一種通過不同宿主交替繁殖快速獲得殺蟲譜擴大重組昆蟲病毒的方法
【專利說明】
一、技術領域
[0001]本發明屬于害蟲生物防治技術領域，具體涉及一種通過在不同活體宿主中交替繁殖快速獲得殺蟲譜擴大重組病毒的方法。
二、技術背景
[0002]昆蟲病毒殺蟲劑因具有對靶標害蟲致病性高和能在害蟲種群中自然傳播并長期流行，以及不易產生抗藥性等優于其它殺蟲劑的特點，一直以來都受到人們關注。然而單一的病毒殺蟲劑除存在殺蟲速度慢的缺點，還有殺蟲譜窄的不足，這些均束縛了昆蟲病毒在生產上的應用。如何通過有效的生物學途徑，擴大病毒的宿主域，此對于創新和高效利用昆蟲病毒防治重大害蟲至關重要。
[0003]現已研究證實，在昆蟲細胞或活體內，利用異源重組的方法可成功得到宿主域較親本病毒擴大的重組病毒株系。如苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)和刺金翅夜蛾核型多角體病毒(RoNPV)共同感染大蠟螟幼蟲時，可得到不同于兩個親本的重組病毒(Crozier等，1988);用AcNPV與家蠶核型多角體病毒(BmNPV)共同感染Sf_21細胞(BmNPV的非受納細胞系)，獲得了能在Sf-21和家蠶細胞系中均可復制增殖的重組病毒，其宿主域得到擴大(Kondo等，1991年)；將斜紋夜蛾核型多角體病毒(S1NPV)病毒粒子與甜菜夜蛾核型多角體病毒(SeNPV)DNA的Bam HI酶切片段，以及SeNPV病毒粒子與S1NPV DNA的BamHI的酶切片段共轉染，均獲得了寄主范圍擴大的重組病毒(劉彥文等，1996)。
[0004]空斑純化法和活體克隆法都可用于分離重組昆蟲病毒，其中空斑純化法為通過在細胞中培養來分離病毒不同基因型，為常用分離方法，而活體克隆法則利用活體昆蟲宿主來分離病毒不同基因型，應用相對較少。雖然空斑純化法能較快速地分離出許多病毒基因型，但要明確各病毒基因型對活體宿主的致病力，篩選出目的重組病毒，還需要對分離的多個病毒基因型進行大量生物測定，通過活性測定結果明確病毒活性和宿主域。傳統的活體克隆法利用一種活體宿主分離病毒基因型，其分離獲得的病毒基因型對克隆宿主有致病力，但對其他活體宿主是否有致病力，需要借助于生物測定來明確。因此，在不同病毒發生重組后，要分離宿主域擴大的重組病毒，無論是現有的空斑純化法還是活體克隆法，均需要借助于大量生測才能篩選出目的重組病毒。要有效提升昆蟲病毒作為病毒殺蟲劑的潛力，需要建立一種快速獲得宿主域擴大重組昆蟲病毒的方法。
三、
【發明內容】
[0005]1、發明目的
[0006]提供一種快速的宿主域擴大重組昆蟲病毒獲得方法，能有效篩選宿主域擴大病毒，提升病毒殺蟲劑的應用潛力。
[0007]2、技術方案
[0008]為達到上述目的，本發明選用分別對兩種昆蟲宿主專化的不同核型多角體病毒以高劑量共同侵染其中一種宿主群體，繁殖后再以極低劑量侵染另一種宿主，單頭收集染病害蟲，所獲得的單頭病毒即為能夠同時感染兩種宿主的宿主域擴大重組病毒。
[0009]本發明為一種宿主域擴大的重組昆蟲病毒的獲得方法，其特征在于利用不同活體宿主交替繁殖快速獲得殺蟲譜擴大的重組病毒，提升昆蟲病毒的應用潛力。
[0010]3、有益效果
[0011]本發明的方法與現有技術相比，產生以下有益效果:(1)與傳統的空斑純化法和活體克隆法相比，明顯提高了目的重組病毒篩選速度。(2)有效地擴大了病毒的宿主域范圍，從而擴大了病毒應用范圍。(3)顯著減少了施藥次數，降低了病毒的應用成本。
四、【具體實施方式】
:
[0012]本發明的實施例是采用室內生物測定方法。
[0013]供試材料
[0014]供試昆蟲:斜紋夜蛾和甜菜夜蛾均為室內長期人工飼養，已連續飼養40多代。飼養溫度為27°C +1°C，光照為14h:10h(L:D)，蟲卵用2 %甲醛消毒，幼蟲3齡前群體飼養，3齡后單頭飼養。試驗選用齡期一致的健康幼蟲。
