一種檢測診斷遺傳性心肌病致病基因的dna文庫及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種通過祀向高通量半導體測序技術檢測診斷遺傳性屯、肌病致病基 因的DNA文庫及其應用。具體說是根據遺傳性屯、肌病致病基因，設計能覆蓋上述基因外顯子 及郵鄰區域的超多重PCR引物，并對樣本基因組DNA進行超多重PCR擴增，擴增產物利用高通 量測序技術進行測序，尋找致病突變，明確遺傳性屯、肌病的遺傳學病因，為臨床診斷提供遺 傳學和分子生物學的理論依據，屬于生物醫學領域臨床檢測技術中的基因檢測技術。
【背景技術】
[0002] 遺傳性屯、肌病是一組W屯、肌直接受累為主要特征的疾病，主要包括:肥厚型屯、肌 病、擴張型屯、肌病、致屯、律失常性右室屯、肌病、限制型屯、肌病和左室屯、肌致密化不全屯、肌病 五大類，其病程常伴隨屯、力衰竭和屯、律失常。遺傳性屯、肌病患者最終可能面臨屯、臟移植、巧 死等重大風險，并且可能將疾病遺傳給下一代，給家庭和社會帶來巨大的精神壓力和經濟 負擔。遺傳性屯、肌病是遺傳病，其發病是由于基因突變所導致，但是其設及致病基因數量 多，同一種疾病致病基因不同造成的預后差別懸殊，基因型與疾病表型之間異質性高，故早 期進行精確診斷，進而選擇恰當治療方案進行個性化治療極為重要。
[0003] 目前，研究發現遺傳性屯、肌病的眾多致病基因中，只要任意一種基因發生功能性 突變，即可引起疾病表型，即：同一種遺傳性屯、肌病可W由多種遺傳因素所導致。并且，不同 基因的突變導致的同一種遺傳性屯、肌病，其嚴重程度和預后有著較大差異。例如:MYBPC3基 因突變導致的僅W屯、肌輕度肥厚為特點的肥厚型屯、肌病患者預后較好，通常不會發生嚴重 屯、律失常或巧死的并發癥，僅需藥物治療或隨訪觀察即可;而PRKAG2基因突變導致的肥厚 型屯、肌病患者多伴發WPW綜合征，有很高的巧死風險，應考慮行ICD植入術。除此之外，同一 患者如果攜帶了一個W上的致病基因突變，其臨床表現和預后與只攜帶單一致病突變的患 者相比會有差異。因此，全面、快速、準確地篩查致病基因是遺傳性屯、肌病精確診斷和個性 化治療的必須前提條件。
[0004] 臨床上現有的遺傳性屯、肌病的常規診斷技術，主要包括影像學檢查和實驗室檢查 兩大類。影像學檢查包括屯、臟彩超、屯、臟CT和屯、臟核磁共振。運些技術可W較為準確地判斷 屯、室壁厚度，屯、腔大小和屯、肌運動情況等客觀指標，粗略判斷患者是否患有遺傳性屯、肌病。 但是，影像學檢查不能精確、特異地區別遺傳性屯、肌病的具體種類，分子亞型，不能對患者 預后做確切判斷，也不能在早期尚未表現出臨床癥狀的情況下對患者進行診斷。實驗室檢 查主要包括傳統生化指標的檢測，如：屯、肌肌巧蛋白、屯、房鋼尿膚等，僅能反映屯、臟損傷，不 能對遺傳性屯、肌病的分類提供幫助。因此，目前僅結合臨床癥狀、影像學及傳統實驗室檢查 有時不能把遺傳性屯、肌病很好區分。對于特殊類型的屯、肌病，如:糖原蓄積病或線粒體屯、肌 病可能需要進行屯、肌活檢來進行確診，患者所受痛苦較大。而使用基因診斷的方法來替代 穿刺活檢進行鑒別診斷則可避免運種痛苦。同時，傳統的基于Sanger測序的基因檢測方法 存在通量低的弊端，一次反應只能檢測一個擴增區域，無法滿足龐大的基因檢測區域和多 樣本檢測時效性的要求。
[000引因此，有必要尋求一種新的檢測遺傳性屯、肌病致病基因突變的方法，提高診斷準 確率，降低成本和勞動強度并提高時效性。
【發明內容】
[0006] 為實現上述目的，本發明提供一種覆蓋肥厚型屯、肌病、擴張型屯、肌病、致屯、律失常 性右室屯、肌病、限制型屯、肌病和左室屯、肌致密化不全屯、肌病五大類遺傳性屯、肌病，包含80 個遺傳性屯、肌病致病相關基因的DNA文庫。運80個基因選擇基于基于國際已報道和公認的 臨床致病基因數據庫(0MIM數據庫、HGMD數據庫、C1 in化r數據庫）W及發明者自己的課題研 究內容。運80個基因上的致病突變既可W單獨致病，也可W聯合致病導致更加嚴重和復雜 的臨床表型，本發明首次做到可W-次性全面的對它們進行測序，是目前已知針對屯、肌病 致病基因覆蓋最全面的一種祀向測序檢測。其中80個基因如下：
