一種硫酸化多糖的抗腫瘤作用
【技術領域】
[0001 ]本發明涉及醫藥技術領域。特別是硫酸化多糖的醫藥新用途。
【背景技術】
[0002]癌癥，亦稱惡性腫瘤，為由控制細胞增殖機制失常所引起的疾病。伴隨著環境的惡化等，癌癥已經成為危害人類健康的嚴重疾病之一，攻克癌癥一直是世界矚目的研究課題。細胞增殖與凋亡的非平衡匹配及其轉移擴散是惡性腫瘤發生的基礎。細胞凋亡的干預即細胞增殖與凋亡的調控是腫瘤疾病治療的重要途徑和手段。在正常生理狀態下，適時、適度的細胞凋亡調控對生物體清除衰老和具有潛在危險的細胞，維持基因組的穩定性和正常個體的發育是非常重要的，在腫瘤存在的情況下誘導腫瘤細胞凋亡可達到腫瘤治療的目的。
[0003]多糖(Polysaccharide)又稱多聚糖，分布于高等動物植物的細胞膜或微生物細胞壁中，是一類由醛糖或酮糖通過糖昔鍵連接而成的天然高分子多聚物，是自然界含量最豐富的生物多聚物，是構成生命活動四大基本物質之一，不僅為生物提供了骨架結構和能量來源，還廣泛地參與了細胞的各種生命現象及生理過程的調節。隨著分子生物學、免疫物質的化學研究與發展以及新藥物資源的尋找與開發，多糖的研究越來越廣泛的受到重視。可以通過化學、物理學及生物學等方法對多糖進行結構改造，使多糖的生物學活性明顯增加，許多研究表明將多糖進行硫酸化修飾能提高多糖的抗腫瘤活性和免疫調節活性。
[0004]Escherichia coli K5細菌發酵所得多糖，其結構為葡糖醛酸與乙酰氨基葡糖通過I，4糖苷鍵鏈接的重復二糖結構。本發明采用三位硫酸基轉移酶(3-0ST-1)和芳基硫酸基轉移酶(AST-1V)對該多糖二糖結構中乙酰氨基葡糖的3位硫酸化生物修飾，通過反應條件控制，以期獲得系列高活性的多糖修飾產物。
【發明內容】
[0005]本本發明的目的在于提供硫酸化多糖的新用途。
[0006]具體地，本發明提供了硫酸化多糖在制備抗腫瘤藥品中的作用。
[0007]其中，Escherichia coli K5細菌發酵分離純化得到純度較高結構單一的莢膜多糖，多糖的結構為葡萄糖醛酸(GlcUA)和乙酰氨基葡萄(GlcNAc)按摩爾比1:1交替連接，其結構式為[-GlcUA-1Hl，4)-GlCNAC-a-(l，4)-]n，經核磁內標法和HPGPC法測得多糖的含量為95.27%與分子量大小約為10?20 kDa，n約為240?480。
[0008]所述硫酸化多糖，為細菌莢膜多糖經三位硫酸基轉移酶(3-0ST-1)和芳基硫酸基轉移酶(AST-1V)酶法修飾而得產物，所得產物是將多糖二糖結構中葡萄糖胺3位硫酸化后的硫酸化多糖。
[0009]本發明【具體實施方式】中測定表明，產物中硫酸化多糖含量為94±2%w/w，該硫酸化產物純度較高，用此純度下的硫酸化產物進行生物活性實驗，其結果能夠真實的反映出硫酸化多糖的生物活性，有效地避免了其他成分對硫酸化多糖活性測定的干擾。
[0010]細菌莢膜多糖去乙酰化的方法為:10mg heparosan溶解于25mL，2moVL的NaOH，置于60°C水浴中反應5h。反應結束后，樣品冷卻至室溫，用HCl調pH至7.0。用3500Da透析袋，純水透析，凍干。
[0011]進一步地，細菌莢膜多糖去乙酰化后，去乙酰化多糖濃度lmg/L;底物40ymol/LPAP和lmmol/L PNPS，3_0ST_1為0.88U/L，AST_IV為1.688UU/L，pH 7.0(50mmol/L MES,1%Triton，lmmol/L MgCh，Immol/LMnCh緩沖液)；溫度30°C;時間24h。
[0012]進一步地，反應結束后，將溶液加熱至100°C，保溫1min，而后離心(4000rpm)去除酶蛋白，將上清液放入透析袋(截留分子量為3.5kDa)內透析(4°C，24h)，透析結束后將樣品離心(4000rpm)，取上清液冷凍干燥，即可獲得白色粉末狀硫酸化多糖修飾產物。
[0013]MTT實驗證明，硫酸化多糖對處于對數生長期的三種細胞人肝癌細胞(Hepg2)、結腸癌細胞(HCT116)和肺癌細胞(A549)的增殖和生長都具有較強的抑制作用，對正常細胞人肝細胞L02生長無不良影響，為研究硫酸化多糖衍生物抗癌新藥提供了基礎。
【附圖說明】
[0014]圖1 Escherichia coli K5細菌發酵所得多糖1H-NMR圖譜
[0015]圖2 Escherichia coli K5細菌發酵所得多糖HPGPC圖譜
[0016]圖3硫酸化多糖1H-NMR圖譜
【具體實施方式】
[0017]下面的實施例將對本發明做進一步的解釋，但是本發明并不僅僅局限于這些實施例，這些實施例不以任何方式限制本發明的范圍。本領域的技術人員在權利要求的范圍內所做出的某些改變和調整也應該認為屬于本發明范圍
[0018]實施例1
[0019]將細菌莢膜多糖去乙酰化，方法為取10mg多糖溶解于25mL，2mol/L的NaOH，置于60°C水浴中反應5h。反應結束后，樣品冷卻至室溫，用HCl調pH至7.0。用3500Da透析袋，純水透析，凍干。
