一種吸附柱層析純化烏司他丁的方法及提高烏司他丁穩定性的藥物組合物的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物技術領域，具體地說涉及一種應用吸附柱層析法來制備收率高、效價穩定的烏司他丁的方法。
【背景技術】
[0002]烏司他丁(Ulinastatin)系從健康成年男性新鮮尿液中分離純化出來的一種酸性糖蛋白，是一種廣譜的蛋白酶抑制劑，主要在肝臟中合成，由腎臟代謝隨尿液排出，且其分解形成的低分子量成分也具有很強的抑制水解酶的作用。烏司他丁由143個氨基酸組成，相對分子質量約37000~43000，屬于蛋白酶抑制劑，對胰蛋白酶、α -糜蛋白酶等絲氨酸蛋白酶及粒細胞彈性蛋白酶、透明質酸酶、巰基酶、纖溶酶等多種酶有抑制作用，還具有穩定溶酶體膜、抑制溶酶體酶的釋放、抑制心肌抑制因子(MDF)產生、清除氧自由基及抑制炎癥介質釋放的作用。烏司他丁還可改善手術刺激引起的免疫功能下降、蛋白代謝異常和腎功能降低，防止手術刺激引起的對內臟器官與細胞的損傷以及改善休克時的循環狀態等。
[0003]1909年歐洲首先報道人體尿液存在著胰蛋白酶抑制劑，隨后人們發現，當人體受到感染、發熱、腫瘤、妊娠、休克、手術、給予糖皮質激素等刺激時，人體尿液中UTI活性升高。1985年由日本首先開發上市，在日本已作為急性胰腺炎、急性循環衰竭的治療藥物被廣泛應用于臨床。
[0004]本發明人自2008年開始對UTI的生產工藝進行試驗研究，采用現代蛋白質高端生化分離技術進行生產，使UTI的總收率提高到60%以上，總效價不低于4000iu/mg，生產工藝穩定，質可控。
【發明內容】
[0005]本發明提供了一種吸附柱層析純化烏司他丁的方法及提高烏司他丁穩定性的藥物組合物，是為了攻克高嶺土吸附、耐酸性混合模式吸附等傳統方法提取烏司他丁收率過低、效價不高不穩定的缺點，采用吸附柱層析來純化烏司他丁，從而提高烏司他丁收率，保證了效價的穩定。
[0006]為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案予以實現:
一種吸附柱層析純化烏司他丁的方法及提高烏司他丁穩定性的藥物組合物，其特征在于:選用樹脂吸附、特異洗脫液解吸來純化烏司他丁，可以將總收率提高到60%以上，總效價不低于4000iu/mg。
[0007]在發明技術方案中，還具有以下技術特征:所述吸附柱層析包括如下步驟:
1)烏司他丁粗加工
稱取IT pH小于6.5的澄清尿液，不斷攪拌，緩慢加入16.5kg甲殼質吸附完全后用氨水洗脫，再經過3.5kg硫酸銨鹽析，過夜沉淀、離心后置于用五氧化二磷作吸水劑的真空干燥器中真空干燥，干燥后即得烏司他丁粗品。
[0008]2)吸附柱層析工序(以0.25L柱體為例)
2.1)稱取烏司他丁粗品1kg，用洗脫液A溶解，攪拌30分鐘，離心20分鐘，留取離心液；
2.2)陰離子交換柱用洗脫液B平衡，將上述離心液流經平衡好的陰離子交換柱，流速控制在120~130mL/min左右；
2.3)用洗脫液B溶液洗脫，流速控制在120~130mL/min，得洗脫液；
2.4)將洗脫液經超濾膜，加入磷酸鹽緩沖液反復超濾，超濾至其體積的二十分之一，得超濾液。
[0009]3)沉淀
超濾液中按1:6的比例加入不低95%的乙醇沉淀12小時，離心，固體再用無水乙醇脫水兩次，離心，棄去上清液，留取沉淀物。
[0010]4)凍干
將沉淀物裝入盤進凍干機，凍干即得烏司他丁。
[0011]經核算，所得烏司他丁總收率高達60%以上，按中國藥典所示方法測定，總效價高達 4000iu/mg 以上。
[0012]與現有技術相比，本發明的優點和積極效果是:
選用吸附柱層析純化烏司他丁，可以更有效的去除其中的多種雜蛋白，并且使其理化性質和生物活性保持穩定，從而使產品的各項指標均符合中國藥典標準。更重要的是，通過工藝的不斷改進和完善，使得烏司他丁總收率達到60%以上，總效價不低于4000iu/mg，帶來巨大的經濟效益和社會效益。
【具體實施方式】
[0013]下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，而不以任何方式限制。
[0014]實施例1
1)烏司他丁粗加工
稱取IT pH小于6.5的澄清尿液，不斷攪拌，緩慢加入16.5kg甲殼質，并用精密pH試紙測定，調節尿液pH到6.0 ;吸附完全后用氨水洗脫lh，再經過3.5kg硫酸銨鹽析，過夜沉淀、離心后置于置用五氧化二磷作吸水劑的真空干燥器中真空干燥，干燥后即得烏司他丁粗品。
[0015]2)吸附柱層析工序(以0.25L柱體為例)
2.1)稱取烏司他丁粗品1kg，用8.5L的洗脫液A溶解，攪拌30分鐘，離心20分鐘，留取離心液；
2.2)陰離子交換柱用2.5L的洗脫液B平衡，將上述離心液流經平衡好的陰離子交換柱，流速控制在120mL/min左右；
2.3)用33L的洗脫液B溶液洗脫，流速控制在120mL/min，得洗脫液；
2.4)將洗脫液經超濾膜，加入磷酸鹽緩沖液反復超濾，超濾至其體積的二十分之一，得超濾液約1.65L。
[0016]3)沉淀
超濾液中按1:6的比例加入不低95%的乙醇沉淀12小時，離心，固體再用無水乙醇脫水兩次，離心，棄去上清液，留取沉淀物。
