一種促進微生物產聚乙烯醇降解酶的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種促進微生物產聚乙烯醇降解酶的方法，屬于紡織技術領域。
【背景技術】
[0002]聚乙烯醇(PVA)是一種人工合成的水溶性高分子聚合物。因其具有pH穩定、混溶性好及乳化能力強等優良特性，同時對天然纖維和一般的合成纖維具有較好的粘附性、成膜性和耐磨性，是目前滌棉織物經紗上漿中的主要漿料。采用PVA上漿的織物，在紡織前處理過程中必須經過退漿處理才能增加其吸水性。傳統的退漿方法是使用70?90°C的熱水對棉織物進行洗脫，洗脫下的PVA隨廢水排出。這樣不僅水耗、能耗大，而且容易對棉纖維造成損傷;更嚴重的是由于PVA化學耗氧量大，可生化性較差，給水體造成了嚴重的污染。
[0003]隨著人們對紡織工業清潔生產的關注，在退漿工藝中實現對PVA的生物降解受到研究者么的重視。PVA降解酶退漿條件溫和，不僅能大大減少PVA廢水的排放，而且能夠避免傳統退漿過程中高溫和氧化造成的棉纖維的損傷。
[0004]實現對PVA生物降解的關鍵在于能夠篩選到能夠高效降解PVA的微生物，但PVA降解菌在種類和分布上不多，培養周期長，酶活低，提取不易，這些都成為了阻礙PVA降解酶在實際生產上應用的重要因素。
[0005]目前產聚乙烯醇降解酶多以高聚合度聚乙烯醇、葡萄糖為碳源和誘導物，且多以單菌為主。而且采用高聚合度聚乙烯醇作為誘導劑時，存在高聚合度聚乙烯醇極易絮凝、會影響微生物對聚乙烯醇的降解、進而導致產酶量降低的缺點。
【發明內容】
[0006]為了解決上述問題，本發明提供了一種提高微生物產聚乙烯醇降解酶的方法，是以小分子多元醇作為誘導劑，促使其產生胞內酶。
[0007]在本發明的一種實施方式中，所述小分子多元醇包括以下任意一種或者多種混合:丙二醇、1，3-丁二醇、1，2，4-丁二醇。
[0008]在本發明的一種實施方式中，所述小分子多元醇是4?6g/L的1，3_丁二醇。
[0009]在本發明的一種實施方式中，所述誘導劑添加量為2?6g/L。
[0010]在本發明的一種實施方式中，所述微生物為混合菌群，主要包括以下幾種菌屬:Stenotrophomonas sp.^Pseudomonas sp.、Sphingopyxis sp.^Ochrobactrum sp.、Shinella sp.、Castellaniella sp.、Microbacterium sp.0
[0011]在本發明的一種實施方式中，所述混合菌群，來自受PVA污染的紡織廠曝氣池中的污泥。
[0012]在本發明的一種實施方式中，所述混合菌群中的Stenotrophomonas sp.可以是以下任意一種:CGMCC No 6393, CGMCC No 9046 ； Pseudomonas sp.可以是以下任意一種:CGMCC Nol0601，CGMCC No 6446 ； Sphingopyxis sp.可以是以下任意一種:CGMCC No10900,CGMCC No 9098 ；Ochrobactrum sp.可以是以下任意一種:CGMCC No 10564,CGMCCNo 10477；Shinella sp.可以是以下任意一種:CGMCC No 6838；Castellanie 11a sp.可以是以下任意一種:CGMCC No 10715,CGMCC No 10720；Microbacterium sp.可以是以下任意一種:CGMCC No6777，CGMCC No 10251。
[0013]在本發明的一種實施方式中，所述混合菌群中還可以含有Bosea sp.、Delftiasp.、Phenylobacterium sp.、Devosia sp.、Rhizobium sp.、Pseudoxanthobacter sp.、Leucobacter sp.等菌種，這些菌種的存在不會對所產粗酶液在PVA降解中產生不利影響。
[0014]在本發明的一種實施方式中，所述方法:以含有小分子多元醇作為誘導劑的肉湯培養基對混合菌群進行培養，促使其產生胞內酶。
