一種與長QT綜合征相關的miRNA及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及發現一種可預判長QT綜合征罹患風險及診斷的miRNA，即miR-3619， 及其反義寡聚核苷酸AM0-3619在制備治療長QT綜合征藥物中的應用，確切地說，本發明涉 及AM0-3619在制備治療長QT綜合征藥物中促進hERG基因功能的應用。
【背景技術】
[0002] 長QT綜合征（Long QT Syndrome，LQTs)是指是指心電圖上QT間期延長、T波異 常，易產生室性心律失常，尤其是尖端扭轉性室性心動過速（Torsade de points，TdP)、暈 厥和猝死的一組綜合征。按照病因，可分為先天性長QT綜合征（cLQTs)和獲得性長QT綜合 征（aLQTs)。cLQTs是兒童和年輕人發作性暈厥和意外猝死的主要原因。多種通道基因突 變可導致先天性長QT綜合征，目前已發現有13個基因突變與先天性長QT綜合征相關，但 hERG基因突變致鉀通道功能缺陷所致的先天性2型長QT綜合征更常見，占總突變的45%， 為第二常見突變基因。目前已發現300多個hERG基因突變位點與先天性長QT綜合征相關。 而在臨床工作中，獲得性長QT綜合征更常見，其和TdP的發病密切關聯，具有潛在致命性， 是院內心臟性猝死的重要原因之一。目前已知有多種因素與獲得性長QT綜合征相關，包括 藥物、心動過緩/速、冠心病（心肌缺血、心肌梗死）、心肌肥厚、心力衰竭和遺傳易感性等， 其中藥物導致的獲得性長QT綜合征影響最廣。
[0003] HERG (huamn ether-a-Go-Go related gene，hERG)基因，即 KCNH2,定位于人 7 號 染色體。研究表明hERG基因編碼的快速激活延遲整流鉀電流（IKr)在正常的動作電位復 極過程中起關鍵作用。它是多種藥物產生心臟不良反應的分子靶標，與QT間期延長最為緊 密相關。藥物本身或其代謝產物阻滯Ikr、延長心臟復極化是藥物獲得性長QT綜合征的重 要分子機制之一。美國食品和藥品管理局（FDA)規定所有藥物上市前必須進行HERG的安 全性評價。研究表明，先天性和獲得性因素均可以通過hERG通道合成障礙、轉運障礙、門控 及通透性改變最終導致長QT綜合征的發生。因此，更好的理解hERG相關LQTS的發病機制 將有助于針對LQTS病人尋找新的治療手段。
[0004] 微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一類長約21~25nt的內源性非編碼小RNA，通過 與靶基因 mRNA互補結合，在轉錄后水平調節靶基因的表達，抑制蛋白質的翻譯或促進mRNA 降解，從而對靶基因的表達起著反向調節作用。部分miRNA在心血管組織中特異性表達，使 其在心血管系統發育及心臟疾病的發生發展中發揮重要作用。近年來，一系列研究證實， miRNA過度上調或下調均可引起離子通道蛋白表達紊亂，致離子通道平衡失調，誘發心律 失常，是潛在的心律失常作用靶點。例如，miR-1可作用于縫隙連接通道蛋白43及內向整 流鉀通道的α亞單位從而降低心臟功能及引起缺血性心律失常；在糖尿病心臟病兔模型 miR-133的高表達可抑制hERG基因表達從而導致心律失常的發生；在乳鼠心肌細胞證實， 藥物三氧化二砷可通過上調miR-21和miR-23a的水平抑制hERG蛋白表達從而導致長QT 綜合征。同時研究發現，外源性給予相應miRNA互補的反義寡聚核苷酸序列（anti-miRNA oligonucleotides，AMOs) (AMO-1、AMO-133、AMO-21、AM0-23a)可以減少相應的心律失常發 生。因此臨床上可將miRNA作為診斷標記物及潛在治療靶標，而運用與miRNA互補的寡核 苷酸序列AMOs可抑制相應miRNA的功能，表明AMOs在作為心律失常的治療手段方面具有 重要的應用價值。
[0005] 目前長QT綜合征的治療主要采取藥物治療、左心交感神經去除術和植入心臟復 律除顫器，但這些方法均存在局限性，而且不能根治。因此尋找有效的治療手段，具有重要 的臨床意義。而于遺傳性長QT綜合征，采取基因治療是根治的方法之一。而現有技術中， 尚未發現促進hERG基因功能的治療長QT綜合征的藥物。
【發明內容】
[0006] miRNA和靶基因的關系是"多對多"的，一個miRNA可以有多個靶基因，同樣，一 個靶基因也可以有眾多的miRNA。我們以miRNA和HERG基因的關系為切入點，以HERG為 革巴基因反向篩選驗證與其相關的miRNA。通過聯合多個生物信息學網站RegRNA、miRanda、 TargetScan 綜合預測出與 HERG 相關的 6 個 miRNA :miR-3619、miR-134、miR-143、miR-103、 miR-147、miR-185。首先選定miR-3619,應用雙螢光素酶基因報告法對其進行驗證，發現 miR-3619可與hERG結合，提示hERG是它的靶基因。同時，在穩定表達的hERG-HEK293細胞 中，RT-PCR和Western Blot檢測發現miR-3619對hERG mRNA和蛋白質的表達呈負調控， 其特異性的反義寡聚（脫氧）核苷酸（AM0-3619)可以拮抗miRNA的作用；激光共聚焦顯示 miR-3619同時降低了細胞膜及細胞質hERG蛋白的表達，AM0-3619亦可拮抗這種作用；這些 實驗結果完全相符合，均驗證了 miR-3619對hERG基因的負性調控作用，同時證明AM0-3619 可通過增加通道蛋白的表達從而促進hERG基因功能，改善長QT綜合征，從而完成了本發 明。而已有諸多研究證實HERG功能抑制是先天性和獲得性長QT綜合征重要的發病機制之 一，故miRNA-3619可作為診斷長QT綜合征的分子標記物及潛在治療靶點，而AM0-3619用 于制備治療長QT綜合征藥物也具有明顯的創新性和切實的可行性。
