一種禾谷鐮刀菌脫氧雪腐鐮刀菌烯醇合成的誘導物及方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種真菌毒素合成的誘導物及方法，具體涉及一種禾谷鐮刀菌脫氧雪腐鐮刀菌烯醇合成的誘導物及方法。
【背景技術】
[0002]禾谷鐮刀菌是引起小麥赤霉病(Fusarium head blight or scab)的病原真菌，不僅嚴重影響作物產量，而且可以產生多種對人畜有害的真菌毒素脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)，使糧食或飼料的品質降低。脫氧雪腐鐮刀菌稀醇(deoxynivalenol，D0N)是一種倍半萜烯化合物，不易降解、穩定性高，被認為是主要由鐮刀菌在缺乏營養物質時，合成并作為主要天然毒素存在于赤霉病發病小麥中。DON毒素是污染率最高的真菌毒素之一，主要污染小麥、玉米等谷類作物，也污染糧食制品，如面包、餅干、麥制點心等；另外，在動物的奶、蛋中也有DON殘留的報道。該毒素可抑制真核生物細胞蛋白質合成，破壞人和動物的免疫系統，可隨食品、飼料進入食物鏈，嚴重威脅人畜健康。
[0003]我國是世界上受DON危害最嚴重的國家之一。因此，對谷物類制品中DON毒素的篩查及危害評估勢在必行，對DON毒素形成機理的研究也同樣需要大規模、大范圍的開展起來。事實上，我國檢驗檢疫部門一直十分重視這種毒素的檢測監控研究，相關的科學研究也一直是赤霉病科研工作者的工作重點。然而，這些工作由于需要用到大量的DON毒素標準品，這些毒素標準品的價格又非常昂貴(lmg價格約為1000元人民幣)，而且多是從國外出口，由此這些因素嚴重限制了相關工作的開展。由于真菌毒素涉及食品安全、環保、醫療等領域，需求廣泛。因此，相關標準物制備已成為世界上各國研究的熱點。
[0004]我國在真菌毒素標準物質制備方面的工作起步較晚，當前，合成真菌毒素標準品主要利用化學合成的方法，通過菌株培養、發酵、提取、純化等制備工藝獲得，雖然經歷了不斷的優化和工藝的完善，提取效率相對上世紀已有明顯提高，但是真菌毒素得率仍相當有限，且純化成本高昂。因此，若篩選出一種較為低廉的化學物質刺激毒素的合成，必然是一條可行的途徑。
【發明內容】
[0005]本發明所要解決的技術問題是，提供一種可提高產毒量及縮短毒素合成周期的禾谷鐮刀菌脫氧雪腐鐮刀菌烯醇合成的誘導物及方法，以達到在工業生產中利用少量原材料菌絲大量合成脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，同時縮短周期提高產量的目的。
[0006]本發明解決其技術問題采用的技術方案，一種禾谷鐮刀菌脫氧雪腐鐮刀菌烯醇合成的誘導物，為,57 -環單磷酸、,57 -環單磷酸鈉鹽或8?12mg/ml的咖啡因。
[0007]進一步，所述誘導物為4mM的腺苷-3' ,57 -環單磷酸、4mM的腺苷-3' ,57 -環單磷酸鈉鹽或10mg/ml的咖啡因。
[0008]進一步，所述誘導物為10mg/ml的咖啡因，。
[0009]本發明進一步解決其技術問題采用的技術方案，一種禾谷鐮刀菌脫氧雪腐鐮刀菌烯醇合成的方法，包括以下步驟:
[0010](3)產孢培養:將CMC液體培養基中培養4?6天的禾谷鐮刀菌孢子，轉入到液體產毒培養基至終濃度0.8?1.2 X 104個孢子/毫升(優選終濃度為1 X 104個孢子/毫升)；
[0011 ] (4)誘導合成:加入濃度2mM?4mM的腺苷-3' ,57 -環單磷酸、2mM?4mM的腺苷-3'，57 -環單磷酸鈉鹽或8?12mg/ml的咖啡因，黑暗靜置誘導培養3?7天(優選誘導時間為5?7天，更優選7天)，即成；
[0012]禾谷鐮刀菌在產毒階段的細胞內的腺苷-3'，5。環單磷酸(cAMP)水平要遠高于在普通菌絲生長階段。因此，本發明采用cAMP、誘導禾谷鐮刀菌脫氧雪腐鐮刀菌烯醇合成，可大大提高產毒量及縮短毒素合成周期。再則利用相對易溶的cAMP鈉鹽作為cAMP的替代物，同樣可以誘導DON的生物合成；尤其篩選到了價格低廉，且相對穩定、高效的咖啡因作為cAMP的替代物誘導物同樣可以誘導DON的合成。
