一種具有dpp-iv抑制活性的多肽及其在降血糖藥物中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及多肽GPVGXAGPPGK在制備抑制二肽基肽酶一IV(DPP-IV)及降血糖中 的應用。
【背景技術】
[0002] 二膚基膚酶一IV (dipeptidyl peptidase-IV，DPP-IV) (EC3. 4. 14. 5)是一種絲氨 酸蛋白酶，廣泛分布于人體內。DPP-IV通過對多肽的剪切使其失活，從而達到調節生理功能 的作用。DPP-IV優先水解N-末端第二位上具有脯氨酸（Pro)或丙氨酸（Ala)的蛋白質。 其作用底物包括：胰高血糖素樣肽-I (GLP217-36)、抑胃肽（GIP1-42)、神經肽（NPY)、YY肽 (PYY)以及胰多肽家族（PP-family)等。這些物質的共同特點就是N-末端第二位的氨基酸 殘基或者是脯氨酸或者是丙氨酸殘基。DPP-IV通過作用于以上多肽底物而在糖尿病、葡萄 糖耐量、肥胖、食欲調節、高血脂癥、骨質疏松、神經肽新陳代謝和T-細胞激活等相關疾病 中起著重要的作用。因此，體內給予DPP-IV抑制劑可預防相關底物肽的N-末端降解，從而 保障人體機能正常運行。
[0003] DPP-IV將完整的GLP-I和GIP反應切斷N-末端2個氨基酸殘基后，使其失活從而 影響GLP-I和GIP相關的血糖調節等生理反應。體內給予DPP-IV抑制劑可預防GLP-I和 GIP的N-末端降解，使胰島素分泌物增加從而改善葡萄糖耐量。鑒于DPP-IV抑制劑與血糖 代謝的密切關系，DPP-IV抑制劑已成為新型2型糖尿病藥物的研究熱點。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供多肽GPVGXAGPPGK在抑制DPP-IV活性和降血糖中的應用；多 肽GPVGXAGPPGK具有DPP-IV抑制活性及降血糖活性，作為糖尿病、心臟病、心血管病、肥胖 癥、腎病、免疫紊亂等疾病的保健品和藥物先導化合物具有良好的應用前景。
[0005] 為實現上述目的，本發明以所述多肽GPVGXAGPPGK為抑制DPP-IV活性和降血糖的 有效成份。
[0006] 其具有序列表SEQ ID NO : 1中氨基酸序列；多肽GPVGXAGPPGK為DPP-IV抑制劑及 降血糖藥物的活性成份，其中可添加藥物學上可接受的載體或輔料。
[0007] 具有抑制DPP-IV活性和降血糖活性的多肽化合物GPVGXAGPPGK的氨基酸序列為 Gly-Pro-Val-Gly-Hyp-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Lys。單鏈線性結構，分子量為 949. IDa，白色 粉末狀，易溶于水，對DPP-IV活性具有很強的抑制作用，IC5。為83. 45 μ M。
[0008] 多肽GPVGXAGPPGK具備DPP-IV抑制劑所要求的特征=DPP-IV優先水解N-末端第 二位上具有脯氨酸（Pro)或丙氨酸（Ala)的蛋白質或肽，GPVGXAGPPGK的N-末端第二位上 是脯氨酸（Pro)。
[0009] 本發明與現有技術相比，具有如下有益效果：
[0010] 本發明首次從鹿皮中獲得并確定了活性化合物的結構，化合物具有較好的抑制 DPP-IV的活性，因此作為糖尿病、心臟病、心血管病、肥胖癥、腎病、免疫紊亂等疾病的保健 品和藥物先導化合物具有良好的應用前景。
【具體實施方式】
[0011] 實施例1多肽GPVGXAGPPGK的制備
[0012] 100g新鮮的梅花鹿鹿皮，用質量濃度10% NaOH于50°C煮30分鐘進行脫脂處理 后，純水清洗干凈，剪為2~3平方厘米的碎片。鹿皮碎片按照1:80 (原料：緩沖液質量比） 加入0.0 lM醋酸緩沖液，再按1:100(酶：原料）質量比加入胃蛋白酶，于40°C攪拌反應1 小時。將上述反應液的pH用IM NaOH調至7,加入復合酶（胰蛋白酶，堿性蛋白酶，質量混 合比例1:1)進行酶解，加酶量為反應物質量的0. 1%，于40°C攪拌反應1小時，反應結束后 90°C滅活20min。將上述反應液5000rpm離心5min，收集上清，上述酶解產物經制備色譜分 離，色譜柱為C18 (20X250mm，10 μ m)，所用的流動相A為質量濃度0. 1 %甲酸/水溶液，流 動相B為質量濃度0. 1%的甲酸/乙腈溶液，流速為2mL/min，洗脫過程如下：5% B - 35% B(V/V) - 80% B(V/V)。將在280nm下所檢測到的色譜峰分別收集得到不同組分冷凍干燥， 為乳白色粉末狀樣品。
[0013] 所得樣品分別經反相液相色譜-串聯質譜系統（RPLC-MS/MS)分析：將冷凍干燥后 的酶解樣品用體積濃度〇. 1 %甲酸溶液配制為〇. 4 μ g/ μ L，進樣20 μ L進行LTQ線性離子 阱質譜（配置納升級電噴霧源）分析。利用Xcalibur軟件（Thermo)進行系統控制和數據 收集。實驗得到的質譜數據結果分別在honeybee, Brassica campestris L.蛋白質數據庫 (http://www. uniprot. org/)中進行檢索，技術重復3次，數據庫檢索軟件為SEQUEST。獲 得序列為 Gly-Pro-Val-Gly-Hyp-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Lys。
