糞菌保存液及其保存糞菌的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于醫療檢測領域，特別涉及一種糞菌保存液以及采用此保存液保存糞菌的方法。
【背景技術】
[0002]腸道菌群的結構失調是誘發各種慢性病的重要因素，近年來國內外研究發現通過“奠菌移植”(fecal microb1ta transplantat1n，FMT)，即用來自健康人的腸道菌群，恢復慢性病人體內菌群結構的平衡，重建具有正常結構的腸道微生態，可以促進菌群功能的康復，從而達到腸道及腸道外疾病的治療效果。迄今，國內外均有采用糞菌移植方法成功治愈或緩解難辨梭狀芽孢桿菌感染(CDI)、炎癥性腸病等胃腸道相關性疾病的臨床報道。2013年，美國FDA將FMT收錄到復發性CDI的標準治療指南中。雖然“糞菌移植”的治療臨床效果顯著，但是其在醫學領域內的推廣和應用仍有諸多問題有待解決，比如FMT的標準化建立。其中，糞菌液的保存是FMT中的必要步驟。當菌群離開腸道后，其所處環境即發生變化，其活性和構成比例可能會受到影響。為了保證臨床移植的治療效果，需采用一種有效的保存方法和手段來維持腸道菌群的活性和構成比例。
[0003]目前臨床上一般采用冷藏法用于直接保存人體糞便，即當糞便采集后立即凍存在-20°C或者更低的溫度中，由于細菌在低溫狀態下代謝速率降低，因此可以在一段時間內維持糞便中細菌的構成，從而達到穩定其微生物構成的目的。當需要進行FMT操作時，將凍存品再通過分離方法得到糞菌，這不僅增加了糞菌分離的難度和工作量，也需要更大的存儲空間。此外，糞菌如作為一種治療方法中的“藥品”，不能夠直接在臨床中應用，反而需要先凍存糞便再提取后使用，這樣的治療過程無疑會增加操作和設備的依賴性，會阻礙糞菌移植治療方法的發展。同時，我國很多醫療機構并不具備對糞菌進行分離的能力。因此，盡管專利文獻一種糞便保存液(CN104480012A)報道了利用Η)ΤΑ鹽及檸檬酸鈉等物質，以水和乙醇作為溶劑配制的保存液能夠將糞便樣本在密封常溫下保存一周，但這種方法不適于對糞菌移植中的糞菌進行保存。
[0004]目前臨床在糞菌移植過程中常采用磷酸鹽緩沖液(PBS)與供體糞菌混合，由于混合液的流體特征，臨床上采用內鏡下噴射或者灌腸過程中，與腸道壁接觸時間短，影響糞菌定植效果。糞菌液如需保存，則需要額外加入甘油，過多的步驟容易增加外源性感染的機會。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是針對現有技術的缺陷，提供能夠有效保護腸道菌群活性和豐度。從而保證糞菌移植效果的保存液，以及采用上述保存液保存糞菌的方法。
[0006]為了實現上述目的，本發明采用以下技術方案:一種糞菌保存液，按重量百分比包括以下組分:0.9 %的氯化鈉，0.5 %?2.0 %的維生素C，20 %?50 %的甘油，其余為無菌純化水，所述保存液的pH值為7.0?7.4。
[0007]—種保存液保存糞菌的方法，包括以下步驟:
(1)將收集糞便分離后得到的糞菌，每50g糞便得到的糞菌用100mL保存液重懸，然后在_80°C凍存保存；
(2)使用時，先將糞菌凍存物在冰浴中解凍，然后稀釋到250mL的無菌生理鹽水中，供糞菌移植使用。
[0008]本發明涉及一種糞菌保存液的配方，按照配方所述配制糞菌保存液。將采集的新鮮糞便，經攪拌、離心、重懸、過濾等步驟直接采用糞菌保存液保存，或者直接采用糞菌分離系統分離得到糞菌，然后直接將糞菌置于保存液中，-80°C以下凍存，即可達到穩定其中微生物構成的作用，保存時間長達3個月。使用該配方保存液，在相應的保存條件下，能夠保證糞菌中微生物的數量和豐度不影響后續糞菌移植的治療效果，為糞菌移植標準化提供了可能。
