一種熒光探針的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于熒光探針技術領域，尤其涉及一種熒光探針的制備方法。
【背景技術】
[0002]殼聚糖為聚(1，4)-2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖，是甲殼素部分脫乙酰化而得到的一種直鏈大分子生物多糖。它是天然多糖中唯一的堿性多糖，具有良好的生物相容性和生物降解性能。其弱酸水溶液具有高粘性，帶正電荷。可與帶負電荷高聚物發生交聯反應而形成微球。殼聚糖鏈中的伯胺基團很容易和生物分子發生反應，諸如:蛋白質、DNA、酶、抗原抗體、生物素以及熒光分子異硫氰酸酯(FITC)等。殼聚糖微球已應用于親和色譜介質及酶的固定化。因此殼聚糖納米微球極有可能成為同時偶聯熒光分子和生物識別分子的良好基質。
【發明內容】
[0003]本發明就是針對上述問題，提供一種制備簡單，良好的生物相容性的熒光探針的制備方法。
[0004]為實現上述目的，本發明包括以下步驟。
[0005]1) 5 g殼聚糖溶解在醋酸溶液中，逐滴加入H202溶液，在水浴中降解；每隔數小時，取溶液，用NaOH溶液沉淀，用去離子水洗至中性，真空干燥備用。
[0006]2)用乙酸、NaCl溶液為溶劑，測定，求出特性粘度數后，計算殼聚糖的粘均Mr。
[0007]3)稱取經不同時間降解的殼聚糖，溶解于醋酸溶液，殼聚糖濃度為0.5% ( m/V);用NaOH調pH = 4.6-4.7 ;取上述殼聚糖的醋酸溶液，逐滴加入TPP溶液，磁力攪拌，得到經TPP交聯的殼聚糖納米粒子懸濁液。
[0008]4)高速離心CS納米粒子，將上層清液倒掉，沖洗微球，備用；將離心后的CS納米粒子分散在醋酸溶液中，殼聚糖的濃度為1 g /L;加入FITC無水二甲基亞砜溶液，殼聚糖納米粒子分散液和FITC無水二甲基亞砜溶液的體積比為3 mL:0.3mL ;用錫箔包住反應試管，避光反應3 h，得到FITC標記的殼聚糖納米熒光探針。
[0009]5)離心，洗滌，用紫外分光光度計在480 nm檢測離心上清液，直至在此波長下無吸收。
[0010]作為一種優選方案，本發明所述步驟1) 5 g殼聚糖溶解在150 mL 3%的醋酸溶液中，逐滴加入50 mL 6% H202溶液，在水浴中降解；每隔數小時，取50mL溶液，用10mol /L的NaOH溶液沉淀，用去離子水洗至中性，真空干燥備用。
[0011]2)用0.1 mo 1/L乙酸0.2 mo 1/LNaCl溶液為溶劑，在25度下測定，求出特性粘度數后，計算殼聚糖的粘均Mr。
[0012]3)稱取經不同時間降解的殼聚糖，溶解于1% ( V /V )的醋酸溶液，殼聚糖濃度為0.5% ( m /V);用10 mo 1/L NaOH調pH = 4.6-4.7 ;取10 mL上述殼聚糖的醋酸溶液，逐滴加入3 mL 0.25% (m/V)TPP溶液，磁力攪拌，得到經TPP交聯的殼聚糖納米粒子懸池液。
[0013]作為另一種優選方案，本發明所述步驟4)以12000 r /m in高速離心CS納米粒子10m in,將上層清液倒掉，沖洗微球，備用；將離心后的CS納米粒子分散在1% ( V /V)醋酸溶液中，殼聚糖的濃度為1 g /L;加入10 g /L的FITC無水二甲基亞砜(DMS0)溶液，殼聚糖納米粒子分散液和FITC無水二甲基亞砜溶液的體積比為3 mL:0.3mL ;用錫箱包住反應試管，避光反應3 h,得到FITC標記的殼聚糖納米突光探針。
[0014]5)離心，洗滌，用紫外分光光度計在480 nm檢測離心上清液，直至在此波長下無吸收。
[0015]本發明有益效果。
[0016]本實驗通過控制低分子量殼聚糖聚陽離子與三聚磷酸鈉陰離子之間的比例制備了粒度均一殼聚糖納米粒子，利用殼聚糖上的氨基在酸性條件下和FITC中的異硫氰酸根(N C S )反應，制得FITC標記的殼聚糖納米粒子。該探針具有制備簡單，良好的生物相容性，粒徑均勻有規則以及對光穩定的優點。此外該粒子表面的殘余氨基可進一步與生物分子偶聯，制備成能識別特定生物分子的納米熒光探針，因而有望用于生物與醫學分析領域。
