逆轉錄病毒檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物領域，特別是涉及生物制品安全性檢測領域，更具體的說，是涉及逆轉錄病毒的檢測方法。
【背景技術】
[0002]生物制品是以微生物、細胞、動物或人源組織和體液等為原料，應用傳統技術或現代生物技術制成，用于人類疾病的預防、治療和診斷的產品。人用生物制品包括:細菌類疫苗(含類毒素)、病毒類疫苗、抗毒素及抗血清、血液制品、細胞因子、生長因子、酶、體內及體外診斷制品，以及其他生物活性制劑，如毒素、抗原、變態反應原、單克隆抗體、抗原抗體復合物、免疫調節及微生態制劑等。
[0003]在生物制品的生產和應用過程中會遇到一些諸如安全性的問題。如抗體藥物，單克隆抗體中小鼠雜交瘤細胞的使用，容易使單抗制品出現鼠源性病毒污染的可能；而多克隆抗體主用采用動物血清制備，也同樣存在動物血清來源的安全性問題。目前，很多基因制品涉及蛋白表達載體的構建，這種構建的細胞系容易出現病毒感染的隱患。如皰疫病毒(EBV)轉染的人成淋巴細胞系與小鼠骨髓瘤細胞融合后，其分泌的單克隆抗體容易出現小鼠逆轉錄病毒的感染。再者，基因重組蛋白制品所使用的表達細胞系本身含有內源性病毒，如中國倉鼠卵巢細胞自身存在內源性逆轉錄病毒，這也使得其分泌的蛋白存在安全隱患。作為生物制品的來源，均存在被細菌、病毒等微生物污染的可能性，因此在藥品安全性問題上，生物制品與傳統藥品最大的不同是:生物制品存在內源性然染的可能。因此，WH0、美國FDA、中國CFDA以及歐洲相關部門已經出具相應法規并規定:存在內源性污染的生物制品，在生產工藝中必須具備去除/滅活內源性污染的工藝，而且，必須對此工藝及產品進行生物安全性檢測以排除生物制品制備工藝及產品沒有潛在的病毒污染。
[0004]傳統的逆轉錄病毒檢測方法，主要有感染性實驗技術、PCR法或電鏡法等，這些檢測方法存在的主要問題是檢測靈敏度和特異性不高，且對于主流的PCR法檢測病毒基因片段的方法存在非議。因為病毒的檢測多是在病毒滅活之后，而病毒滅活后其基因組可能會裂解成小片段，加之定量PCR的擴增產物分子量一般都很小，所以很容易造成假陽性的出現。
【發明內容】
[0005]本發明要解決的技術問題是提供一種逆轉錄病毒檢測方法，它檢測靈敏度和特異性高。
[0006]為解決上述技術問題，本發明的逆轉錄病毒檢測方法，包括以下步驟:
[0007]1)選擇支持所述逆轉錄病毒復制的宿主細胞；
[0008]2)將待測樣品與所述宿主細胞共培養；
[0009]3)收集上清液，接種指示細胞系，檢測上清液是否存在逆轉錄病毒的污染。
[0010]所述逆轉錄病毒包括A-MuLv、E-Mulv等遺傳信息錄在核糖核酸(RNA)上的病毒。
[0011]步驟1)，所述宿主細胞包括Mus Dunni (小鼠尾細胞克隆)等。
[0012]步驟2)，共培養條件為:逆轉錄病毒按一定的滴度加入到宿主細胞的培養液中，細胞、病毒在37±1°C下、5±1% C02中共同培養，細胞每5天傳代一次，共傳代2次。
[0013]步驟3)，所述指示細胞系包括PG4 S+L (莫洛尼式肉瘤轉化貓正常星型膠質細胞)。
[0014]本發明用共培養法檢測逆轉錄病毒，大幅提高了逆轉錄病毒檢測的靈敏度和特異性，相比傳統的逆轉錄病毒檢測方法更為準確、靈敏、可靠，重復性也更好，可廣泛地應用于單克隆抗體、體外診斷制品等生物制品的檢測(例如無菌檢測、支原體檢測、物種鑒定、病毒檢測、細胞增殖測定等)，以及對生物制品生產過程中去除/滅活內源性污染的工藝所進行的生物安全性檢測。
【附圖說明】
[0015]圖1是無病毒的陰性對照細胞PG4 S+L。
[0016]圖2是逆轉錄病毒A-MuLV感染PG4 S+L細胞形成的斑。
【具體實施方式】
