大豆花特異啟動子GmAP1.3及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子生物學、基因工程技術領域，具體地，涉及一種大豆花特異啟動子 GmAPL 3及其應用。
【背景技術】
[0002] 啟動子是基因中重要的順式作用元件，一般位于轉錄起始位點上游幾十個堿基 處。
[0003] 啟動子根據轉錄模式不同可分為三種：組成型啟動子、組織或器官特異性啟動子 和誘導型啟動子。組織或器官特異性啟動子的活性是受特定的組織細胞結構和化學、物理 信號誘導調節的，即這類啟動子的表達具有特定的時空性。在這類啟動子的驅動下，基因的 表達往往只限于某些特定的器官或組織部位或特定的發育時期。組織或器官特異性啟動子 不僅能使目的基因的表達產物在一定器官或組織部位積累，提高區域表達量，同時也可以 避免目標基因在其他組織器官中表達造成的不利影響。
[0004] 到目前為止，已有大量的組織或器官特異性啟動子被分離出來，其中包括花特異 啟動子和種子特異啟動子。如花粉發育有關的組織特異性啟動子如TA29、Lat52、0sg6B、 Zml3、Sl等已有詳細研究報道；UBC6啟動子（Watts，1994)主要在花中表達；Tspl是水稻中 絨氈層特異啟動子（馬沁沁，2005) ;DefH9是子房特異啟動子（Rotino，1997) ;PtNIPl是柏 樹胚胎發育特異性啟動子（Vincent，2002)。這些啟動子都能特異啟動目標基因的表達，改 變特異組織器官的發育。但大豆中花特異表達的啟動子鮮有報道。
[0005] 成花過程是植物從營養生長向生殖生長的關鍵轉折期，包括開花誘導、花的發端 和花器官發育三個階段，受眾多基因調控。調控植物成花過程的基因可分為：花序分生組織 特征基因、花分生組織特征基因、花器官形態特征基因等。API (APETALA1)基因屬于植物花 分生組織特征基因和花器官形態特征基因，在控制植物花分生組織特性與花器官的形成過 程中起著重要的作用。
[0006] 因此有必要研究和獲得調控大豆花APl的啟動子序列，從而為深入研究植物成花 過程、花的發端和花器發育提供有效手段和途徑。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的在于獲得調控大豆花APl基因的啟動子序列，從而為在各種作物、 林木、蔬菜、花卉、牧草等植物的花中特異表達目標基因提供有效途徑。
[0008] 為達到以上目的，本發明提供了一種大豆花特異啟動子GmAPL 3,其具有：
[0009] a) SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；或
[0010] b)SEQ ID No. 1所示核苷酸序列經取代、缺失和/或添加一個或幾個核苷酸所獲得 的具有同等功能的由a)衍生的核苷酸序列。
[0011] 例如，在不改變啟動子功能的情況下，進行以下取代方式中的至少一種所獲得的 核苷酸序列：將第28位的C取代為T、將第212位的C取代為T、將第2399位的G取代為A、 將第2498位的T取代為C。
[0012] 本發明還提供了從擬南芥基因組中克隆得到2500bp的GmAPL 3啟動子序列所用 的特異性引物序列，其包括正向引物：5 ' -ATGTAGCCCTTCAACCAACATGGGA-3 ' ；和反向引物： 5' -CTATCTGGGACTGGGGTTTGGTGAC-3'。
[0013] 本發明還提供了含有啟動子GmAPL 3的載體以及含有所述載體的宿主細胞。
[0014] 本發明還提供了含有啟動子GmAPL 3的轉化植物細胞。
[0015] 本發明還提供了啟動子GmAPL 3在調控下游基因表達中的應用，優選下游基因為 ⑶S基因。
[0016] 本發明還提供了啟動子GmAPL 3在植物花發育調節中的應用。
[0017] 在本發明中，可選用本領域已知的各種載體，只要適合啟動子GmAPL 3的表達即 可，例如可以為市售的載體及質粒。