[0009]本發明中的糞菌保存液很好地保護了腸道菌群的活性和豐度，從而保證了糞菌移植效果，同時也簡化了糞菌移植操作，目前臨床上無本發明所描述的類似產品或方法面市。
[0010]本發明配方能夠在簡單的保存條件下，對糞菌進行長達3個月的保存，保證其微生物構成仍與最初分離提取時的微生物構成相似。從配方構成角度來看，本發明具有成本低，配制簡單等特點，這將有助于糞菌治療的發展；從具體實施案例的結果來看，本發明的配方，能夠實現在常規保存條件下，維持糞菌長達3個月基本不變，這為糞菌移植標準化提供了主要保障。
【附圖說明】
[0011]圖1是實施例中4位志愿者的糞便樣本做3種不同處理后的DNA擴增結果比較。
[0012]圖2是實施例中3位志愿者的糞便樣品用糞菌液保存前后的細菌豐富度圖變化。
【具體實施方式】
[0013]下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明。
[0014]—種糞菌保存液，按重量百分比包括以下組分:0.9%的氯化鈉，0.5%的維生素C，50%的甘油，其余為無菌純化水，保存液的pH值為7.4。
[0015]將收集糞便分離后得到的糞菌，每50g糞便得到的糞菌用100mL保存液重懸，然后在-80°C凍存保存。
[0016]使用時，先將糞菌凍存物在冰浴中解凍，然后稀釋到250mL的無菌生理鹽水中，供糞菌移植使用。
[0017]采集了 4位志愿者的糞便樣本，并利用糞菌分離系統分離得到對應的糞菌。每個志愿者的糞菌分為3份，分別做3種不同處理:
(1)立即處理:將一份分離得到的糞菌分散在無菌生理鹽水中，每50g糞便分離得到的糞菌分散于100mL生理鹽水。取300 yL，立即進行DNA提取，核糖體16S RNA基因第四可變區擴增等處理。
[0018](2)糞菌保存液_80°C保存3個月:將一份分離得到的糞菌分散在糞菌保存液中，每50g糞便分離得到的糞菌分散于100mL保存液，-80°C凍存3個月。然后冰浴解凍后取300 μ L，進行DNA提取，核糖體16S RNA基因第四可變區擴增等處理。
[0019](3)不加保存液-80°C保存3個月:將一份分離得到的糞菌分散在無菌生理鹽水中，每50g糞便分離得到的糞菌分散于100mL生理鹽水，-80°C凍存3個月。然后冰浴解凍后取300 μ L，進行DNA提取，核糖體16S RNA基因第四可變區擴增等處理。
[0020]4位志愿者的糞便樣本進行DNA提取，核糖體16S RNA基因第四可變區擴增處理的步驟如下:
(l)DNA 提取:
將300 μ L糞菌溶液置于含0.1mm硅球的1.5mL離心管中；然后，加入含50 μ L溶菌酶(10mg/ml)、6 μ L變溶菌素(25000U/mL)和3 μ L溶葡球菌酶的PBS，充分混勻后37°C溫育30分鐘；接著，加入10 μ L蛋白酶K(20mg/ml)、100 μ L濃度為10%的SDS (十二烷基苯磺酸鈉)和20 yL核糖核酸酶A(20mg/ml)，渦旋震蕩充分混勻后55°C溫育45分鐘；隨后，采用磨珠均質器裂解細胞；最后按說明書使用ZYMO Research公司的糞便DNA提取試劑盒提取純化DNA。
[0021](2)核糖體16S RNA基因第四可變區擴增:
試劑(Takara公司):
引物:上游:27F-59-GCCTTGCCAGCCCGCTCAGTCAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-39 和下游 338R-59-GCCTCCCTCGCGCCATCAGNNNNNNNNCATGCTGCCTCCCGTAGGAG-T-39 ；.Taq DNA 聚合酶；.MgC12 ；2.5mmol/L dNTP Mixture ；ddH20 ；lOx Ex Taq Buffer (不含鎂離子)；DNA模板。
[0022]操作步驟:
