一種乙型肝炎病毒耐藥性和基因型的檢測試劑盒與檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種乙型肝炎病毒耐藥性和基因型的檢測試 劑盒與檢測方法。
【背景技術】
[0002] 乙型肝炎病毒是嗜肝DNA病毒，是引起急、慢性肝炎的主要病原之一，并可導致肝 硬化、肝功能衰竭和肝癌。我國是乙型肝炎的高發國家，2009年衛生部公報顯示2008年乙 肝發病率為106. 54/10萬人，發病人數為141萬例。HBV感染威脅國民健康，HBV的及早診 斷和正確治療應該受到極大關注。
[0003] 干擾素、拉米夫定、替比夫定、阿德福韋和即將上市的替諾福韋均為國內抗病毒的 一線藥物，隨著抗病毒治療藥物的廣泛應用，同時HBV逆轉錄酶缺乏嚴格的校正機制，導致 HBV復制過程中核苷酸錯配率較高，HBV重要位點的基因突變可導致氨基酸側鏈的柔性減 低，并在HBV的DNA聚合酶和核苷類似物三磷酸鹽之間形成空間位阻，與核苷類似物三磷酸 鹽的結合力下降，從而導致核苷類似物抗病毒藥物的耐藥發生。目前已發現的HBV耐藥變 異位點主要集中在P基因的Pol/RT區域，該區域由344個氨基酸編碼序列組成，常見的耐 藥突變類型包括 rtL180M、rtA181T、rtA181V、rtM204I、rtM204V 和 rtN236T 等。干擾素的 治療與1896G - A位點突變有關，但是1896位點突變是否發生干擾素耐藥，目前還存在一 定爭議。
[0004] 同一病毒核苷酸序列的差異，表現為HBV不同的基因型。迄今為止，根據HBV全基 因核苷酸序列的異質性彡8 %或S區基因序列差異彡4%，將HBV分為A~Η八種基因型。 在我國內地主要流行B、C和D3種HBV基因型，所占比例分別為32. 06%、67. 38%和0. 56%。 HBV導致的肝癌中，B基因型比C基因型發生單一腫瘤者多，同時伴隨更多的衛星病灶，HBV/ C基因型攜帶者大多有慢性肝病，HBV/D基因型感染者多無癥狀且HBeAg血清轉換較早。
[0005] 近年來，HBV耐藥性問題日趨嚴重，對其耐藥性檢測在乙型肝炎的治療中有著舉足 輕重的作用。同時對HBV感染者進行基因分型檢測，明確其基因型，進一步揭示基因型與病 情進展與轉歸的關系，可為臨床醫生提供更明確的病因診斷，從而擬定抗病毒治療方案。對 乙型肝炎病毒的分型情況和與用藥相關情況進行定性檢測，以輔助臨床診斷，也可用于流 行病學調查等領域。尋找一種簡便、快速、準確的檢測耐藥和分型的方法成為許多乙肝科研 工作者的重大課題，也是臨床實踐檢驗中急待解決的問題。
[0006] 目前用于HBV耐藥和分型的分子檢測方法主要有：測序法、限制性片段長度多態 性分析法（RFLP)、實時熒光定量PCR方法、線性探針反向雜交法、PCR-基因芯片法等。⑴ 測序法是HBV基因檢測的金標準，準確率高，但靈敏度較低、混合基因型檢測能力差（需要 篩選大量克隆），需要測序儀及昂貴的試劑，不適用于臨床檢測；⑵RFLP方法不需要復雜設 備、試劑，但目前方法標準化程度差；⑶定量PCR方法靈敏度高，但通量低，難以檢測多基因 位點變異；⑷線性探針反向雜交法（INNO-LiPA)擴展性差、肉眼判讀容易誤判，檢測成本高 (進口商業試劑盒），難以在國內臨床實驗室常規開展。
[0007] 目前臨床需要高通量、高特異性、操作簡單，結果判斷能自動化的檢測方法，因此， 研發快速靈敏的乙肝實驗室耐藥和分型檢測技術，存在著巨大的市場需求。基于基因檢測 的生物芯片技術是近幾年發展起來的進行大規模遺傳多態性位點檢測的新方法，是物理 學、微電子學與生命科學等學科的交叉結合，該技術以其分析速度快、可多指標并行檢測、 所需試劑及樣品量少等優勢適應了這一需要，為解決這些問題提供了新的科技手段。
[0008] 基因芯片的原理是將多種探針固定在基片上，然后與待測樣本的DNA或RNA進行 雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度而獲取樣品分子的數量和序列信息。由于該 法同時將大量探針固定于支持物上，所以一次可以對大量樣品進行檢測和分析。針對乙肝 耐藥和分型檢測，可以利用芯片技術，將目前已明確的耐藥突變探針和分型探針全部固定 到一張芯片上，只需一次雜交，即可獲得某一樣品的多位點、多藥物的耐藥檢測結果和分型 結果。目前用基因芯片檢測HBV耐拉米夫定基因突變已取得一定成果。結果表明方法準確、 快速，特異性高，信息量大，成本較低，可準確地確定突變類型和分型信息，具有明確的應用 價值。
