松墨天牛磷酸丙糖異構酶基因全長序列及其克隆方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及生物基因工程領域，具體是設及松墨天牛憐酸丙糖異構酶基因序列及 其克隆方法。該基因編碼憐酸丙糖異構酶，該酶是研究血吸蟲病疫苗開發的重要材料，具有 重要的免疫學意義。 技術背景
[0002] 憐酸丙糖異構酶（Trios巧hosphateisomerase)是自然界中廣泛存在的一種糖酵 解酶，存在于植物、哺乳動物、昆蟲和真菌等多種生物內，它能催化二徑丙酬憐酸與3-憐酸 甘油醒之間的可逆反應。憐酸丙糖異構酶在糖酵解、脂肪酸合成、糖原異生和戊糖憐酸途徑 中發揮著重要作用，研究表明憐酸丙糖異構酶還是研究血吸蟲病疫苗開發的重要材料，具 有重要的免疫學意義。
[0003] 松墨天牛（Monochamusalterna化S)又名松褐天牛，松天牛，屬于銷翅目 (Goleoptera)，天牛科（Cerambycidae)。它是重要的針葉樹害蟲，主要危害馬尾松、油松、黑 松等樹干和枝條的初皮部和木質部，嚴重影響松樹的生長，同時也是松材線蟲萎黨病的主 要傳播媒介。目前對于松墨天牛的研究主要集中在形態結構、綜合防治、基因表達譜和功能 分析等方面，對于松墨天牛憐酸丙糖異構酶的研究及其在免疫學方面的應用尚未見報道。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供松墨天牛憐酸丙糖異構酶基因全長序列及其克隆方法。
[0005] 為了實現上述發明目的，本發明采取了W下技術方案：
[000引 1、總RNA的提取
[0007] 將采集的松墨天牛成蟲在液氮中速凍，置于-70°C備用。采用E.Z.N.A.?TotalRNA KitII總RNA提取試劑盒提取總RNA。
[0008] 2、引物設計和3'RACE擴增
[0009] 根據本實驗構建的cDNA文庫中，獲得了松墨天牛憐酸丙糖異構酶5'端序列，本 發明在此基礎上進行3'RACE擴增，W獲得墨天牛憐酸丙糖異構酶基因全序列。
[0010] 3'RACE擴增的特異性引物為：
[0011]Ma-TPI-3'-Outer:CGTTGGCGTCCCTGCTATCT
[0012] Ma-TPI-3'-Inner:GGCGAGACCTTAGAGGAACG
[0013] 3、目的基因克隆及測序
[0014]PCR產物經由瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的DM片段，與PMD20-T載體連接，將 連接產物轉化E.coliD冊α感受態細胞，進行AMP抗性藍白斑篩選，挑陽性菌落提取質 粒.經菌落PCR鑒定后測序。
[001引 4、序列拼接
[0016] 將測序的序列與構建的cDNA文庫松墨天牛憐酸丙糖異構酶5'端序列進行拼接， 獲得松墨天牛憐酸丙糖異構酶基因全長序列。
[0017] 松墨天牛憐酸丙糖異構酶基因全長序列，該序列如下：
[0019] 序列中劃線標示的ATG為初始密碼子，劃線標示的TGA為終止密碼子。
[0020] 根據松墨天牛憐酸丙糖異構酶基因全長序列，得到其氨基酸序列。該序列如下：
[0021]
[0022] 本發明獲得了松墨天牛憐酸丙糖異構酶基因全長序列，補充了松墨天牛糖酵解酶 類的基因。同時，憐酸丙糖異構酶是研究血吸蟲病疫苗開發的重要材料，獲得松墨天牛憐酸 丙糖異構酶基因全長能為新型血吸蟲病疫苗的研發提供研究思路和方向。通過對材料的準 備和處理、RNA提取、3'RACE擴增、目的基因克隆及序列拼接，得到了松墨天牛憐酸丙糖異 構酶基因，該基因全長1450bp，基因開放閱讀框為514-125化P，共編碼247個氨基酸。
【具體實施方式】
[0023]W下實施例將本發明進一步說明。
[0024]1、松墨天牛總RNA提取
[0025] 松墨天牛成蟲采自廣州市從化馬尾松林。用液氮冷凍后保存在離屯、管中，置 于-70°C冰箱內保存備用。
[002引 采用E.Z.N.A.?TotalRNAKitII總RNA提取試劑盒提取總RNA，具體方法如下：