[0017]為對本發明的技術內容、特點與功效有更具體的了解，現結合附圖及具體實施例，對本發明的技術方案詳述如下:
[0018]本實施例檢測A-MuLV (鼠白血病病毒)逆轉錄病毒的方法，具體包括以下步驟:
[0019]步驟1，選擇合適的支持A-MuLV逆轉錄病毒復制的宿主細胞。
[0020]宿主細胞在有效擴增病毒、給病毒提供養分方面起重要作用。本實施例經實驗結果最終選擇的宿主細胞是Mus Dunni (小鼠尾細胞克隆)。
[0021]步驟2，將待測樣品與步驟1所選的Mus Dunni宿主細胞進行共培養，即逆轉錄病毒按一定的滴度加入到宿主細胞的培養液中，宿主細胞和逆轉錄病毒在37±1°C下、5±1%C02中共同培養，細胞每5天傳代一次，共傳代2次。通過共培養可進一步提高可能存在的逆轉錄病毒在樣品中的含量。
[0022]步驟3，收集上清液。
[0023]步驟4，接種合適的指示細胞系(本實施例的指示細胞系選擇的是PG4 S+L，A-MuLV病毒可以在該指示細胞系上形成特異性空斑)，檢測待測上清液是否存在A-MuLV逆轉錄病毒的污染，如存在A-MuLV逆轉錄病毒，則在顯微鏡下可看到特異性空斑，并可以計數，根據計數結果可分析統計樣品中A-MuLV逆轉錄病毒的滴度。
[0024]上述逆轉錄病毒檢測方法可廣泛應用于細胞庫(如PG4 S+L-、mus dunn1、XC等細胞)生產與鑒定實驗(例如無菌檢測、支原體檢測、物種鑒定、病毒檢測、細胞增殖測定等)，或逆轉錄病毒模式病毒MuLV的生產與鑒定試驗(例如效價測定、純度檢測、一致性檢測、生物負荷檢測等)。
【主權項】
1.逆轉錄病毒檢測方法，其特征在于，步驟包括: 1)選擇支持所述逆轉錄病毒復制的宿主細胞； 2)將待測樣品與所述宿主細胞共培養； 3)收集上清液，接種指示細胞系，檢測上清液是否存在逆轉錄病毒的污染。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述逆轉錄病毒包括A-MuLv、E-Mulv。3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)，所述宿主細胞包括MusDunni。4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)，共培養條件為:將逆轉錄病毒加入到宿主細胞的培養液中，在37 ± 1 °C、5 ± 1 % C02中共同培養，細胞每5天傳代一次，共傳代2次。5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)，所述指示細胞系包括PG4S+L。6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)，檢測方法為:上清液接種指示細胞系所在的六孔板，6天后，顯微鏡下觀察指示細胞形成的空斑的數量并計數，統計分析數據。
【專利摘要】本發明公開了一種逆轉錄病毒檢測方法，步驟包括：1)選擇支持所述逆轉錄病毒復制的宿主細胞；2)將待測樣品與所述宿主細胞共培養；3)收集上清液，接種指示細胞系，檢測上清液是否存在逆轉錄病毒的污染。本發明用共培養法檢測逆轉錄病毒，相比傳統的逆轉錄病毒檢測方法，大幅提高了逆轉錄病毒檢測的靈敏度和特異性，可廣泛地應用于單克隆抗體、體外診斷制品等生物制品的檢測，以及對生物制品生產過程中去除/滅活內源性污染的工藝所進行的生物安全性檢測。
【IPC分類】C12R1/93, C12Q1/70, C12Q1/06
【公開號】CN105420413
【申請號】CN201511017971
【發明人】馬鈴蘭, 董運海, 劉大鈞
【申請人】蘇州藥明康德檢測檢驗有限責任公司, 無錫藥明康德生物技術股份有限公司
【公開日】2016年3月23日
【申請日】2015年12月30日