每個 PCR 反應體系為 25 μ L，包括:15.75 μ L ddH20, 2.5 μ L 10x Ex Taq Buffer，2yLdNTP Mixture, 1.5 yL MgCl2,0.25 μ L Taq DNA 聚合酶，上游引物和下游引物各 0.5 μ L，2 μ L 模板 DNA。
[0023]在每個EP管中分裝好每個25 μ L的PCR反應體系后，按照以下PCR程序擴增反應:
(step 1):94 °C, 2min ； (step 2):92 °C, 30s ； (step 3):52 °C, 30s ； (step 4):72 °C,45s ； (step 5):go to step 2，29cycles ; (step 6):72°C, 5min ； (step 7):4°C, forever ；(step 8):end
擴增得到的片段，送往測序公司進行高通量測序，獲得序列后進行后續生物信息分析，得到菌群結果。
[0024]4位志愿者的糞便樣本做3種不同處理后的DNA擴增結果比較見圖1。圖中:
1.志愿者1樣品立即處理；2.志愿者1樣品保存液-80°c保存3個月；3.志愿者1樣品直接-80°C保存3個月；4.志愿者2樣品立即處理；5.志愿者2樣品保存液-80°C保存3個月；6.志愿者2樣品直接-80°C保存3個月；7.志愿者3樣品立即處理；8.志愿者3樣品保存液-80°C保存3個月；9.志愿者3樣品直接-80°C保存3個月；10.志愿者4樣品立即處理；11.志愿者4樣品保存液_80°C保存3個月；12.志愿者4樣品直接_80°C保存3個月；M:Marker。
[0025]3位志愿者糞便樣品用糞菌液保存的樣品進行處理，并送測序公司進行高通量測序，通過生物信息學方法分析，細菌豐富度對比比較見圖2。圖中可以看出:糞便細菌組成相似，每種菌群豐度變化不明顯，說明糞菌保存液可以保證糞菌在_80°C條件下保持良好的活性及菌群組成，為今后的糞菌移植工作提供保障。
[0026]如上所述，盡管參照特定的優選實施例已經表示和表述了本發明，但其不得解釋為對本發明自身的限制。在不脫離所附權利要求定義的本發明的精神和范圍前提下，可對其在形式上和細節上作出各種變化。
【主權項】
1.一種糞菌保存液，其特征在于按重量百分比包括以下組分:0.9%的氯化鈉，0.5%?2.0%的維生素C，20%?50%的甘油，其余為無菌純化水，所述保存液的pH值為7.0 ?7.4o2.一種根據權利要求1所述的糞菌保存液保存糞菌的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)將收集糞便分離后得到的糞菌，每50g糞便得到的糞菌用100mL保存液重懸，然后在_80°C凍存保存； (2)使用時，先將糞菌凍存物在冰浴中解凍，然后稀釋到250mL的無菌生理鹽水中，供糞菌移植使用。
【專利摘要】本發明公開了一種糞菌保存液以及采用上述保存液保存糞菌的方法，糞菌保存液，按重量百分比包括以下組分：0.9％的氯化鈉，0.5％～2.0％的維生素C，20％～50％的甘油，其余為無菌純化水，所述保存液的pH值為7.0～7.4。本發明配方能夠在簡單的保存條件下，對糞菌進行長達3個月的保存，保證其微生物構成仍與最初分離提取時的微生物構成相似。從配方構成角度來看，本發明具有成本低，配制簡單等特點，這將有助于糞菌治療的發展；從具體實施案例的結果來看，本發明的配方，能夠實現在常規保存條件下，維持糞菌長達3個月基本不變，這為糞菌移植標準化提供了主要保障。
【IPC分類】C12N1/04
【公開號】CN105385599
【申請號】CN201511009229
【發明人】葉峰, 王曉艷
【申請人】南京醫科大學第一附屬醫院
【公開日】2016年3月9日
【申請日】2016年1月21日