[0015]供試病毒:SlNPV、SeNPV和AcNPV均為本實驗室長期保存。病毒純化后適當稀釋，用血球計數板計數，4°C冰箱保存備用。
[0016]試驗方法
[0017]病毒侵染和分離:將不能經口感染斜紋夜蛾的SeNPV或者AcNPV與不能經口感染甜菜夜蛾的S1NPV按多角體濃度1: 1以高濃度(10sPIB/ml)混合感染甜菜夜蛾幼蟲，飼料添毒法，感染致死后收獲病蟲，進行病毒多角體純化。再將純化后的多角體以10PIB/頭的低劑量感染斜紋夜蛾4齡初期幼蟲，共接種100-300頭斜紋夜蛾，放于6孔板中，每孔1頭，在病毒致死率在5%以下時，收集單頭病蟲，并分別純化，測定其中病毒產量最高的單頭病毒的活性，同時以重組前的S1NPV作為對照。
[0018]病毒活性測定:采用飼料添毒法測定病毒對斜紋夜蛾和甜菜夜蛾幼蟲的活性，分別測定濃度為107PIB/ml、10sPIB/ml和109PIB/ml病毒的活性。將人工飼料切成相同小塊(確保24h內吃完)，加入滅過菌的24孔板中，加10 μ 1病毒懸浮液。SeNPV和S1NPV復合侵染處理組分別接入大小一致甜菜夜蛾或斜紋夜蛾3齡中期幼蟲，AcNPV和S1NPV復合侵染處理組分別接入大小一致甜菜夜蛾2齡中期幼蟲或斜紋夜蛾3齡中期幼蟲，每孔1頭，每個濃度處理4塊板，同時以清水作為空白對照。試驗在29+1 °(:培養箱中培養，每日調查病死蟲數，直到不再有病毒致死幼蟲出現。
[0019]實施例1
[0020]將不能感染斜紋夜蛾的SeNPV和不能感染甜菜夜蛾的S1NPV按病毒多角體數量1:1混合以高濃度一同感染甜菜夜蛾后，獲得病毒再經低劑量感染斜紋夜蛾，獲得了對斜紋夜蛾和甜菜夜蛾均有活性的重組病毒。毒力測定結果表明，在病毒濃度為10sPIB/ml和109PIB/ml時，較重組前的S1NPV而言，重組病毒對甜菜夜蛾3齡幼蟲的致死率由重組前的0%分別上升到20.5%和31.6%。同時，病毒對斜紋夜蛾3齡幼蟲的致死率分別為89.2%和98.5%與重組前的92.8%和99.6%無顯著差異。
[0021]實施例2
[0022]同樣，將不能感染斜紋夜蛾的AcNPV和不能感染甜菜夜蛾的S1NPV按病毒多角體數量1: 1混合以高濃度一同感染甜菜夜蛾后，獲得病毒再經低劑量感染斜紋夜蛾，也獲得了對斜紋夜蛾和甜菜夜蛾均有活性的重組病毒。活性測定結果表明，病毒濃度為107PIB/ml時，對甜菜夜蛾2齡幼蟲的致死率由重組前的0上升至22.8%。病毒濃度為10sPIB/ml和109PIB/ml時，對斜紋夜蛾3齡幼蟲的致死率沒有顯著變化，分別為87.4%和97.0%，與重組前的92.8%和99.6%無顯著差異。
【主權項】
1.一種殺蟲譜擴大重組昆蟲病毒的獲得方法，其特征在于通過在不同宿主中交替繁殖快速獲得殺蟲譜擴大重組昆蟲病毒。
【專利摘要】本發明公開了一種快速獲得宿主域擴大重組昆蟲病毒的方法。現有空斑純化法和活體克隆法在篩選宿主域擴大重組病毒時，需借助于大量生物測定才能篩選出目的重組病毒，較為費時費力。針對這一問題，用分別對兩種昆蟲宿主專化的不同核型多角體病毒以高劑量共同侵染其中一種宿主群體，繁殖后再以極低劑量侵染另一種宿主，單頭收集染病害蟲，所獲得的單頭病毒即為能夠同時感染兩種宿主的宿主域擴大重組病毒。同現有技術相比，本方法明顯提高了目的病毒的獲得速度，有效地擴大了病毒的宿主域范圍，從而擴大了病毒的應用范圍。
【IPC分類】C12N7/00
【公開號】CN105420197
【申請號】CN201510783220
【發明人】郭慧芳, 方繼朝, 劉寶生, 鐘萬芳, 張志春, 牛洪濤
【申請人】江蘇省農業科學院
【公開日】2016年3月23日
【申請日】2015年11月11日