[0009] 在檢測突變和SNP，尤其是臨床相關的檢測時，非常關注提1?芯片檢測的靈敏度和 特異性。實現這一目標的主要障礙在于，由于標記的靶標核酸與固定于芯片表面的寡核苷 酸探針之間的雜交反應是影響芯片檢測關鍵因素，作為雙鏈的DNA只有一條鏈能夠與固定 于芯片表面的探針進行雜交反應，另外一條鏈因競爭而充當了該雜交反應的干擾因素。因 此，制備單鏈DNA的不對稱PCR反應非常必要。
【發明內容】
[0010] 本發明的一個目的是提供一種用于檢測乙型肝炎病毒的7種突變型和3種基因型 的試劑盒。
[0011] 上述所述的試劑盒包括如下三組引物：
[0012] (1)用于檢測乙型肝炎病毒6種突變型的第一組引物，包括：
[0013] 所述乙型肝炎病毒6種突變型為180M型、181T型、181V型、204I-ATC型、204V型 和236T型；
[0014] a、用于檢測180M型的引物為：SEQ ID N0. 4中第23-42位核苷酸分子所示的正向 引物和用于與正向引物配對的SEQ ID N0. 9所示的引物；
[0015] b、用于檢測181T型的引物為：SEQ ID N0. 5中第22-41位核苷酸分子所示的和SEQ ID N0. 8中第22-42位核苷酸分子所示的正向引物，與正向引物配對的SEQ ID N0. 9所示的 引物；
[0016] c、用于檢測181V型的引物為：SEQ ID N0. 3中第23-42位核苷酸分子所示的正向 引物和與正向引物配對的SEQ ID N0. 9所示的引物；
[0017] d、用于檢測204I-ATC型的引物為：SEQ ID NO. 1中第24-47位核苷酸分子所示和 SEQ ID N0. 6中第24-47位核苷酸分子所示的正向引物，與正向引物配對的SEQ ID N0. 9所 示的引物；
[0018] e、用于檢測204V型的引物為：SEQ ID N0. 2中第23-45位核苷酸分子所示的正向 引物和與正向引物配對的SEQ ID N0. 9所示的引物；
[0019] f、用于檢測236T型的引物為：SEQ ID NO. 7中第23-48位核苷酸分子所示的正向 引物和與正向引物配對的SEQ ID N0. 9所示的引物；
[0020] (2)用于檢測乙型肝炎病毒的3種基因型的第二組引物，包括：
[0021] 所述乙型肝炎病毒的3種基因型為HBV/B型、HBV/C型和HBV/D型；
[0022] g、用于檢測HBV/B型的引物為：SEQ ID N0. 13中第22-44位核苷酸分子所示的正 向引物，與正向引物配對的SEQ ID N0. 17所示的和SEQ ID N0. 18所示的引物；
[0023] h、用于檢測HBV/C型的引物為：SEQ ID N0. 15中第21-39位核苷酸分子所示的正 向引物和與正向引物配對的SEQ ID N0. 19所示的引物；
[0024] i、用于檢測HBV/D型的引物為：SEQ ID N0. 16中第21-39位核苷酸分子所示的正 向引物和與正向引物配對的SEQ ID N0. 20所示的引物；
[0025] (3)用于檢測乙型肝炎病毒的1896A型和204I-ATT型的第三組引物，包括：
[0026] j、用于檢測1896A型的引物為：SEQ ID N0. 22中第25-43位核苷酸分子所示的正 向引物，與正向引物配對的SEQ ID N0. 24所示的、SEQ ID N0. 25所示的和SEQ ID N0. 26所 示的引物；
[0027] k、用于檢測204I-ATT型的引物為：SEQ ID N0. 21中第24-42位核苷酸分子所示 的正向引物和與正向引物配對的SEQ ID N0. 27所示的引物。
[0028] 上述試劑盒中，所述的正向引物序列的5'端均連接有標簽序列，每種突變型和基 因型所對應的標簽序列各不相同；各標簽序列為與引物擴增模板序列不配對的寡核苷酸序 列。
[0029] 上述試劑盒中，所述與正向引物配對的引物標記有熒光素，具體是在與正向引物 配對的引物5'端標記有熒光素；所述熒光素具體為四甲基羅丹明熒光素。
[0030] 上述試劑盒中，所述的引物如下：
[0031] 用于檢測180M型的引物為：SEQ ID N0. 4所示的正向引物和用于與正向引物配對 的SEQ ID N0. 9所示的引物；
[0032] 用于檢測181T型的引物為：SEQ ID N0. 5所示的正向引物、SEQ ID N0. 8所示的正 向引物和與正向引物配對的SEQ ID N0. 9所示的引物；
[0033] 用于檢測181V型的引物為：SEQ ID N0. 3所示的正向引物和用于與正向引物配對 的SEQ ID N0. 9所示的引物；
[0034] 用于檢測204I-ATC型的引物為：SEQ ID NO. 1所示的正向引物、SEQ ID N0. 6所示 的正向引物和與正向引物配對的SEQ ID NO.