[0020]實施例2
[0021]采用三位硫酸基轉移酶(3-0ST-1)和芳基硫酸基轉移酶(AST-1V))修飾法對細菌莢膜多糖進行生物修飾(即酶法可控修飾)，細菌莢膜多糖去乙酰化后，去乙酰化多糖濃度111^/1;底物4(^11101/1^^?和111111101/1^肥5，3-0ST-1 為0.88U/L，AST-1V為 I.688UU/L，pH 7.0(50mmol/LMES, I %Triton，lmmol/LMgCl〗，lmmol/L MnCh緩沖液)；溫度30°C ；時間24h。
[0022]實施例3
[0023]去除酶蛋白:將溶液加熱至100°C，保溫lOmin，而后離心(4000rpm)去除酶蛋白，將上清液放入透析袋(截留分子量為3.5kDa)內透析(4°C，24h)，透析結束后將樣品離心(4000rpm)，取上清液冷凍干燥，即可獲得白色粉末狀3位硫酸化多糖修飾產物。
[0024]實施例4
[0025]硫酸化多糖的抗腫瘤活性:
[0026]采用MTT法檢測硫酸化多糖產物對人肝癌細胞(Hepg2)、結腸癌細胞(HCT116)和肺癌細胞(A549)的抗腫瘤活性。設置藥物濃度梯度為200、100、80、40、20、10、5、0mg/ml，用RPM1-1640+10%FBS培養基或DMEM高糖培養基培養，取生長對數期細胞消化鋪板，細胞數目按6000個/孔鋪板，180yL/孔，于37°C、5 % C02培養箱中培養。待細胞貼壁后，加入不同濃度的硫酸化多糖及陽性藥物紫杉醇20μ!7孔，每個濃度均設三個平行孔，給藥孵育培養48h后，每孔加入ΜΤΤ20μ1，繼續培養4h。酶標儀上檢測OD57q以藥物濃度為橫軸，抑制率為縱軸，做折線圖，通過SPSS軟件算得藥物對不同細胞的半數抑制率IC5O值。
[0027]結果表明硫酸化多糖產物具有良好的抗腫瘤活性，其對人肝癌細胞(Hepg2)、結腸癌細胞(HCT116)和肺癌細胞(A549)的增殖和生長均有明顯的抑制關系，其對應的IC50值分別是53.456yg/ml、33.328yg/ml和22.344yg/ml，對正常細胞人肝細胞L02生長無不良影響。
【主權項】
1.本發明采用Escherichiacoli K5細菌發酵分離純化得到純度較高結構單一的莢膜多糖，多糖的結構為葡萄糖醛酸(GlcUA)和乙酰氨基葡萄(GlcNAc)按摩爾比1:1交替連接，其結構式為[-GlcUA-β-(1,4)-GlcNAc-α-(I，4)-]n，經核磁內標法和HPGPC法測得多糖的含量為95.27%與分子量大小約為10?20kDa，n約為240?480。2.根據權利要求1所述的多糖，將其去乙酰化的方法為:10mgheparosan溶解于25mL，2mol/L的NaOH，置于60°C水浴中反應5h。反應結束后，樣品冷卻至室溫，用HCl調pH至7.0。用3500Da透析袋，純水透析，凍干。3.根據權利要求2所述的凍干產物，采用三位硫酸基轉移酶(3-0ST-1)和芳基硫酸基轉移酶(AST-1V)對其進行硫酸化生物修飾(即酶法可控修飾)ο硫酸化修飾后經分離純化，得到3位硫酸化多糖產物，其含量為94 % ± 2 % w/w。。4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于硫酸化轉移酶的作用條件:多糖去乙酰化后，去乙酰化多糖濃度lmg/L ；底物40μπιοI/L PAP和 ImmoI/L PNPS，3-0ST-1為0.88U/L，AST-1V為 1.688UU/L，pH 7.0(50mmol/L MES，I %Triton，lmmol/L MgCl2，lmmol/L MnCl2緩沖液)；溫度30°C;時間24h。5.根據權利要求3所述的3位硫酸化多糖產物，其特征在于采用MTT法檢側其對人肝癌細胞(Hepg2)、結腸癌細胞(HCT116)和肺癌細胞(A549)的生長均表現出明顯的抑制作用，其相應的IC50值為，對正常細胞人肝細胞L02生長無不良影響。
【專利摘要】本發明提供了一種硫酸化多糖在抗腫瘤藥物中的用途。本發明采用三位硫酸基轉移酶(3-OST-1)和芳基硫酸基轉移酶(AST-IV)對Escherichia？coli？K5細菌發酵所得多糖(其分子量約為10～20kDa)進行硫酸化生物修飾(即酶法可控修飾)。硫酸化修飾后經分離純化，得到硫酸化多糖產物。本發明中的硫酸化多糖對多種腫瘤細胞的增殖和生長都具有較強的抑制作用，如人肝癌細胞(Hepg2)、結腸癌細胞(HCT116)和肺癌細胞(A549)，且對正常細胞肝細胞LO2無不良影響，可用于抗癌藥物的開發。
【IPC分類】A61P35/00, C08B37/00, C12P19/26, A61K31/737
【公開號】CN105483187
【申請號】CN201510916155
【發明人】王瑩, 杜婷, 楊軼偉, 魏偉坤, 黃鳳杰, 樂龍, 尹鴻萍
【申請人】中國藥科大學
【公開日】2016年4月13日
【申請日】2015年12月9日