[0018] 本發明首次分離了大豆花特異啟動子GmAPL 3,利用啟動子GmAPL 3過表達擬南 芥⑶S基因，結果表明啟動子GmAPL 3可明顯促進植物花器官和胚胎中⑶S基因的表達量， 因而，GmAPL 3啟動子在植物花器官具有特異性，適合在各種作物、林木、蔬菜、花卉、牧草等 植物的花中特異表達目標基因。
【附圖說明】
[0019] 圖1為質粒BDVl的結構示意圖；
[0020] 圖2為擬南芥GmAPL 3-GUS在花器官（雌蕊）中的表達結果；
[0021] 圖3為擬南芥GmAPL 3-GUS在花器官（雄蕊）中的表達結果；
[0022] 圖4為擬南芥GmAPL 3-GUS在花器官（花瓣）中的表達結果；
[0023] 圖5為擬南芥GmAPL 3-GUS在花器官（花萼）中的表達結果；；
[0024] 圖6為擬南芥GmAPL 3-GUS在花中的表達結果；
[0025] 圖7為擬南芥GmAPL 3-GUS在花序中的表達結果；
[0026] 圖8為擬南芥GmAPL 3-GUS的PCR檢測結果。
【具體實施方式】
[0027] 下面結合【具體實施方式】對本發明進行詳細說明。
[0028] 以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例 中所用技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。
[0029] 實施例1
[0030] 本實施例用于說明大豆GmAPL 3啟動子的克隆
[0031] 利用正向引物 5' -ATGTAGCCCTTCAACCAACATGGGA-3' 和反向引物 5' -CTATCTGGGACTGGGGTTTGGTGAC-3'從大豆基因組中PCR擴增并測序獲得長度為2500bp 的GmAPL 3啟動子，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0032] 上述PCR擴增體系為：（20 μ 1體系）
[0033]
[0034] PCR 程序：
[0036] 實施例2
[0037] 本實施例用于說明大豆GmAPL 3啟動子調控下游基因⑶S的表達情況。
[0038] 將GmAPL 3啟動子克隆至入門載體并與⑶S基因融合，然后將獲得的融合基因構 建至表達載體BDVl。
[0039] 過程如下：PCR克隆得到GmAPL 3啟動子后，通過Solution I連接至帶有⑶S基 因的入門載體，并與之融合。采用GateWay重組克隆的方法（Invitrogen)，通過LR反應將 啟動子及⑶S基因重組至目的載體BDVl上。BDVl的結構如圖1所示、
[0040] 獲得雙元表達載體pGmAPl. 3::⑶S ;將植物表達載體pGmAPl. 3::⑶S轉化至大腸 桿菌DH5 α中擴繁。大腸桿菌感受態細胞的轉化，包括：（1)制備含氨芐青霉素的LB固體 培養基；（2)取出貯存于_80°C的感受態細胞，冰浴中融化后，加入2 μ 1質粒輕輕混勻，冰浴 中放置30分鐘；（3) 42°C熱激30秒，然后立即置于冰浴中3分鐘；加入300 μ 1不含抗生素 的LB液體培養基，37°C搖床振蕩培養1小時（160rpm) ;(4)取適量培養液均勻涂于選擇性 培養基上，37°C倒置培養16小時，用滅菌牙簽挑取5-10個（或更多）菌落，置于200 μ 1選 擇性液體LB培養基中搖菌培養；（5)PCR檢測篩選到的陽性克隆（圖8)。通過農桿菌介導 轉化方法，將PGmAPL 3::⑶S轉入擬南芥，獲得轉化pGmAPl. 3::⑶S的擬南芥2株；通過⑶S 活性分析表明，GmAPL 3啟動子在植物的雌蕊（圖2)、雄蕊（圖3)、花瓣（圖4)、花萼（圖 5)、花（圖6)及花序（圖7)中特異表達，可用于包括各種作物、林木、蔬菜、花卉、牧草等在 內的各種植物的花和胚胎中特異表達目標基因。
