一株廣譜性植物病害生防毛殼菌及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一株毛殼菌，屬于植物保護、植物病害綜合治理中的生物防治領域。
【背景技術】
[0002]生物防治指利用有益生物及其產物來抑制病原物的生存和活動，從而減輕或抑制病害發生發展的植物病害防治技術。相比于化學防治，生物防治具有對人畜安全，不會誘導病原菌產生抗藥性，能對生態環境起到積極長效的調控作用等優點。因此，隨著人們對環境保護意識的增強，大力研發和應用生物農藥以逐步取代化學農藥已經成為現代農業產業化發展的新趨勢。
[0003]生防菌在植物病害生物防治中起著舉足輕重的作用。植物病害防治中使用生防菌后所表現出來的良好的防病效果、對生態系統的安全性以及對人類和各種生物的無毒害等優點已得到人們的認可。因此，從自然界尋找有益微生物對植物病害進行可持續控制和無公害治理已成為一個十分活躍并顯示良好應用前景的領域。
[0004]應用于植物病害生物防治的生防菌主要利用微生物之間的拮抗作用、競爭作用、重寄生作用、交叉保護作用等來減輕病害的發生。目前，生產上開發應用的生防菌涉及真菌、細菌、放線菌、病毒等。真菌中應用廣泛的有木霉菌、酵母菌、淡紫擬青霉菌及菌根真菌等;生防細菌主要有芽胞桿菌、假單胞桿菌、放射性土壤農桿菌等。其中，土壤桿菌、枯草芽孢桿菌都已廣泛應用;放線菌中應用最多的是鏈霉菌及其變種，如井崗霉素、農抗120等;病毒主要是利用弱毒株系的交叉保護作用進行病毒病的防治。
[0005]毛殼菌屬于子囊菌門、核菌綱、糞殼目、毛殼菌科、毛殼屬的真菌，曾先后發現于動植物體、土壤、塵粒及一些動物的糞便中。近年來的研究發現毛殼菌是類極具生防潛力的真菌類群，其生防作用以球毛殼菌的研究較多，已報道球毛殼菌對蘋果黑星病菌、辣椒炭疽病菌、立枯絲核菌、小麥銹病菌、水稻稻瘟病菌等均具有較強的抑制作用。毛殼菌對植物病原菌的抑制作用以營養競爭和產生抑菌物質為主要作用途徑，其中以抑菌物質研究最多，目前以發現的毛殼菌產生的抑菌物質主要有chaetoglobosin、chaetoglobosin、chaetocin和chaetoaurin^o
[0006]目前，用于植物病害生物防治的生防菌研究報道較多，生防菌也篩選、保存有一定的數量，但實際生產中，能夠推廣應用的生防菌卻較少。究其原因，除了生防菌的微生物活性成分在生產、保存和施用過程中易受環境因子的影響外，目前報道的生防菌大多只作用于某種或者某一類植物病害，抑菌譜窄，且對已分離篩選的生防菌的主要生物學特性及主要抗耐性研究滯后。
【發明內容】
[0007]本發明所要解決的技術問題是:提供一株具有廣譜性抑菌作用的植物病害生防菌株，闡明其主要生物學特性及抗耐性，并提供其在生產中的應用方案。
[0008]本發明提供的生防菌株LB-1是從龍柏鱗葉小枝中分離、篩選而來的，通過形態學觀察及ITS序列分析，鑒定其為毛殼屬(Chaetomium spp)真菌中的近緣毛殼(Chaetomiumsubaffine)，于2015年10月19日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏登記號為CGMCCN0.11400。保藏地址是:北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所。
[0009]本發明提供的生防近緣毛殼菌可以用于植物病害(尤其是頑固性土傳病害)的生物防治。
[0010]本發明的有益效果:本發明的生防菌株LB-1對生產中常見的頑固性土傳植物病原菌(如尖孢鐮刀菌、小麥根腐病菌)及常見植物葉部病害的病原菌(如番茄灰霉病菌、玉米大斑病菌、水稻紋枯病菌、致病性交鏈孢菌等)均具有良好抑制作用，對于有效解決農業生產中根部病害導致的連作障礙及常見葉部病害化學防治導致的農藥殘留等環境污染問題，推動農業產業的優質、無公害發展。
【附圖說明】
[0011]下面結合附圖對本發明的【具體實施方式】作進一步詳細的說明。
[0012]圖1是本發明的生防菌株形態特征。
[0013]圖2是本發明菌株的ITS序列分析的系統進化樹。
[0014]圖3是本發明菌株對致病性尖孢鐮刀菌和交鏈孢菌的抑制效果。
[0015]圖4是本發明菌株發酵液對致病性尖孢鐮刀菌和交鏈孢菌的抑制效果。
【具體實施方式】
[0016]實施例1菌株的篩選
采用組織分離法，從龍柏鱗葉小枝中分離、篩選該生防菌株。首先用自來水去除健康龍柏鱗葉小枝上的塵污，75%乙醇、0.1%升汞依次消毒處理后無菌水沖洗5遍。切取2-3 mm長的消毒龍柏鱗葉小枝組織，于25°C、12 h光照條件下在PDA平板上培養，獲得的優勢菌株再次在PDA平板上純化，觀察并記錄菌落形態特征。