[0015]在本發明的一種實施方式中，所述方法，是將混合菌群(按菌質量比，Stenotrophomonas sp:Pseudomonas sp.:Sphingopyxis sp.:Ochrobactrum sp.:Shinella sp.:Castellaniella sp:Microbacterium sp.約為5817:1568:24:39:36:7:31;或者還含有少量其他菌株，M icrobacter i um sp.、Bosea sp:Delftia sp.、Phenylobacterium sp.、Devosia sp:Rhizobium sp、Pseudoxanthobacter sp.、Leucobacter sp.)于肉湯培養基上培養制備種子液，然后接種于含有4?6g/L的小分子多元醇的肉湯培養基中，于30°C發酵3天，然后收集細胞、破壁，離心取上清液為粗酶液。
[0016]在本發明的一種實施方式中，所述方法還包括對誘導產酶后的細胞進行破壁處理，破壁完成后離心取上清即為所產胞內酶的粗酶液。該粗酶液中含有PVA氧化酶(一種仲醇氧化酶)、PVA水解酶(一種β-雙酮水解酶)。
[0017]在本發明的一種實施方式中，所述肉湯培養基，含有蛋白胨10.0?15.0g/L、牛肉粉3.0?5.0g/L、2?6g/L的小分子多元醇、氯化鈉5.0?6.0g/L,pH 7.2±0.2。
[0018]本發明的有益效果:
[0019](1)采用添加小分子多元醇作為誘導劑，顯著提高了混合菌群所產粗酶液的PVA降解酶酶活，有效降低了在降解聚乙烯醇漿料時所需要的粗酶液用量，節約了制備粗酶液的培養時間、培養成本，適合工業上應用。
[0020](2)對于產聚乙烯醇降解酶的微生物培養，普遍的方法是以聚合度1700左右的聚乙烯醇為碳源和誘導物，但是高聚合度的聚乙烯醇在培養基中降解不完全，酶提取過程中會和酶蛋白一起沉淀產生不能溶解的絮凝物，導致得不到PVA降解酶產品。本發明以肉湯培養基加小分子多元醇作為誘導物對微生物進行培養，既避免了絮凝的出現，又解決了 PVA降解酶分離困難的問題。
[0021 ] (3)粗酶液中含有PVA氧化酶(仲醇氧化酶)、PVA水解酶(β-雙酮水解酶)等多種協同降解PVA的酶系，該酶液可用來有效降解高聚合度的聚乙烯醇，獲得的粗酶液對PVA1799的降解酶酶活達1.985U/mL。葡萄糖誘導不出酶。
【具體實施方式】
[0022]酶活測定方法:
[0023]以lg/L的PVA1799為底物進行酶活測試。
[0024]酶活測定:在25mL比色管中加入lmL粗酶液和lmL lg/L的PVA溶液，將此混合體系于30°C的振蕩水浴鍋中反應6h，分別測定反應前后混合液所對應的PVA含量的吸光度。每分鐘吸光度下降0.001定義為一個酶活單位。
[0025]超聲細胞破碎:
[0026]培養完成的菌體離心(lOOOOr/min)，去除上清，用去離子水洗滌沉淀，充分振蕩后離心(10000r/min)，去除上清，重復以上操作多次，將沉淀物懸浮于磷酸鹽緩沖溶液(pH7.2，2011111101/1)，質量比約為1:5，用超聲破碎(4°(3，400￥，工作38，間隙28，201^11)并離心收集上清液，即為所產的胞內酶粗酶液。
[0027]實施例1:混合菌群產粗酶液(不誘導)
[0028]將混合菌群于肉湯培養基上培養制備種子液，然后再接種于肉湯培養基中，于30°C發酵3天;然后收集細胞、破壁，離心取上清液為粗酶液。
[0029]所述肉湯培養基，含有蛋白胨10.0?15.0g/L、牛肉粉3.0?5.0g/L、氯化鈉5.0?6.0g/L,pH 7.2±0.2。
[0030]收集細胞破壁后測定酶活，未檢出PVA降解酶活性。
[0031]實施例2:添加1，3-丁二醇誘導劑誘導混合菌群產酶
[0032]將混合菌群于肉湯培養基上培養制備種子液，然后再接種于含有4?6g/L的1，3_丁二醇誘導的肉湯培養基中，于30°C發酵3天;然后收集細胞、破壁，離心取上清液為粗酶液。
[0033]所述肉湯培養基，含有蛋白胨10.0g/L、牛肉粉5.0g/L、氯化鈉5.0g/L，1，3_ 丁二醇4-6g/L，pH 7.2±0.2。
[0034]測定粗酶液中酶活，結果顯示可達1.985U/mL。
[0035]實施例3:添加丙二醇誘導劑誘導混合菌群產酶
[0036]將混合菌群于肉湯培養基上培養制備種子液，然后再接種于含有2?5g/L的丙二醇的肉湯培養基中，于30°C發酵3天，然后收集細胞、破壁，離心取上清液為粗酶液。