[0017]4)凍干
將沉淀物裝入盤進凍干機，凍干即得烏司他丁。
[0018]經核算，所得烏司他丁總收率為66%，按中國藥典所示方法測定，總效價高達4312iu/mg。
[0019]實施例2
1)烏司他丁粗加工
稱取IT pH小于6.5的澄清尿液，不斷攪拌，緩慢加入16.5kg甲殼質，并用精密pH試紙測定，調節尿液pH到6.0 ;吸附完全后用氨水洗脫lh，再經過3.5kg硫酸銨鹽析，過夜沉淀、離心后置于用五氧化二磷作吸水劑的真空干燥器中真空干燥，干燥后即得烏司他丁粗品Ο
[0020]2)吸附柱層析工序(以0.25L柱體為例)
2.1)稱取烏司他丁粗品1kg，用8.5L的洗脫液A溶解，攪拌30分鐘，離心20分鐘，留取離心液；
2.2)陰離子交換柱用3.0L的洗脫液B平衡，將上述離心液流經平衡好的陰離子交換柱，流速控制在130mL/min左右；
2.3)用33L的洗脫液B溶液洗脫，流速控制在130mL/min，得洗脫液；
2.4)將洗脫液經超濾膜，加入磷酸鹽緩沖液反復超濾，超濾至其體積的二十分之一，得超濾液約1.65L。
[0021]3)沉淀
超濾液中按1:6的比例加入不低95%的乙醇沉淀12小時，離心，固體再用無水乙醇脫水兩次，離心，棄去上清液，留取沉淀物。
[0022]4)凍干
將沉淀物裝入盤放進進凍干機，凍干即得烏司他丁。
[0023]經核算，所得烏司他丁總收率為63%，按中國藥典所示方法測定，總效價高達4123iu/mg。
[0024]實施例3
取實施例2中制備的烏司他丁 1.1億單位，稱取llg甘露醇，NaCl 33g, Na2HP04.12H2021.9375g，NaH2P04.2H209.94375g,加1000ml注射用水溶解，聚醚砜超濾膜無菌過濾，分裝于1000個已處理好的西林瓶中，凍干、乳蓋即可。
[0025]以上所述，僅是本發明的較佳實施例而已，并非是對本發明作其它形式的限制，任何熟悉本專業的技術人員可能利用上述揭示的技術內容加以變更或改型為等同變化的等效實施例。但是凡是未脫離本發明技術方案內容，依據本發明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬于本發明技術方案的保護范圍。
【主權項】
1.一種純化烏司他丁的方法，該方法包括:將烏司他丁粗品通過吸附柱層析、超濾液沉淀、沉淀物凍干步驟進行純化，所得純化后的烏司他丁的總收率提高到60%以上，總效價不低于 4000iu/mgo2.如權利要求1所述的方法，其特征在于:所述烏司他丁粗品是通過以男性尿液為原料，將原料依次經過甲殼質吸附、氨水洗脫、硫酸銨鹽析制備得到的。3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述吸附柱層析包括如下步驟: (1)用洗脫液A溶解烏司他丁粗品，攪拌、離心，留取離心液，所述洗脫液A為0.01-0.3mol/L的醋酸鹽緩沖液； (2)用洗脫液B平衡吸附柱，將上述離心液上柱，洗脫液B為0.01-0.5mol/L醋酸鈉和0.l-5mol/L NaCl 的緩沖液； (3)用洗脫液B洗脫吸附柱，收集洗脫液； (4)將洗脫液經超濾膜，加入磷酸鹽緩沖液反復超濾，得超濾液。4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0.01-0.5mol/L。5.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述吸附柱為陰離子交換柱。6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述陰離子交換柱包括:強陰離子交換柱Q-Sephadex A-25, Q-S印hadex A-50, Q-Sephadex C-25, Q-Sephadex C-50 ;弱陰離子交換柱DEAE-Cellulose DE-22，DEAE-Cellulose DE-23，DEAE-Cellulose DE-51，DEAE-CelluloseDE-52，DEAE-Cellulose DE-53。7.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述超濾液沉淀步驟包括:超濾液中加入乙醇沉淀。8.—種藥物組合物，其含有根據權利要求1-7制備的烏司他丁作為活性成分，還含有甘露醇、氯化鈉、磷酸緩沖液。
【專利摘要】本發明公開了一種吸附柱層析純化烏司他丁的方法及提高烏司他丁穩定性的藥物組合物。具體的說，就是以健康成年男性新鮮尿液為原料，經過甲殼質吸附、氨水洗脫、硫酸銨鹽析以及吸附柱層析等現代蛋白質高端生化分離技術來制備高純度的烏司他丁，可以將總收率提高到60%以上，總效價不低于4000iu/mg。
【IPC分類】C07K1/22, C07K1/34, A61P29/00, C07K1/18, C07K1/30, C07K1/36, A61P37/04, A61K38/57, C07K14/81
【公開號】CN105384813
【申請號】CN201510820511
【發明人】劉乃山, 林曉磊, 劉翠珍
【申請人】青島康原藥業有限公司
【公開日】2016年3月9日
【申請日】2015年11月24日