硬蜱科蜱蟲coiii基因全長序列的擴增引物及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及分子生物學領域，具體地說，涉及硬蜱科蜱蟲C0III基因全長序列的 擴增引物及其應用。
【背景技術】
[0002] 硬蜱科（Ixodidae)隸屬于節肢動物門（Arthropoda)，蛛形綱（Arachnida)，蜱 目（Ixodida)。目前，全世界已知硬蜱種類超過700種，我國硬蜱記錄有效種分屬于硬蜱屬 (Ixodes)、花蜱屬（Amblyomma)、血蜱屬（Haemaphysalis)、革蜱屬（Dermacentor)、璃眼蜱 屬（Hyalomma)、扇頭蛛屬（Rhipicephalus)以及異扇蛛屬（Anomalohimalaya)7 個屬共 106 種。蜱類在宿主體上吸食血液，對人和家畜危害很大。蜱蟲的叮咬，不僅造成宿主血液損失， 還可引起宿主皮膚出現炎癥、潰瘍等癥狀。更重要的是，硬蜱作為媒介可傳播人、畜疫病，包 括病毒病（森林腦炎、出血熱）、立克次體病（Q熱）、細菌病（布氏桿菌）、螺旋體病（萊姆 病）以及原蟲病（巴貝斯蟲、泰勒蟲）等。蜱蟲的物種鑒定及蜱媒分布調查是蜱媒及蜱傳疫 病防控的重要基礎。傳統蜱蟲物種的分類鑒定主要依據形態學，然而形態學的鑒定需要經 驗豐富的專家，而且形態學對蜱蟲未成熟個體（卵、幼蟲）及蟲體不完整的標本難以鑒定。 分子生物學技術可解決上述難題。
[0003] 利用分子技術對物種進行分類和系統發育分析已成為一種有效的方法。線粒體 C0III基因具有較高的進化速率和種內保守性，是鑒定物種和研究物種間進化關系較為理想 的靶標基因。然而，Genbank數據庫中硬蜱COIII序列較少，且缺少擴增硬蜱科COIII基因的 通用引物，嚴重制約了C0III序列在蜱蟲系統發生及蜱媒流行病學調查研究中的應用。
【發明內容】
[0004] 為了解決現有技術中存在的問題，本發明的目的是提供一種硬蜱科蜱蟲C0III基 因全長序列的擴增引物。
[0005] 為了實現本發明目的，本發明首先提供一種硬蜱科蜱蟲C0III基因全長序列的擴 增引物，其包括：
[0006] C0III-TF:5'-ATGATATTTCATCCTTTTCACTTAGT-3' ；
[0007] C0III-TR:5'-AATAAATTCATCAATATATAAATGTA-3'。
[0008] 本發明還提供一種含有所述引物的用于檢測硬蜱科蜱蟲的試劑盒。
[0009] 進一步地，所述試劑盒還包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg'PCR反應緩沖液中的至 少一種。
[0010] 進一步地，所述試劑盒還包括標準陽性模板。
[0011] 本發明還提供了所述引物或所述試劑盒在檢測硬蜱科蜱蟲中的應用。
[0012] 本發明還提供了硬蜱科蜱蟲的特異性PCR檢測方法，包括以下步驟：
[0013] 1)提取樣品DNA;
[0014] 2)以步驟1)提取的DNA為模板，利用所述的引物C0III-TF和C0III-TR進行PCR 擴增反應；
[0015] 3)分析PCR產物。
[0016] 進一步地，PCR反應體系以50μ1計為：5yL10XPCRbuffer，2yL引物 〇)111-丁？，2以1^引物〇)111-丁1?，2 4 1^(1^138(101111)，4 4 1 2. 5mMMgCl2,1μLTaq酶，蜱蟲 DNA模板基因組2μL(10~20ng)，加滅菌雙蒸水至50μ1。
[0017] 進一步地，PCR反應條件為：PCR擴增程序：94°C預變性5min;94°C變性30S，45°C 退火30S，72°C延伸lmin，共36個循環；72°C延伸7min，4°C保存。
[0018] 本發明的有益效果在于：
[0019] 本發明提供的硬蜱科蜱蟲coin基因的擴增引物，可有效擴增硬蜱科線粒體com 基因全長序列，擴增效率達到98. 5%。
【附圖說明】
[0020] 圖1為用本發明所述引物對11種蜱蟲DNA樣本進行PCR檢測的1%瓊脂糖凝膠電 泳圖；
[0021] 其中：1 :全溝硬蜱Ixodespersuleatus;2 :邊緣革蜱Dermacentormarginatus; 3 :嗜群血蜱Haemaphysalisconcinna;4 :長角血蜱Haemaphysalislongicornis;5 :亞 洲璃眼蜱Hyalommaasiaticum;M:DL2000Marker;6 :日本血蜱Haemaphysalisjaponica; 7:微小扇頭蜱Rhipicephalusmicroplus;8:小亞璃眼蜱Hyalommaanatolicum;9:草原 革蜱Dermacentornuttalli;10 :草原血蜱Haemaphysalisverticalis;11 :殘緣璃眼蜱 Hyalommadetritum。
【具體實施方式】
[0022] 以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
[0023] 實施例1
[0024] 1、數據收集：從Genbank中下載硬蜱科不同蜱蟲物種線粒體COIII基因序列 (NCBI,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
[0025] 2、序列比對：利用MEGA軟件中的ClustalW程序將收集到的硬蜱科蜱蟲COIII序列 進行序列比對，找出較保守、堿基變異度最小的序列片段。