【具體實施方式】
[0017]本發明包括以下步驟。
[0018]1) 5 g殼聚糖溶解在醋酸溶液中，逐滴加入H202溶液，在水浴中降解；每隔數小時，取溶液，用NaOH溶液沉淀，用去離子水洗至中性，真空干燥備用。
[0019]2)用乙酸、NaCl溶液為溶劑，測定，求出特性粘度數后，計算殼聚糖的粘均Mr。
[0020]3)稱取經不同時間降解的殼聚糖，溶解于醋酸溶液，殼聚糖濃度為0.5% ( m/V);用NaOH調pH = 4.6-4.7 ;取上述殼聚糖的醋酸溶液，逐滴加入TPP溶液，磁力攪拌，得到經TPP交聯的殼聚糖納米粒子懸濁液。
[0021]4)高速離心CS納米粒子，將上層清液倒掉，沖洗微球，備用；將離心后的CS納米粒子分散在醋酸溶液中，殼聚糖的濃度為1 g /L;加入FITC無水二甲基亞砜溶液，殼聚糖納米粒子分散液和FITC無水二甲基亞砜溶液的體積比為3 mL:0.3mL ;用錫箔包住反應試管，避光反應3 h，得到FITC標記的殼聚糖納米熒光探針。
[0022]5)離心，洗滌，用紫外分光光度計在480 nm檢測離心上清液，直至在此波長下無吸收。
[0023]作為一種優選方案，本發明所述步驟1) 5 g殼聚糖溶解在150 mL 3%的醋酸溶液中，逐滴加入50 mL 6% H202溶液，在水浴中降解；每隔數小時，取50mL溶液，用10mol /L的NaOH溶液沉淀，用去離子水洗至中性，真空干燥備用。
[0024]2)用0.1 mo 1/L乙酸0.2 mo 1/LNaCl溶液為溶劑，在25度下測定，求出特性粘度數后，計算殼聚糖的粘均Mr。
[0025]3)稱取經不同時間降解的殼聚糖，溶解于1% ( V /V )的醋酸溶液，殼聚糖濃度為0.5% ( m /V);用10 mo 1/L NaOH調pH = 4.6-4.7 ;取10 mL上述殼聚糖的醋酸溶液，逐滴加入3 mL 0.25% (m/V)TPP溶液，磁力攪拌，得到經TPP交聯的殼聚糖納米粒子懸池液。
[0026]作為另一種優選方案，本發明所述步驟4)以12000 r /m in高速離心CS納米粒子10m in,將上層清液倒掉，沖洗微球，備用；將離心后的CS納米粒子分散在1% ( V /V)醋酸溶液中，殼聚糖的濃度為1 g /L;加入10 g /L的FITC無水二甲基亞砜(DMS0)溶液，殼聚糖納米粒子分散液和FITC無水二甲基亞砜溶液的體積比為3 mL:0.3mL ;用錫箱包住反應試管，避光反應3 h,得到FITC標記的殼聚糖納米突光探針。
[0027]5)離心，洗滌，用紫外分光光度計在480 nm檢測離心上清液，直至在此波長下無吸收。
[0028]分子量越低，殼聚糖經交聯后所得的粒徑越小。因此，為得到納米級粒子，需將高分子量的殼聚糖降解。h202氧化降解法因反應產物無殘毒，易處理而成為殼聚糖降解中的常用方法。反應溫度、反應時間、反應介質和h202濃度是殼聚糖降解的主要影響因素。通常隨著反應溫度升高，反應時間延長和h202濃度的增大，殼聚糖的降解程度增大。實驗表明反應溫度過高，殼聚糖被氧化，副反應較多，降解產物顏色變深；而h202濃度過高會使產物收率下降，所得分子量分布較寬，以此制得的納米粒子粒徑不均勻。此外，在稀酸溶液中殼聚糖分子溶解，分子間與分子內氫鍵斷裂，降解反應是均相反應，因而降解速度快，所得降解產物分子量低。綜合考慮上述因素，實驗采用在弱酸性介質中，H202濃度為1.5%，水浴條件下通過改變反應時間來實現低分子量殼聚糖的制備。
[0029]以上內容是結合具體的優選實施方式對本發明作的進一步詳細說明、不能認定本發明的具體實施只局限于這些說明、對于本發明所屬技術領域的普通技術人員來說、在不脫離本發明構思的前提下、還可以做出若干簡單推演或替換、都應當視為屬于本發明所提交的權利要求書確定的保護范圍。