[0037]所述肉湯培養基，含有蛋白胨15.(^/1、牛肉粉3.(^/1、氯化鈉6.(^/1，丙二醇2-5g/L，pH 7.2 ± 0.2。測定粗酶液中酶活，結果顯示可達1.32U/mL。
[0038]實施例4:添加1，2，4_ 丁三醇誘導劑誘導混合菌群產酶
[0039]將混合菌群于肉湯培養基上培養制備種子液，然后再接種于含有2_4g/L的1，2，4_丁三醇的肉湯培養基中，于30°C發酵3天;然后收集細胞、破壁，離心取上清液為粗酶液。
[0040]所述肉湯培養基，含有蛋白胨12.(^/1、牛肉粉3.0?5.(^/1、氯化鈉5.0?6.(^/1，1,2,4-丁三醇2-4g/L，pH 7.2±0.2。測定粗酶液中酶活，結果顯示可達1.364U/mL。
[0041 ] 對照例:
[0042](1)將實施例2中的1，3-丁二醇換成3g/L的PVA1799，也可以誘導產酶，但酶活僅1.02U/mL，而且高聚合度的聚乙烯醇在培養基中降解不完全，酶提取過程中會和酶蛋白一起沉淀產生不能溶解的絮凝物，導致得不到PVA降解酶產品。
[0043](2)使用葡萄糖代替實施例2中的1，3_ 丁二醇，得到的發酵液中沒有PVA降解酶酶活。
[0044]雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。
【主權項】
1.一種提高微生物產聚乙烯醇降解酶的方法，其特征在于，所述方法是以小分子多元醇作為誘導劑，促使其產生胞內酶。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述小分子多元醇包括以下任意一種或者多種混合:丙二醇、1，3-丁二醇、1，2，4-丁三醇。3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述誘導劑添加量為4?6g/L。4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物為混合菌群，主要包括以下幾種菌屬:Stenotrophomonas sp.；Pseudomonas sp.； Sphingopyxis sp.；Ochrobactrumsp.；Shinella sp.；Castellaniella sp.；Microbacterium sp.。5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法是以加有小分子多元醇作為誘導劑的肉湯培養基對混合菌群進行培養，促使其產生膜上和胞內酶。6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法:是將混合菌群于肉湯培養基上培養制備種子液，然后再接種于含有4?6g/L的小分子多元醇的肉湯培養基中，于30°C發酵3天。7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括對誘導產酶后的細胞進行破壁處理，破壁完成后離心取上清即為所產的粗酶液。8.根據權利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述肉湯培養基，含有蛋白胨10.0?15.0g/L、牛肉粉3.0?5.0g/L、氯化鈉5.0?6.0g/L、小分子多元醇4_6g/L，pH 7.2±0.2。9.按權利要求1-7任一所述方法得到的聚乙烯醇降解酶。10.權利要求9所述聚乙烯醇降解酶在紡織領域的應用。
【專利摘要】本發明公開了一種促進微生物產聚乙烯醇降解酶的方法，屬于紡織技術領域。本發明通過采用添加小分子多元醇作為誘導劑，顯著提高了混合菌群所產粗酶液的PVA降解酶酶活，有效降低了在降解聚乙烯醇漿料時所需要的粗酶液用量，節約了制備粗酶液的培養時間、培養成本，適合工業上應用。本發明方法避免了高聚合度的聚乙烯醇誘導劑導致的絮凝以及PVA降解酶分離困難的問題。
【IPC分類】C12N9/14, D06L1/14, C12N9/04, D06M101/06, D06M16/00
【公開號】CN105462940
【申請號】CN201510961865
【發明人】張穎, 王強, 范雪榮, 張潔, 王平, 袁久剛, 余圓圓, 崔莉
【申請人】江南大學
【公開日】2016年4月6日
【申請日】2015年12月18日