[0013]本發明采用cAMP、cAMP鈉鹽或咖啡因誘導禾谷鐮刀菌脫氧雪腐鐮刀菌烯醇合成，可大大提高產毒量及縮短毒素合成周期。尤其，cAMP的替代物咖啡因是廉價、高效、相對穩定的毒素合成誘導物。
[0014]實驗證明，4mM濃度的cAMP可以大幅提高禾谷鐮刀菌DON的生物合成，幾乎上調了40倍;4mM cAMP處理禾谷鐮刀菌菌絲5天，合成的毒素量甚至已經達到對照組第7天毒素合成量的5倍以上；10mg/ml的咖啡因產毒量可達170?180ppm。
【附圖說明】
[0015]圖1為本發明中不同濃度cAMP誘導毒素合成的對比。
[0016]圖2為本發明中4mM cAMP處理禾谷鐮刀菌菌絲不同時間的結果對比。
[0017]圖3為本發明中cAMP對毒素合成相關基因的表達量的誘導。
[0018]圖4為本發明中作為cAMP替代物的咖啡因誘導毒素合成的情況。
【具體實施方式】
[0019]下面結合實施例和附圖對本發明作進一步說明。
[0020]實施例1:不同濃度cAMP誘導禾谷鐮刀菌脫氧雪腐鐮刀菌烯醇合成
[0021 ]收集CMC液體培養基中培養5天的禾谷鐮刀菌孢子，加入到液體產毒培養基至終濃度104個孢子/毫升;然后分別加入終濃度lmM，2mM以及4mM的cAMP，黑暗靜置培養7天;最后對培養基中的毒素進行測定。
[0022]液體產毒培養基(1升):30克蔗糖、1克硝酸銨、1克磷酸二氫銨、0.5克七水硫酸鎂、
0.5克氯化鉀、10毫克七水硫酸亞鐵、0.03%植物凝膠以及200微升微量元素混合液，pH值用氫氧化鈉調至6.5。微量元素混合液(100毫升):5g檸檬酸、5克七水硫酸鋅、0.25克五水硫酸銅、50毫克一水硫酸錳、50毫克硼酸、50毫克二水鉬酸鈉)。
[0023]毒素測定利用Beacon公司生產的ELISA試劑盒，具體操作為:先吸取培養基，離心去除菌絲，獲得樣品；然后向試劑盒中配備的反應杯中依次加入酶、樣品、抗體，混合均勻，靜置反應10分鐘，棄反應液;接著用試劑盒中的清洗液，洗反應杯5次;然后加入底物反應5分鐘，最后用終止液終止反應。
[0024]在酶標儀中測0D45()數值并與標樣所作的標準曲線進行對比，算出具體數值，不同濃度cAMP誘導毒素合成實驗結果見圖1。由圖1可知，ImM濃度的cAMP對產毒幾乎沒有誘導作用，2mM濃度的cAMP可以輕微的誘導產毒，而4mM濃度的cAMP可以大幅提高禾谷鐮刀菌DON的生物合成，幾乎上調了 40倍。
[0025]實施例2:cAMP誘導不同時間禾谷鐮刀菌脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的合成
[0026]收集CMC液體培養基中培養5天的禾谷鐮刀菌孢子，加入到液體產毒培養基至終濃度104個孢子/毫升;然后加入終濃度4mM的cAMP，在黑暗靜置分別培養1天、3天、5天和7天，并對培養基中的毒素進行測定，由此對cAMP誘導毒素合成進一步觀察。
[0027]4mM cAMP處理禾谷鐮刀菌菌絲不同時間的實驗結果見圖2，由圖2可知，未經處理的對照組直到培養5天后才開始產毒，而用cAMP處理后的菌絲第3天就可以檢測到一定量的毒素，繼續培養至第5天，cAMP處理組所產的毒素量甚至已經達到對照組第7天毒素合成量的5倍以上，表明采用cAMP處理樣品可以大大縮短毒素合成周期以及提高產毒量，對生產中縮短周期提高產量至關重要。
[0028]實施例3:分析cAMP誘導下的TRI基因的表達模式
[0029]DON的生物合成是由一個基因簇完成的，基因簇中的基因被稱之為TRI基因，因此，為了進一步確認cAMP對DON生物合成的誘導作用，對cAMP誘導下的TRI基因的表達模式進行分析。