[0007]
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[0011] 本發明根據80個遺傳性屯、肌病致病基因，設計能覆蓋上述基因外顯子及郵鄰調控 區域的適用于超多重PCR的引物池，進而對樣本基因組DNA進行超多重PCR擴增，擴增產物利 用高通量半導體測序技術進行測序，尋找致病突變，明確屯、肌病的遺傳學病因，為臨床診斷 提供遺傳學和分子生物學的理論依據。為此，本發明還提供W下技術方案：
[0012] 本發明還提供一種上述DNA文庫在制備診斷試劑盒中的應用，所述試劑盒用于診 斷遺傳性屯、肌病。
[0013] 本發明還提供一種上述DNA文庫在制備診斷裝置中的應用，所述診斷裝置用于診 斷遺傳性屯、肌病。優選的，所述診斷裝置是測序忍片。
[0014] 進一步，所述應用包括下列步驟：
[001引（1)提供受試者樣本的基因組DNA;
[0016] (2)利用上述的DNA文庫從Ion Torrent?高通量測序平臺自動合成覆蓋全部80個 致病基因的擴增引物文庫，對目標區域進行超多重PCR擴增；
[0017] (3)對步驟(2)得到的擴增產物進行酶切；
[001引（4)對步驟(3)得到的酶切產物加 Barcode接頭;優選的，所述Barcode接頭來自于 高通量測序建庫試劑盒；
[0019 ] (5)對步驟(4)得到的連接產物進行純化；
[0020] (6)對步驟(5)得到的純化產物用通用引物進行二次擴增;優選的，該通用引物來 自于高通量測序建庫試劑盒；
[0021] (7)對步驟(6)得到的二次擴增產物進行片段選擇及濃度測定，即建成患者目標區 域擴增文庫；
[0022] (8)對步驟(7)所得到的文庫經過油包水PCR擴增反應后，將待測序目的片段連接 于ISP珠子，得到反應液；
[0023] (9)將步驟(8)得到的包含ISP珠子的反應液點入忍片，上Ion Torrent?高通量測 序進行測序；
[0024] (10)將步驟(9)得到的堿基序列信息進行生物信息學比對處理，得到與疾病相關 的突變位點；
[002引（11)對步驟（10)得到的突變位點進行Sanger測序法驗證。
[0026] 優選的，所述樣本來自受試者的外周血、體液、組織器官樣本。
[0027] 更優選的，所述應用進一步用于指導治療，例如:通過發明者多年臨床觀察研究， 積累大數據得到的經驗W及文獻報道，總結出根據不同致病基因判斷不同臨床預后與選擇 不同治療方法。例如:通過基因檢測鑒別類似臨床表型的的肥厚型屯、肌病患者，惡性預后的 患者，（如:PRKAG2基因突變患者），隨時有巧死風險，應積極考慮ICD植入術等治療;而良性 預后患者，（如:MYBPC3基因突變患者），通常巧死風險較小，進展緩慢，可考慮單純藥物治 療。
[0028] 本發明還提供一種診斷試劑盒，其中，所述試劑盒包括上述包含80個遺傳性屯、肌 病的致病基因的DNA文庫。
[0029] 本發明還提供一種診斷裝置，其中，所述裝置包括上述包含80個遺傳性屯、肌病的 致病基因的DNA文庫。優選的，所述裝置為測序忍片。
[0030] 本發明提供一種使用上述DNA文庫、診斷試劑盒或診斷裝置對患者進行診斷的方 法，所述方法包括下列步驟：
[0031] (1)提供受試者樣本的基因組DNA;
[00創 （2)利用上述的DNA文庫從Ion Torrent?高通量測序平臺自動合成覆蓋全部60個 致病基因的擴增引物文庫，對目標區域進行超多重PCR擴增；
[0033] (3)對步驟(2)得到的擴增產物進行酶切；
[0034] (4)對步驟(3)得到的酶切產物加 Barcode接頭;優選的，所述Barcode接頭來自于 高通量測序建庫試劑盒；
[0035] (5)對步驟(4)得到的連接產物進行純化；
[0036] (6)對步驟(5)得到的純化產物用通用引物進行二次擴增，優選