[0017]菌種鑒定:①形態觀察:用1%的葡萄糖溶液將分離純化的菌落制成菌懸液臨時裝片，借助于數碼顯微鏡觀察病原菌的形態特征；②ITS序列分析:CTAB法提取菌種基因組DNA，真菌通用弓丨物 ITSl ( 5 ’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 ’)和ITS4 ( 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ’)對提取的DNA進行PCR擴增。擴增產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測、TaKaRa瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收、測序。測序結果與GenBank數據庫中已登錄真菌的rDNA-1TS序列進行同源性比較，MEGA 4.0軟件中的鄰接法構建系統發育樹。
[0018]結果見圖1-2。
[0019]生物學特性測定:采用菌餅接種TOA平板，十字交叉法測定菌落直徑以評判菌種生長狀況的方法，測定本發明的生防菌株的溫度、PH、最佳碳、氮源及其對紫外線、水分脅迫及鹽脅迫的耐受性等主要生物學特性。
[0020]生物學特性分析結果表明，該發明的生防菌株LB-1生長的溫度范圍為4_38°C，最適溫度為25-30°C，致死溫度為65°C;pH值范圍為4-13，在pH7-10的范圍內均能很好生長;黑暗和自然光照對病菌的生長沒有明顯影響，但持續光照可明顯抑制其菌絲擴展；該菌株可吸收利用多種常見單糖、二糖和多糖及有機和無機氮源，但其生長的最佳碳源為甘露醇和葡萄糖，最佳氮源為尿素。該發明的生防菌株對紫外照射、鹽脅迫、水分脅迫均有很好耐受性，持續紫外照射120分鐘以下，生長基質中NaCl含量在0.75M、生長基質中PEG含量在25%以下對其生長均無明顯影響。
[0021]培養方法:采用傳統的TOA固體培養可獲得大量LB-1菌組織；以葡萄糖或者甘露醇為碳源，在23-25°C的條件下振蕩培養3-4天，即可獲得具有很好抑菌作用的菌體發酵液。
[0022]實施例2菌株的抑菌實驗
(一)本發明菌株對致病性尖孢鐮刀菌和交鏈孢菌的抑制效果實驗。
[0023]采用平板對峙培養法篩選生防菌，并檢測抑菌率:分別接種直徑6_的分離純化的LB-1菌株和指示菌菌餅于PDA培養基兩端的相對位置上，放置于光照培養箱中培養(25°C，8h光照)。設單獨培養的指示菌為對照。3天后，采用十字交叉法測定對照平板中單獨培養的菌落半徑(Re)和對峙培養平板中的趨向半徑(Rp)，根據下列公式計算抑菌率，分析篩選出的生防菌對指示菌的抑制作用(鄧振山等，2009):抑菌率(％)=[ (Rc-Rp)VRc X 100。結果見
圖3.圖中，左邊是尖孢鐮刀菌，右邊是交鏈孢菌。
[0024](二)本發明菌株發酵液對致病性尖孢鐮刀菌和交鏈孢菌的抑制效果實驗。
[0025]發酵液的獲得:將生防菌株LB-1在PDA平板上活化，刮取菌絲，以0.1%的接種量接入液體PDA培養基中，振蕩培養4d(25°C，轉速為120r/min)。培養的發酵液經雙層紗布過濾除去菌絲，濾液lOOOOr/min離心15分鐘，得到的上清液即為發酵液。
[0026]發酵液抑菌作用測定:將發酵液分為兩份，一份經高壓滅菌鍋滅菌，一份未滅菌，然后將兩份發酵液與分別與PDA培養基以1:2的體積比混合，制成含有LB-1發酵液的TOA平板，接種直徑6_的指示菌(交鏈孢菌和尖孢鐮刀菌)菌餅于平板中央，置于光照培養箱中培養3d(25°C，12h光照)。對照為不含發酵液的PDA平板。根據對照和處理TOA平板上指示菌的菌落直徑大小，計算滅菌發酵液的抑菌率。結果見圖4。圖中，左邊是尖孢鐮刀菌，右邊是交鏈孢菌。
[0027]本發明的生防菌株對致病性尖孢鐮刀菌、交鏈孢菌、大麗輪枝菌等均具有很好的抑制作用，其中對尖孢鐮刀菌的最大抑菌率達75.3%，且其培養發酵液可對致病菌的菌絲可起到明顯的溶解作用。同時，由于本發明的生防菌對紫外線、鹽脅迫及水分脅迫具有很好的抗耐性，因此，是一株具有很好環境適應性的優良生防菌株。實際生產應用中可通過根部接種、葉面噴施等方式施用。
【主權項】
1.一株毛殼菌，于2015年10月19日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏登記號為CGMCCN0.11400。2.權利要求1所述毛殼菌在植物病害生物防治上的應用。
【專利摘要】本發明提供了一株廣譜性植物病害生防毛殼菌，是從龍柏鱗葉小枝中分離、篩選而來的，通過形態學觀察及ITS序列分析，鑒定其為毛殼屬（<i>Chaetomium</i>？spp）真菌中的近緣毛殼（<i>C.？subaffine</i>），于2015年10月19日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏登記號為CGMCCNo.11400。本發明提供的毛殼菌可用于植物病害的生物防治。本發明的生防菌株對生產中多種常見的植物病原菌（枯萎病尖孢鐮刀菌、番茄灰霉病菌、根腐病菌）等均具有很好地抑制作用，尤其是對頑固性土傳植物病原菌（大麗輪枝菌和尖孢鐮刀菌）抑制效果顯著，可解決設施種植模式下根部病害導致的連作障礙，推動農業產業的優質、無公害發展。CGMCCNo.1140020151019
【IPC分類】C12N1/14, C12R1/645, A01P3/00
【公開號】CN105524841
【申請號】CN201510751523
【發明人】劉彩云, 常志隆, 闞世紅
【申請人】濰坊學院
【公開日】2016年4月27日
【申請日】2015年11月9日