一種免疫細胞瘤苗的制備方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物醫藥技術領域，尤其涉及一種免疫細胞瘤苗的制備方法及其應用。
[0002]
【背景技術】
[0003]惡性腫瘤是一類最為嚴重危害人類健康的疾病，每年全國大約三百萬人診斷為新發腫瘤患者，二百多萬人死于癌癥。盡管可以通過手術、放療、化療進行治療，但大多數病人仍死于腫瘤的復發和轉移。所以，如何清除殘留的微小腫瘤組織或腫瘤細胞則是現代腫瘤免疫學有待解決的問題之一。由于癌癥發生的根本原因是腫瘤細胞逃逸免疫細胞的監控而進行無節制的生長，所以提高免疫系統識別和殺傷腫瘤細胞將從可以根本上去除腫瘤。隨著新技術在臨床上的應用推廣，免疫療法逐漸成為治療癌癥最有效的方法之一。
[0004]樹突細胞或抗原遞呈細胞(DC)是目前所知的唯一能激活初始性T細胞且功能最強的專職抗原提呈細胞(Antigen Presenting Cells，APC) AC不但可以激活自然殺傷性細胞(NK)及殺傷性T細胞(CTL)，同時，還能激活B細胞，在誘導細胞免疫及體液免疫中起著重要作用。
[0005]DC瘤苗就是通過體外模擬體內的環境，誘導單核細胞分化為成熟DC細胞，同時，使DC細胞負載相應的抗原信息，包括腫瘤特異性相關抗原、免疫抑制性抗原等來激發機體體內特異性的腫瘤免疫應答，進以清除腫瘤細胞。這種攜帶腫瘤相關抗原信息的功能性的DC被稱為DC瘤苗。
[0006]2010年4月，美國FDA批準自體樹突狀細胞疫苗(sipuleucel-T，Provenge)治療內分泌治療失敗的無癥狀轉移性前列腺癌。其原理是體外激活DC細胞的同時，承載單一腫瘤抗原PAP于DC表面，然后回輸患者體內，進一步引起抗腫瘤的免疫反應。研究表明，與安慰劑組相比，該疫苗治療組中位生存期延長4.1個月，一年的死亡風險降低22%。
[0007]但在T細胞表面存在免疫抑制因素-免疫檢查點(immune checkpoint)-的存在，這些免疫檢查點能抑制T細胞的激活，增殖和效應功能。而這些免疫檢查點控制共刺激和抑制信號的平衡，而共刺激和抑制信號在維持自身耐受，組織器官的自我保護和調節性T細胞應答的幅值與持續時間方面具有重要作用。兩個主要的免疫檢查點分子一一細胞毒性T淋巴細胞蛋白4 (CTLA4)和程序性細胞死亡的蛋白1 (PD1)，是在細胞毒性T細胞上表達的負調節因子。T細胞表面上的免疫檢查點CTLA-4和DC細胞表面的B7類分子結合，會阻止T細胞表面上的激活分子CD28與DC細胞表面的B7類分子結合，進一步抑制DC細胞抗原遞承的功能和T細胞活化激活的能力。所以，在免疫細胞激活的過程中，利用CTLA-4抗體阻礙CTLA-4與B7類分子的結合，可以增強DC的抗原提呈作用，提高抗原特異性的T細胞比例。
[0008]由于缺乏對免疫抑制靶點的控制，當前臨床上用的DC瘤苗治療癌癥普遍存在著專一性低，回輸后效用小的弱點。為克服DC疫苗的上述缺點，本專利的創新點在于:在DC制備過程中加入CTLA-4抗體來增加DC的活性，進而增加抗原專一性的T細胞比例，在回輸之后增加免疫系統殺傷腫瘤細胞的功能。
【發明內容】
[0009]本發明的目的在于提供一種免疫細胞瘤苗的制備方法及其應用，以解決上述技術問題。
[0010]為實現上述目的本發明采用以下技術方案:
一種免疫細胞瘤苗的制備方法，包括如下步驟:
1)在初始培養PBMC的培養基中，加入DC細胞活化因子，并加入一種或幾種腫瘤抗原蛋白或長鏈多肽，置于37°C、5% C02孵箱中培養12-16小時，在此過程中，腫瘤抗原被單核細胞攝取，分解和遞呈至單核細胞表面；
2)在繼續上述培養PBMC的基礎上，加入促進單核細胞成為DC細胞活化成熟的細胞因子和一種或幾種類鐸受體激活因子，和能與DC表面上MHCI結合的一種或幾種多肽，與此同時加入抗人CTLA-4抗體共同培養，阻斷CTLA-4的抑制作用，置于37°C、5% C02孵箱中培養12天，即成。
[0011 ] 所述的DC細胞活化因子為GM-CSF、IL-4。
[0012]所述的類鐸受體激活因子為0?6、？017(1:0、^^-丫、1?848。
[0013]一種免疫細胞瘤苗在癌癥治療和其他臨床的應用。該免疫細胞瘤苗增加了抗原特異性T細胞比例，對腫瘤細胞抗原具有較高的專一性。
