利用刺糖多孢菌發酵生產多殺菌素的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及微生物發酵領域，具體地說，涉及一種利用刺糖多孢菌發酵生產多殺菌素的方法。
【背景技術】
[0002]多殺菌素，是刺糖多孢菌有氧發酵產生的次級代謝產物，屬于大環內酯類化合物，其商業化產品中有效活性組分為多殺菌素A(85-90% )和多殺菌素D(10-15% )。多殺菌素沒有抑菌活性，卻有很好的殺蟲活性，對鱗翅目和纓翅目害蟲有較廣的殺蟲譜，對雙翅目、鞘翅目和膜翅目中某些大量吞食葉片的害蟲種類有很好的防治作用，在防治鱗翅目害蟲上，多殺菌素是現有殺蟲劑中選擇性最高的化合物之一，其活性與氯氰菊酯相當。多殺菌素具有高殺蟲活性的同時，對非靶標生物則表現出低毒，它對哺乳動物、鳥類和有益昆蟲毒性較低，對水生動物只有輕微的毒性，而且對哺乳動物無致癌、致畸、致突變或神經毒性的作用。多殺菌素在環境中通過多種組合途徑降解，主要為光降解和微生物降解，降解產物為對環境無害的碳、氫、氧、氮等自然組分，且降解周期短，在土壤中多殺菌素光降解的半衰期為9-10天，在水中多殺菌素光降解的半衰期則小于I天，在葉面上多殺菌素光降解的半衰期是1.6-16天。與一般殺蟲劑相比，多殺菌素具有見效快、無副作用、選擇性高、對天敵安全、半衰期短、易降解、不易產生藥物抗性等優點，是理想的高效低毒綠色農藥，是治理抗性害蟲的首選替代農藥新品種。
[0003]目前在我國，多殺菌素還未實現產業化，其中菌株發酵單位低，發酵周期長，成本高，發酵工藝控制復雜，分離純化工藝不成熟都是制約其發展的因素。
[0004]在微生物好氣培養中，由于外力作用(通氣和攪拌)、微生物的代謝及培養基的成分等原因往往會使發酵液產生許多泡沫，但是過多的泡沫會給發酵帶來負面影響，如引起逃液不僅使工藝控制更加復雜還增加了染菌機會，而因泡沫液位變化在罐壁上形成的菌環會讓發酵液中的菌體量減少，從而影響發酵效率。在多殺菌素發酵的過程中同樣需要解決消沫問題。目前消除和控制泡沫主要有機械消沫和消沫劑兩種方法。機械消沫普遍來說效率不高，而且不能消除引起泡沫的根本原因。而市售的化學類消沫劑(聚醚類消泡劑、硅酮類消沫劑、高級醇類消沫劑等)對多殺菌素的發酵影響均較大，此外大量消沫劑的加入也給后續多殺菌素提取工作帶來困難。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提供一種利用刺糖多孢菌發酵生產多殺菌素的方法。
[0006]為了實現本發明目的，本發明首先提供一種刺糖多胞菌發酵培養基，所述發酵培養基中含有如下組分:高溫黃豆餅粉5-30g/L、玉米淀粉20-40g/L、葡萄糖30_50g/L、玉米衆15-20g/L和碳酸|丐4-6g/L,以水配制。
[0007]優選地，所述發酵培養基中還包括棉籽餅粉10_20g/L和/或酵母浸粉l_5g/L和/或豆油4-6g/L。
[0008]本發明還提供一種利用刺糖多孢菌發酵生產多殺菌素的方法，以刺糖多胞菌(Saccharopolyspora spinosa) Z68為發酵菌株，采用權利要求1或2所述的發酵培養基,發酵條件為:26-30°C，轉速150-220rpm，通氣比1:0.3-0.7，罐壓0.03-0.04MPa，溶氧控制在40%以上，發酵周期為168-216hr ;發酵開始后第120hr內，第一次補加豆油和葡萄糖，豆油至終濃度10_30g/L，葡萄糖至終濃度10-40g/L ;發酵開始后第120_192hr內，第二次補加葡萄糖至終濃度10-40g/L。
[0009]優選地，發酵條件為:28°C，轉速200rpm，通氣比1:0.5，罐壓0.03MPa，溶氧控制在40%以上，發酵周期為192hr。
[0010]本發明中涉及的刺糖多胞菌為刺糖多胞菌(Saccharopolyspora spinosa) Z68,該菌已在ZL201110224366.3中公開。
[0011]本發明從刺糖多胞菌發酵培養基的理化性質入手，提供一種多殺菌素產量穩定、起沫少的發酵培養基及補料方法。將發酵培養基中的大豆粉/豆餅粉用高溫黃豆餅粉替代，實驗表明在發酵過程中高溫黃豆餅粉較大豆粉和低溫黃豆餅粉不易起沫，而高溫黃豆餅粉較大豆粉和低溫黃豆餅粉缺少的部分油脂可以在發酵中后期外源加入，此時加入即可以起到消沫的作用又解決了后期碳源不足的問題。
【附圖說明】
[0012]圖1為本發明實施例2中多殺菌素標準品的高效液相色譜圖。
[0013]圖2為本發明實施例2中供試液高效液相色譜圖。
【具體實施方式】
[0014]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。
[0015]實施例1刺糖多胞菌發酵培養基
[0016]本實施例中，刺糖多胞菌發酵培養基的配方為:高溫黃豆餅粉10g/L、玉米淀粉30g/L、葡萄糖30g/L、玉米漿20g/L、棉籽餅粉10g/L、酵母浸粉5g/L、碳酸鈣5g/L和豆油5g/L,以水配制。滅菌前調培養基pH至7.0，121°C，滅菌30min。