[0026] 3、引物合成：根據上述的比對結果，利用引物設計軟件Primerf在堿基變異度最 小的序列片段設計出1對兼并擴增引物。
[0027] 引物序列為：
[0028] C0III-TF:5'-ATGATATTTCATCCTTTTCACTTAGT-3' ；
[0029] C0III-TR:5' -AATAAATTCATCAATATATAAATGTA-3'。
[0030] 4、引物擴增：將上述引物分別應用于PCR擴增所采集的表1所示的硬蜱科5個屬 11個種265個個體的COIII序列的PCR擴增。
[0031] 表1硬蜱科5個屬11個種
[0032]
[0033] 5、擴增結果檢測：擴增產物用1. 5倍的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測（見圖1)。結果 顯示，該引物可有效擴增硬蜱科線粒體COIII基因序列，共獲得265個硬蜱樣本中的261個 個體的C0III全長序列，擴增效率達到98. 5%。利用此對引物擴增出的DNA片段長度約為 780bp〇
[0034] 針對擴增產物進行測序，獲取了全溝硬蜱Ixodespersuleatus、邊緣革蜱 Dermacentormarginatus、嗜群血蜱Haemaphysalisconcinna、長角血蜱Haemaphysalis longicornis、亞洲璃眼蜱Hyalommaasiaticum、曰本血蜱Haemaphysalisjaponica、 微小扇頭蜱Rhipicephalusmicroplus、小亞璃眼蜱Hyalommaanatolicum、草原革蜱 Dermacentornuttall、草原血蜱Haemaphysalisverticalis和殘緣璃眼蜱Hyalomma detritum共11個種的線粒體COIII基因序列，其具體的核苷酸序列見SEQIDNo. 3-13。
[0035] 特異性擴增引物條件：
[0036] 上述C0III-TF與C0III-TR擴增引物的50yL PCR反應體系為：5yL10XPCR buffer，2 μL引物CO III -TF，2 μL引物CO III -TR，2 μL dNTPs (10mM)，4 μ1 2. 5mM MgCl2， 1 μL Taq酶，蜱蟲DNA模板基因組2 μL (10~20ng)，加滅菌雙蒸水至50 μ1。
[0037]PCR反應條件：預熱 94°C，5min;94°C30s，45°C30s，72°Clmin，共 36 個循環；末次 延伸 72°(：，711^11，4°(：保存。
[0038] 雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在 本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
【主權項】
1. 硬蜱科蜱蟲COIII基因全長序列的擴增引物，其特征在于，其包括： COIII-TF:5'-ATGATATTTCATCCTTTTCACTTAGT-3' ； C0III-TR:5'-AATAAATTCATCAATATATAAATGTA-3'。2. 含有權利要求1所述引物的用于檢測硬蜱科蜱蟲的試劑盒。3. 根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括dNTPs、TaqDNA聚 合酶、Mg'PCR反應緩沖液中的至少一種。4. 根據權利要求2或3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括標準陽性模板。5. 權利要求1所述引物或權利要求2-4任一項所述試劑盒在檢測硬蜱科蜱蟲中的應 用。6. 硬蜱科蜱蟲的特異性PCR檢測方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 提取樣品DNA; 2) 以步驟1)提取的DNA為模板，利用權利要求1所述的引物C0III-TF和C0III-TR進 行PCR擴增反應； 3) 分析PCR產物。7. 根據權利要求6所述的方法，其特征在于，PCR反應體系以50μ1計為：5μL 10XPCRbuffer，4yl2.5mMMgCl2,2yL引物C0lII-TF(10mM)，2yI^|*C0lII-TR(10mM)， 2yLdNTPs(10mM)，lyLTaq酶（lU/μΙ)，蜱蟲DNA模板基因組 2yL(10 ~20ng)，加滅菌 雙蒸水至50μ1。8. 根據權利要求6或7所述的方法，其特征在于，PCR反應條件為：PCR擴增程序：94°C 預變性5min;94°C變性30S，45°C退火30S，72°C延伸lmin，共36個循環；72°C延伸7min，4°C 保存。
【專利摘要】本發明涉及分子生物學領域，具體提供了硬蜱科蜱蟲COIII基因全長序列的擴增引物及其應用。本發明提供的硬蜱科蜱蟲COIII基因的全長序列擴增引物如SEQ？ID？No.1和SEQ？ID？No.2所示，其可有效擴增硬蜱科線粒體COⅢ基因序列全長(778bp)，擴增效率達到98.5％。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號】CN105462965
【申請號】CN201510159290
【發明人】呂繼洲, 韓雪清, 王慧煜, 袁向芬, 賈廣樂
【申請人】中國檢驗檢疫科學研究院
【公開日】2016年4月6日
【申請日】2015年4月3日