[0014]本發明的有益效果是:本發明通過對培養激活和免疫細胞(如DC)工藝的改變，既通過在細胞培養中或細胞培養后添加免疫檢查點(CTLA-4)抗體，從而產生具有高抗原專一性和強殺傷腫瘤細胞能力的免疫成熟細胞，可以預見其增強抑制腫瘤細胞的功能，體外實驗證明，本發明培養的細胞能提高對腫瘤抗原專一性的T細胞，明顯提高和促進免疫細胞殺傷腫瘤細胞能力，從而提尚其在臨床治療癌癥的療效。
【附圖說明】
[0015]
圖1為培養14天后的細胞通過流式細胞分析儀檢測CD8陽性和抗原特異性陽性的對比圖。
【具體實施方式】
[0016]下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步闡述。
[0017]實施例1
在初始培養PBMC的培養基中，加入DC細胞活化因子GM-CSF和IL-4，和多腫瘤抗原蛋白或長鏈多肽(0.lug/ml/each)，置于37°C、5% C02孵箱中培養12-16小時；加入DC細胞活化因子IFN-γ，CpG，Poly(1:C)，R848，黑色素腫瘤抗原短肽(0.lug/ml)和抗人CTLA-4抗體(KS-0003，康志制藥)(10ug/ml)，置于37°C、5% C02孵箱中培養，細胞繼續培養12天后采收分析。
[0018]細胞培養過程細胞成分變化的測試:培養前和培養后的產品的成分通過流式細胞分析儀進行測試抗原特異性的T細胞。黑色素腫瘤抗原特異性的T細胞用五聚體來檢測，證明加入CTLA-4明顯增加抗原特異性T細胞的比例。
[0019]如圖1所示，CTLA-4抗體可以增加抗原特異性細胞的表達:培養12天后的細胞通過流式細胞分析儀檢測CD8陽性和抗原特異性陽性的表達，從圖中可以看出，加入CTLA-4抗體(ks-0003)，使抗原專一性細胞(Pentamer+)在CD8中的陽性比率從5.19%增加到6.39%。
[0020]由技術常識可知，本發明可以通過其它的不脫離其精神實質或必要特征的實施方案來實現。因此，上述公開的實施方案，就各方面而言，都只是舉例說明，并不是僅有的。所有在本發明范圍內或在等同于本發明的范圍內的改變均被本發明包含。
【主權項】
1.一種免疫細胞瘤苗的制備方法，其特征在于，包括如下步驟。2.1)在初始培養PBMC的培養基中，加入DC細胞活化因子，并加入一種或幾種腫瘤抗原蛋白或長鏈多肽，置于37°C、5% C02孵箱中培養12-16小時，在此過程中，腫瘤抗原被單核細胞攝取，分解和遞呈至單核細胞表面。3.2)在繼續上述培養PBMC的基礎上，加入促進單核細胞成為DC細胞活化成熟的細胞因子和一種或幾種類鐸受體激活因子，和能與DC表面上MHCI結合的一種或幾種多肽，與此同時加入抗人CTLA-4抗體共同培養，阻斷CTLA-4的抑制作用，置于37°C、5% C02孵箱中培養12天，即成。4.如權利要求1所述的一種免疫細胞瘤苗的制備方法，其特征在于，所述的DC細胞活化因子為 GM-CSF、IL-4。5.如權利要求1所述的一種免疫細胞瘤苗的制備方法，其特征在于，類鐸受體激活因子SCpG、poly(1:C)、IFN-y、R848。6.—種如權利要求1所述的免疫細胞瘤苗的制備方法制備的免疫細胞瘤苗，其特征在于，該免疫細胞瘤苗在癌癥治療中的應用。
【專利摘要】本發明公開了一種免疫細胞瘤苗的制備方法及該免疫細胞瘤苗在癌癥治療中的應用。在初始培養PBMC的培養基中，加入DC細胞活化因子，并加入一種或幾種腫瘤抗原蛋白或長鏈多肽，在此過程中，腫瘤抗原被單核細胞攝取，分解和遞呈至單核細胞表面；在繼續上述培養PBMC的基礎上，加入促進單核細胞成為DC細胞活化成熟的細胞因子和一種或幾種類鐸受體激活因子，和能與DC表面上MHCI結合的一種或幾種多肽，與此同時加入抗人CTLA-4抗體共同培養，阻斷CTLA-4的抑制作用。本發明培養的細胞能提高對腫瘤抗原專一性的T細胞，明顯提高和促進免疫細胞殺傷腫瘤細胞能力，從而提高其在臨床治療癌癥的療效。
【IPC分類】A61K39/00, C12N5/0786, A61K35/15, C12N5/0784, A61P35/00
【公開號】CN105462926
【申請號】CN201511015628
【發明人】岳喜連, 劉根桃, 韓姝, 殷雪, 程釗, 李曉祥
【申請人】深圳市中美康士生物科技有限公司
【公開日】2016年4月6日
【申請日】2015年12月31日