【主權項】
1.一種熒光探針的制備方法，其特征在于包括以下步驟。 1)殼聚糖溶解在醋酸溶液中，逐滴加入h202溶液，在水浴中降解；每隔數小時，取溶液，用NaOH溶液沉淀，用去離子水洗至中性，真空干燥備用； 2)用乙酸、NaCl溶液為溶劑，測定，求出特性粘度數后，計算殼聚糖的粘均Mr； 3)稱取經不同時間降解的殼聚糖，溶解于醋酸溶液，殼聚糖濃度為0.5% ( m /V)；用NaOH調pH = 4.6-4.7 ;取上述殼聚糖的醋酸溶液，逐滴加入TPP溶液，磁力攪拌，得到經TPP交聯的殼聚糖納米粒子懸濁液； 4)高速離心CS納米粒子，將上層清液倒掉，沖洗微球，備用；將離心后的CS納米粒子分散在醋酸溶液中，殼聚糖的濃度為1 g /L;加入FITC無水二甲基亞砜溶液，殼聚糖納米粒子分散液和FITC無水二甲基亞砜溶液的體積比為3 mL:0.3mL ;用錫箔包住反應試管，避光反應3 h,得到FITC標記的殼聚糖納米熒光探針； 5)離心，洗滌，用紫外分光光度計在480nm檢測離心上清液，直至在此波長下無吸收。2.根據權利要求1所述一種熒光探針的制備方法，其特征在于所述步驟1)5 g殼聚糖溶解在150 mL 3%的醋酸溶液中，逐滴加入50 mL 6% H202溶液，在水浴中降解；每隔數小時，取50mL溶液，用lOmol /L的NaOH溶液沉淀，用去離子水洗至中性，真空干燥備用; 2)用0.1 mo 1/L乙酸0.2 mo 1/LNaCl溶液為溶劑，在25度下測定，求出特性粘度數后，計算殼聚糖的粘均Mr ； 3)稱取經不同時間降解的殼聚糖，溶解于1%( V /V )的醋酸溶液，殼聚糖濃度為0.5% ( m /V);用10 mo 1/L NaOH調pH = 4.6-4.7 ;取10 mL上述殼聚糖的醋酸溶液，逐滴加入3mL0.25% (m/V)TPP溶液，磁力攪拌，得到經TPP交聯的殼聚糖納米粒子懸濁液。3.根據權利要求1所述一種熒光探針的制備方法，其特征在于所述步驟4)以12000r/m in高速離心CS納米粒子10m in,將上層清液倒掉，沖洗微球，備用；將離心后的CS納米粒子分散在1% ( V /V )醋酸溶液中，殼聚糖的濃度為1 g /L;加入10 g /L的FITC無水二甲基亞砜(DMS0)溶液，殼聚糖納米粒子分散液和FITC無水二甲基亞砜溶液的體積比為3 mL:0.3mL ;用錫箔包住反應試管，避光反應3 h，得到FITC標記的殼聚糖納米熒光探針； 5)離心，洗滌，用紫外分光光度計在480 nm檢測離心上清液，直至在此波長下無吸收。
【專利摘要】<b>一種熒光探針的制備方法屬于熒光探針技術領域，尤其涉及一種熒光探針的制備方法。本發明提供一種制備簡單</b><b>,</b><b>良好的生物相容性的熒光探針的制備方法。本發明包括以下步驟。</b><b>1)5g</b><b>殼聚糖溶解在醋酸溶液中</b><b>,</b><b>逐滴加入</b><b>H2O2</b><b>溶液</b><b>,</b><b>在水浴中降解；每隔數小時</b><b>,</b><b>取溶液</b><b>,</b><b>用</b><b>NaOH</b><b>溶液沉淀</b><b>,</b><b>用去離子水洗至中性</b><b>,</b><b>真空干燥備用；</b><b>2</b><b>）用乙酸、</b><b>NaCl</b><b>溶液為溶劑</b><b>,</b><b>測定</b><b>,</b><b>求出特性粘度數后</b><b>,</b><b>計算殼聚糖的粘均</b><b>Mr</b><b>。</b>
【IPC分類】C08J3/24, C08B37/08, C09K11/06, G01N21/64
【公開號】CN105481996
【申請號】CN201410474016
【發明人】徐麗萍
【申請人】徐麗萍
【公開日】2016年4月13日
【申請日】2014年9月17日