[0017]實施例2利用刺糖多孢菌發酵生產多殺菌素的方法
[0018]以刺糖多胞菌(Saccharopolyspora spinosa) Z68為發酵菌株,采用實施例1的發酵培養基，按5-15% (v/v)接種比例向上述發酵培養基中接種刺糖多胞菌種子液，進行發酵培養。發酵條件為:28°C，轉速200rpm，通氣比1:0.5，罐壓0.03MPa，溶氧控制在40%以上，發酵周期為192hr。發酵開始后第96hr，第一次補加豆油至終濃度30g/L，補加葡萄糖至終濃度30g/L，發酵開始后第144hr，第二次補加葡萄糖至終濃度30g/L。
[0019]其中，刺糖多胞菌種子液的制備方法為:挖取Icm2長滿刺糖多孢菌的斜面菌苔，將其轉接入盛有30mL滅菌的種子培養基的種子瓶中，在28°C，環境相對濕度為50-60%，轉速200rpm，旋轉半徑50_的條件下，振蕩培養，48-72小時，得到刺糖多胞菌種子液。
[0020]種子培養基配方:糊精20g/L、葡萄糖10g/L、玉米漿6g/L、豆柏粉3g/L和硫酸鎂2g/L,以水配制。種子培養基的pH值為7.0,121°C，滅菌30min。
[0021]發酵液中多殺菌素含量分析:
[0022]I)取發酵液Iml，加入9ml甲醇溶液，搖勻；
[0023]2)超聲波震蕩20min，靜止lOmin，使固液分層；
[0024]3)取上層有機相，以0.45 μ m有機濾膜進行過濾；
[0025]4)過濾后有機相作為供試液通過高效液相色譜儀進行效價檢測；
[0026]5)高效液相色譜條件:150X4.6mm(id)，5ym，不銹鋼C18反相色譜柱；柱溫35°C，流速1.0mL/min，以甲醇:乙腈:水(體積比為9: 10: I)為流動相進行分離，進樣量20 μ 1，利用紫外檢測器在246nm波長下進行檢測。
[0027]在此色譜條件下多殺菌素標準品高效液相色譜見圖1。供試液高效液相色譜見圖
2。根據保留時間計算各組分峰面積值，通過峰面積計算各組分產量。
[0028]使用本實施例中的培養基配方和補料方法，得到多殺菌素產量為15.6g/L。
[0029]雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
【主權項】
1.刺糖多胞菌發酵培養基，其特征在于，所述發酵培養基中含有如下組分:高溫黃豆餅粉5-30g/L、玉米淀粉20-40g/L、葡萄糖30_50g/L、玉米漿15_20g/L和碳酸鈣4_6g/L，以水配制。2.根據權利要求1所述的發酵培養基，其特征在于，所述發酵培養基中還包括棉籽餅粉10-20g/L和/或酵母浸粉l_5g/L和/或豆油4-6g/L。3.利用刺糖多孢菌發酵生產多殺菌素的方法，其特征在于，以刺糖多胞菌(Saccharopolyspora spinosa) Z68為發酵菌株,采用權利要求2所述的發酵培養基,發酵條件為:26-30°C，轉速150-220rpm，通氣比1:0.3-0.7，罐壓0.03-0.04MPa，溶氧控制在40%以上，發酵周期為168-216hr ;發酵開始后第120hr內，第一次補加豆油和葡萄糖，豆油至終濃度10_30g/L，葡萄糖至終濃度10-40g/L ;發酵開始后第120_192hr內，第二次補加葡萄糖至終濃度10-40g/L。4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，發酵條件為:28°C，轉速200rpm，通氣比1:0.5，罐壓0.03MPa，溶氧控制在40%以上，發酵周期為192hr。
【專利摘要】本發明提供一種利用刺糖多孢菌發酵生產多殺菌素的方法，其是以刺糖多胞菌(Saccharopolyspora？spinosa)Z68為發酵菌株，采用改良的發酵培養基，在26-30℃，轉速150-220rpm，通氣比1:0.3-0.7，罐壓0.03-0.04MPa，溶氧控制在40％以上的條件下進行發酵培養，從發酵液中提取多殺菌素。本發明從刺糖多胞菌發酵培養基的理化性質入手，提供一種多殺菌素產量穩定、起沫少的發酵培養基及補料方法。將發酵培養基中的大豆粉/豆餅粉用高溫黃豆餅粉替代，實驗表明，在發酵過程中高溫黃豆餅粉較大豆粉和低溫黃豆餅粉不易起沫，而高溫黃豆餅粉較大豆粉和低溫黃豆餅粉缺少的部分油脂可以在發酵中后期外源加入，此時加入即可以起到消沫的作用又解決了后期碳源不足的問題。
【IPC分類】C12P19/62, C12R1/645
【公開號】CN105506038
【申請號】CN201410503746
【發明人】王書睿, 周賢龍
【申請人】牡丹江佰佳信生物科技有限公司
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2014年9月26日