[0030]收集液體誘導產毒培養基中培養3天的菌絲(未加cAMP的樣品和加入4mMcAMP的樣品)，液氮研磨后，轉入2毫升的離心管中，然后加入1毫升的Trizol (購自Invitrogen公司)，渦旋混勻后靜置5分鐘，加入200微升的氯仿，混勻靜置2分鐘，離心10分鐘，吸取上清，加入等體積的氯仿，混勻離心5分鐘，吸取上清加入三分之二體積的異丙醇，靜置15分鐘，離心棄上清，用70 %乙醇清洗沉淀一次，晾干，加入一定體積的DEPC水溶解。
[0031 ]利用B1-Rad公司的cDNA試劑盒iScript? cDNA Synthesis Kit進行cDNA的反轉錄，利用iQ SYBR Green Supermix試劑盒進行定量PCR。
[0032]cAMP對毒素合成相關基因的表達量的誘導效果見圖3，由圖3可知，所有TRI基因的表達都明顯上調，有的甚至上調了幾百倍，這表明cAMP可以通過調控毒素合成相關基因的表達來刺激毒素的合成。
[0033]實施例4:cAM的替代物誘導禾谷鐮刀菌脫氧雪腐鐮刀菌烯醇合成。
[0034 ] cAMP對毒素合成具有極為顯著的誘導作用，但是cAMP價格比較昂貴，細胞內的cAMP濃度會受到cAMP磷酸二酯酶的負調控。因此，cAMP磷酸二酯酶抑制劑的添加就可以達到提高cAMP濃度的目的。
[0035]咖啡因是公認的較為廉價的cAMP磷酸二酯酶抑制劑，為了進一步節省成本，采用化學物質咖啡因代替較為昂貴的cAMP，添加了終濃度10mg/ml的咖啡因到產毒培養基中，具體操作同cAMP誘導和產毒方法，cAMP替代物的咖啡因誘導毒素合成的結果見圖4。由圖4可知，禾谷鐮刀菌毒素合成大幅提高，說明咖啡因是一種廉價高效的毒素合成誘導物。
【主權項】
1.一種禾谷鐮刀菌脫氧雪腐鐮刀菌烯醇合成的誘導物，其特征在于，所述誘導物為2mM?,57 -環單磷酸、2mM?4mM的腺苷-3' ,57 -環單磷酸鈉鹽或8?12mg/ml的咖啡因。2.根據權利要求1所述的禾谷鐮刀菌脫氧雪腐鐮刀菌烯醇合成的誘導物，其特征在于，所述誘導物為4mM的腺苷-3' ,57 -環單磷酸、4mM的腺苷-3' ,57 -環單磷酸鈉鹽或10mg/ml的咖啡因。3.根據權利要求2所述的禾谷鐮刀菌脫氧雪腐鐮刀菌烯醇合成的誘導物，其特征在于，所述誘導物為1 Omg/ m 1的咖啡因。4.一種如權利要求1?3之一所述的禾谷鐮刀菌脫氧雪腐鐮刀菌烯醇合成的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)產孢培養:將CMC液體培養基中培養4?6天的禾谷鐮刀菌孢子，轉入到液體產毒培養基至終濃度0.8?1.2 X 104個孢子/毫升； (2)誘導合成:加入濃度Y-環單磷酸、,5,-環單磷酸鈉鹽或8?12mg/ml的咖啡因，黑暗靜置誘導培養3?7天，即成。5.根據權利要求4所述的禾谷鐮刀菌脫氧雪腐鐮刀菌烯醇合成的方法，其特征在于，步驟(1)中，所述禾谷鐮刀菌孢子終濃度為1 X 104個孢子/毫升。6.根據權利要求4或5所述的禾谷鐮刀菌脫氧雪腐鐮刀菌烯醇合成的方法，其特征在于，步驟(2)中，誘導培養時間為5?7天。7.根據權利要求6所述的禾谷鐮刀菌脫氧雪腐鐮刀菌烯醇合成的方法，其特征在于，步驟(2)中，誘導培養時間為7天。
【專利摘要】一種禾谷鐮刀菌脫氧雪腐鐮刀菌烯醇合成的誘導物及方法，所述誘導物為2mM～4mM的腺苷-3′，5′-環單磷酸、2mM～4mM的腺苷-3′，5′-環單磷酸鈉鹽或8～12mg/ml的咖啡因。本發明還包括一種誘導禾谷鐮刀菌脫氧雪腐鐮刀菌烯醇合成的方法。本發明采用cAMP、cAMP鈉鹽或咖啡因誘導禾谷鐮刀菌脫氧雪腐鐮刀菌烯醇合成，可大大提高產毒量及縮短毒素合成周期。
【IPC分類】C12R1/77, C12P17/18
【公開號】CN105483175
【申請號】CN201610041250
【發明人】江聰, 王晨芳, 許金榮, 劉慧泉, 王建華, 項萍, 張強, 尹濤, 唐喆
【申請人】西北農林科技大學
【公開日】2016年4月13日
【申請日】2016年1月21日