[0041] 擬南芥⑶S染色：
[0042] (1)將組織樣品加入90%丙酮中，置于冰上20~30分鐘；
[0043] (2)經丙酮處理后，用 50mM 磷酸緩沖液（pH7. 2)、2mM K4Fe [CN] 6及 2mM K 3Fe [CN] 6 溶液潤洗組織；
[0044] (3)將樣品放在X - Gluc染色液中（5〇mM磷酸緩沖液（pHL 2)，ImM X-gluc，2禮 K4Fe[CN]6, 2mM K3Fe[CN]6)，抽氣 10 分鐘，然后 37°C 染色過夜；
[0045] (4)第二天用70 %乙醇脫色；
[0046] (5)在載玻片上加幾滴HCG溶液，將脫色后的樣品置于其中；
[0047] (6)壓片，透明15分鐘或者過夜透明（根據組織的發育時期而定）。
[0048] ⑶S染色液配方：
[0049] 20mM X-gluc (Mff = 521. 8)
[0050] 用DMSO或N，N-二甲基甲酰胺溶解，IOOmg X-gluc需用9. 58ml DMSO溶解，終濃 度為20mM。
[0051] 50mM 磷酸緩沖液（ρΗ7· 0)
[0052] A液：NaH2PO4 · 2H20 3. 12g溶于無菌蒸餾水，定容至100mL ;
[0053] B液：Na2HPO4 · 12H20 7. 17g溶于無菌蒸餾水，定容至100mL ;
[0054] 取39mlA液與61mlB液混合。
[0055] 染色液配制：5mM鐵氰化鉀；5mM亞鐵氰化鉀；IOmM EDTA ;50mM磷酸緩沖液；ImM X-gluc〇
[0056] 雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在 本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
【主權項】
1. 大豆花特異啟動子GmAPl. 3,其特征在于，其具有： a) SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列；或 b)SEQIDNo. 1所示核苷酸序列經取代、缺失和/或添加一個或幾個核苷酸所獲得的具 有同等功能的由a)衍生的核苷酸序列。2. 根據權利要求1所述的啟動子，其特征在于，所述啟動子是進行以下取代方式中的 至少一種所獲得的核苷酸序列：將第28位的C取代為T、將第212位的C取代為T、將第2399 位的G取代為A、將第2498位的T取代為C。3. 含有權利要求1或2所述啟動子的載體。4. 含有權利要求3所述載體的宿主細胞。5. 含有權利要求1或2所述啟動子的轉化植物細胞。6. 權利要求1或2所述的啟動子在調控下游基因表達中的應用。7. 權利要求1或2所述的啟動子在植物花發育調節中的應用。8. 權利要求1或2所述的啟動子的特異性引物序列，其特征在于，包括： 正向引物：5 ' -ATGTAGCCCTTCAACCAACATGGGA-3 ' ； 反向引物：5 ' -CTATCTGGGACTGGGGTTTGGTGAC-3 '。
【專利摘要】本發明提供了一種大豆花特異啟動子GmAP1.3，其核苷酸序列如SEQ？ID？No.1所示。還提供了所述啟動子在調控下游基因表達中的應用。利用啟動子GmAP1.3過表達擬南芥GUS基因，結果表明啟動子GmAP1.3可明顯促進植物花器官中GUS基因的表達量，因而，GmAP1.3啟動子在植物花器官中具有特異性，適合在各種作物、林木、蔬菜、花卉、牧草等植物的花中特異表達目標基因。
【IPC分類】C12N5/10, C12N15/113, C12N15/11, C12N15/82, A01H5/02
【公開號】CN105385689
【申請號】CN201510888831
【發明人】傅永福, 張曉玫, 陳福祿, 宋拉拉
【申請人】中國農業科學院作物科學研究所
【公開日】2016年3月9日
【申請日】2015年12月7日