[0014] 實施例2多肽GPVGXAGPPGK的DPP-IV抑制活性檢測
[0015] ⑴原理
[0016] 采用以甘氨酰脯氨酸對硝基苯胺（Gly-Pro-PNA)為底物的發色底物 法篩選DPP-IV抑制劑，該方法的檢測原理為在堿性條件下DPP-IV催化底物 Gly-Pro-p-nitroanilide水解，生成黃色的對硝基苯胺，后者在波長405nm處有特征性吸 收峰，通過酶標儀在405nm處測得的吸光度大小反映酶活性高低。
[0017] ⑵方法
[0018] 樣品：將樣品溶解于IOOmM的Tris-HCl緩沖液（pH = 8. 0)，配成40mg/mL儲備液， 再將儲備液稀釋成不同的濃度，作為樣品溶液。
[0019] 底物：Gly-pr〇-p-nitroanilide 溶液，用 IOOmM 的 Tris-HCl 緩沖液（pH = 8. 0)將 Gly-pr〇-p-nitroanilide 配置成 L 59mM 的 Gly-pr〇-p-nitroanilide 溶液。
[0020] 酶：DPP-IV 溶液，用 IOOmM 的 Tris-HCl 緩沖液（pH = 8. 0)配置成 0· OlU/mL 的 DPP-IV 溶液。
[0021 ] 終止溶液：IM的醋酸一醋酸鈉緩沖液（pH = 4. 0)。
[0022] 實驗在96孔板中進行，利用酶標儀在405nm檢測吸光度。首先將酶、緩沖液及藥物 在37°C溫度下分別水浴30min，然后將樣品（或緩沖液）、底物依次加入96孔板內37°C孵育 10分鐘，再加入DPP-IV酶溶液，混勻后于37°C溫育60分鐘，加入100 μ L IM的醋酸-醋酸 鈉緩沖液（pH 4. 0)使反應終止。用酶標儀測定405nm吸光度（OD)。反應總體積為100 μ 1。 實驗分為4組，每組設3個復孔。各組分別為：
[0023] 樣品組（S組）：樣品+酶+底物。
[0024] 樣品空白組（SB組）：樣品+底物。
[0025] 陰性對照組（C組）：酶+底物。
[0026] 空白組（B組）：底物。
[0027] 具體各組加樣品見表1。
[0028] 表1DPP-VI抑制活性實驗分組及加樣量
[0029]
[0030] 注：（1)表中數字的單位均為μ 1。
[0031] (2)反應總體積為100 μ 1，各組按照表中所列加入反應物后用緩沖液將最終體積 補至100 μ 1。
[0032] (3)抑制率的計算
[0034] (4)檢測結果
[0035] 分別用 12. 5 μ g/ml, 25 μ g/ml，50 μ g/ml，100 μ g/ml，250 μ g/ml，500 μ g/ml 的多 肽濃度，按上述方法進行DPP-IV抑制活性檢測。結果如下表：
[0038] 經IC5。計算器計算該序列的IC5。為79. 20 μ g/mL，即83. 45 μ M。
【主權項】
1. 具有DPP-IV抑制活性的多肽，其特征在于：所述多肽為GPVGXAGPPGK，具有序列表 SEQ ID NO :1中氨基酸序列；該多肽的氨基酸序列具體為，Gly-Pro-Val-Gly-Hyp-Ala-Gly -Pr〇-Pro_Gly-Lys 〇2. -種權利要求1所述多肽在制備DPP-IV抑制劑或降血糖藥物中的應用。3. 按照權利要求2所述的應用，其特征在于：所述DPP-IV抑制劑及降血糖藥物是以多 肽GPVGXAGPPGK為活性成份，其中可添加藥物學上可接受的載體或輔料。4. 按照權利要求2所述的應用，其特征在于：所述多肽在制備預防和/或治療糖尿病、 心臟病、心血管病、肥胖癥、腎病、免疫紊亂中的一種或二種以上疾病藥物和/或保健品中 的應用。
【專利摘要】本發明涉及一種具有DPP-IV抑制活性的多肽化合物GPVGXAGPPGK，其氨基酸序列為Gly-Pro-Val-Gly-Hyp-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Lys。多肽GPVGXAGPPGK具有DPP-IV抑制活性及降血糖活性，作為糖尿病、心臟病、心血管病、肥胖癥、腎病、免疫紊亂等疾病的保健品和藥物先導化合物具有良好的應用前景。
【IPC分類】A61P3/04, A61K38/08, C07K7/06, A61P13/12, A61P37/02, A61P9/00, A61P3/10
【公開號】CN105504011
【申請號】CN201410498388
【發明人】鄒漢法, 靳艷, 晏嘉澤
【申請人】中國科學院大連化學物理研究所
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2014年9月24日