分析，條件同實施例1。表2給出了不同反應時間下肉桂醛的轉化 率和得率。
[0030] 表2不同反應時間下肉桂醛的轉化率和得率
[0032]備注：肉桂醛加入量為2g/L。
[0033]實施例3.腐敗希瓦氏菌加入量不同
[0034] 將2g肉桂醛加入100mL吐溫80溶液（10g/L)中，超聲（100Hz，15min)乳化，制成肉桂 醛乳化液。
[0035] 分別向pH值為5.5、不同濃度(表3)腐敗希瓦氏菌菌懸液100mL(制備方法同實施例 1)中培養液中加入lmL肉桂醛乳化液，混勻，37°C于搖床中以180rpm速度振蕩培養反應6h 后，離心，去除腐敗希瓦氏菌沉淀，用GC-MS進行定性分析，測定分析上清夜。GC-MS、質譜條 件同實施例1，用HPLC進行定量分析，條件同實施例1。表3給出了不同腐敗希瓦氏菌濃度下 肉桂醛的轉化率和得率。
[0036] 表3不同反應時間下肉桂醛的轉化率和得率
[0037]
[0038] 備注：肉桂醛加入量為2g/L，反應時間6h。
【主權項】
1. 一種利用腐敗希瓦氏菌選擇性加氫制備肉桂醇的方法，其特征在于所述方法為：以 腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens)經擴大培養的菌懸液為催化劑，以肉桂醛為底 物，以吐溫-80為助劑，在pH值4.5-7.5、20-40°C、100-200rpm條件下進行催化加氫反應，反 應完全后，將反應液分離純化，獲得肉桂醇。2. 如權利要求1所述利用腐敗希瓦氏菌選擇性加氫制備肉桂醇的方法，其特征在于所 述腐敗布瓦氏困為腐敗布瓦氏困CICC22940。3. 如權利要求1所述利用腐敗希瓦氏菌選擇性加氫制備肉桂醇的方法，其特征在于所 述肉桂醛濃度為〇.〇〇2-1(^/1菌懸液，所述助劑濃度為5-2(^/1菌懸液。4. 如權利要求1所述利用腐敗希瓦氏菌選擇性加氫制備肉桂醇的方法，其特征在于所 述菌懸液中腐敗希瓦氏菌濃度為108-10 13CFU/mL。5. 如權利要求1所述利用腐敗希瓦氏菌選擇性加氫制備肉桂醇的方法，其特征在于所 述催化劑的制備方法為:將腐敗希瓦氏菌接種至TSB培養基，在30°C下培養12小時，再以體 積濃度0.1-0.5 %的接種量轉接到新鮮的TSB培養基中，30°C培養12h，隨后以體積濃度0. Ιο. 5 % 的接種量接種到新鮮 TSB 培養基中， 30°C 培養 5h 至對數期 ，然后利用 TSB 培養基將培養 液稀釋成腐敗希瓦氏菌菌懸液;所述TSB培養基質量濃度組成為:胰蛋白胨17g/L，大豆蛋白 胨3g/L，氯化鈉5g/L，磷酸氫二鉀2.5g/L，葡萄糖2.5g/L，pH 7.3 ±0.2，溶劑為水。6. 如權利要求1所述利用腐敗希瓦氏菌選擇性加氫制備肉桂醇的方法，其特征在于所 述吐溫-80先與肉桂醛混合，在100Hz條件下超聲混合15min，制成肉桂醛乳化液，然后再將 肉桂醛乳化液加入腐敗希瓦氏菌經擴大培養的菌懸液中進行加氫反應。7. 如權利要求1所述利用腐敗希瓦氏菌選擇性加氫制備肉桂醇的方法，其特征在于所 述分離純化方法為:反應完全后將反應液離心，棄沉淀，上清液加入等體積二氯甲烷，搖床 震搖2-3h進行萃取，離心，分出二氯甲烷層，旋轉蒸發后得肉桂醇。
【專利摘要】本發明公開了一種利用腐敗希瓦氏菌選擇性加氫制備肉桂醇的方法，所述方法為：以腐敗希瓦氏菌(Shewanella？putrefaciens)經擴大培養的菌懸液為催化劑，以肉桂醛為底物，以吐溫-80為助劑，在pH值4.5-7.5、20-40℃、100-200rpm條件下進行催化加氫反應，反應完全后，將反應液分離純化，獲得肉桂醇；本發明所述的利用腐敗希瓦氏菌催化由肉桂醛選擇性加氫制備肉桂醇的方法與現有技術相比，具有反應條件溫和，成本低廉，選擇性好，轉化率高等優點，肉桂醇的得率在80％以上。
【IPC分類】C12P7/22, C12R1/01
【公開號】CN105524950
【申請號】CN201610039007
【發明人】呂飛, 丁玉庭, 魏倩倩, 劉璘
【申請人】浙江工業大學
【公開日】2016年4月27日
【申請日】2016年1月20日