[0007] 長QT綜合征的發病機制復雜，已有研究證實hERG功能改變是LQTs重要的發病機 制之一，且我們的實驗發現miR-3619表達的上調可減低hERG蛋白表達、抑制hERG基因功 能，然而miRNA在長QT綜合征的具體作用機制有待于進一步研究和探討。鑒于目前尚無有 效防治長QT綜合征的方法，將相關miRNA作為其分子診斷標記物和潛在治療靶點以及將相 應AMOs用于治療長QT綜合征藥物制備的應用具有相當的迫切性。當然，我們需要在動物 或人心肌細胞中進一步驗證miR-3619對hERG基因的調控作用。
【具體實施方式】
[0008] 材料與方法
[0009] 1. 1實驗儀器與試劑
[0010] 1. 1. 1主要實驗儀器
[0011] 表1實驗儀器名稱和生產廠家
[0012]
[0014] I. I. 2實驗藥品和試劑
[0015] 表2實驗藥品名稱和生產廠家
[0016]
[0018] I. I. 3實驗方法
[0019] 實時熒光定量PCR
[0020] 用Trizol試劑從已轉染的U20S細胞中提取總RNA。將RNA隨后用無菌的 Rnase-free處理，hERG基因 mRNA的水平使用Taqman探針評估與qRT-PCR檢測。引物和探 針是來自ABI公司cat. #4331182(編號：Hs04234270-gl)。反轉錄條件設定為初始步驟在 95°C 10分鐘，隨后在95°C 15秒40個循環，并在60°C下維持1分鐘。實時PCR反應獨立重 復進行三次。結果用2-△△ CT相對定量方法分析30。
[0021] Western blot
[0022] 提取hERG蛋白的步驟免疫印跡分析按先前描述的。簡而言之，首先轉染 pcDNA-hERG到U20S細胞中。所表達的hERG細胞進一步轉染各自的miRNA或miRNA加上 相應的AMOs。轉染48小時后收獲細胞。將等量的蛋白灌注在已制備好的7. 5% SDS聚丙 烯酰胺凝膠上，然后轉移到硝酸纖維素膜上。膜封閉用5%的脫脂奶粉，接著用兔多克隆抗 hERG的抗體在4°C下孵育過夜。在TBST中將膜洗滌三次，然后在室溫下用山羊抗兔IgG孵 育1小時。印跡處理用SuperSignal West Pico化學發光底物（Pierce Biotechnology公 司，美國），并使用Syngene公司的成像系統。
[0023] 實驗表明，我們采用生物信息學預測反向篩選聯合雙熒光素酶報告基因、 qRT-PCR、Western blot、激光共聚焦技術篩選出了 miR-3619可以負性調控hERG蛋白表達， 相應的AM0-3619可以沉默miR-3619對hERG的抑制作用。我們的實驗為進一步理解hERG 蛋白的調控機制及從基因角度對長QT綜合征進行治療提供了新的視角。然而，這些研究結 果需要在動物模型、前期臨床及臨床中進一步驗證。
【主權項】
1. miRNA-3619在作為預判患長QT綜合征風險和診斷長QT綜合征分子標記物中的應 用。2. 根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述miR-3619是成熟miR-3619。3. 根據權利要求1所述的應用，其中，所述長QT綜合征選自先天性長QT綜合征2型， 獲得性長QT綜合征的一種或多種。4. 根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述長QT綜合征可能引起尖端扭轉性室 性心動過速。5. 根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述長QT綜合征可能引起心臟形猝死。 6. AM0-3619在制備治療長QT綜合征藥物中的應用。7. 根據權利要求5所述的應用，其特征在于，藥物組合物中含有AM0-3619。8. 根據權利要求5或6所述的應用，其特征在于，所述AM0-3619為miR-3619的反義寡 核苷酸序列。9. 根據權利要求5或6或7所述的應用，其特征在于，AM0-3619為miR-3619抑制劑。
【專利摘要】本發明公開了一種可作為長QT綜合征預判罹患風險和診斷的分子標記物，即miRNA-3619；以及其反義寡聚核苷酸AMO-3619在制備治療長QT綜合征藥物中的應用，主要在于藥物促進hERG基因功能的應用，其特征在于，藥物組合物含有AMO-3619。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/113, A61K48/00, A61P9/06, A61K31/7105
【公開號】CN105385688
【申請號】CN201510764308
【發明人】鄭梅霞, 廉姜芳, 周建慶, 楊曦, 黃曉燕, 莊凱麗, 國建, 毛海燕, 巴艷娜, 方培亮
【申請人】寧波市醫療中心李惠利醫院
【公開日】2016年3月9日
【申請日】2015年11月5日