[0027] 1)將松墨天牛成蟲研磨粉碎，稱取lOOmg在液氮預冷的研鉢中研磨樣品至粉末， 后放入1. 5血離屯、管中。加入1血RNA-SolvReagent至離屯、管，室溫靜置3min。
[002引 2)加入200μL氯仿，劇烈震蕩15s后置于冰上解化lOmin。
[0029] 3)在 4°C下，12000;r/min離屯、15min，出現上層水相。
[0030] 4)轉移上層水相80%至新的收集管，加入1/3的無水乙醇（可能會出現米黃色沉 淀），滿旋15s。
[003。 5)轉移全部混合液到2血collectingtube(帶吸附柱）中，室溫下1000化/min 離屯、Imin，棄廢液。
[0032] 6)重復上一步驟：室溫下1000化/min離屯、Imin，棄廢液。
[0033] 7)將吸附柱放進新的 2血collection1:ube中，加 300μLRNAwashBufferl，室 溫下lOOOOr/min離屯、Imin，棄廢液。
[0034] 8)在吸附柱中加入400μLRNAwashBufferl，室溫下 10000r/min離屯、lmin，棄 廢液。
[0035] 9)在吸附柱中加入 500μLRNAwashBuffer2,室溫下lOOOOr/min離屯、Imin，棄 廢液。
[0036] 10)重復上一步驟：在吸附柱中加入500μLRNAwashBuffers,室溫下lOOOOr/ min離屯、Imin，棄廢液。再次室溫下132001·/min,離屯、2min。
[0037]洗脫RNA,將吸附柱置于新的1. 5μL離屯、管中（自備），加入30-50μLDEPC。室溫 下，130001·/min,離屯、2min，所得溶液為總RNA。
[0038]注意事項：用于RNA實驗的試劑，需使用干熱滅菌（18(rC，60min)或使用上述方法 進行DEPC水處理滅菌后的玻璃容器盛裝（也可W使用RNA實驗用的一次性塑料容器），使 用的無菌水須用0. 1 %的DEPC處理后再進行高溫高壓滅菌。RNA實驗使用的試劑盒無菌水 都應專用，避免混用后交叉污染。
[0039] 2、cDNA3'末端擴增
[0040] 按照3'化11RACE Core Set Ver.2. 0kit試劑盒進行，具體操作步驟如下：
[0041] 1)反轉錄反應
[0042] 反應體系如下：
[004引PCR反應程序為：42°C反應60min，70°C反應15min。
[0044]。套式PCR擴增
[0045] a)0uter PCR擴增 反應體系如下：
[0046]PCR反應程序為：94°C預變性 3min，94°C30sec，55°C30sec，72°Clmin，20 個循 環，然后72°C延伸lOmin。
[0047]b)InnerPCR擴增 反應體系如下：
[0048]PCR反應程序為：94°C預變性 3min，94°C30sec，55°C30sec，72°Clmin，30 個循 環，然后72°C延伸lOmin。PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增效果。
[0049] 3、目的基因克隆及測序
[0050] 1)從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段
[005。a)柱平衡步驟：向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入500μΙ平衡液化， 室溫下，12000r/min離屯、Imin，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
[0052] b)將單一目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠切下（盡量切除多余部分）放入干凈的離屯、 管中，稱取重量。
[0053] C)向膠塊中加入等倍體積溶液PC(如果凝膠重為0.Ig，其體積可視為100μ以則 加入100μLPC溶液），50°C水浴放置lOmin左右，期間不斷溫和地上下翻轉離屯、管，W確保 膠塊充分溶解。
[0054]d)將上一步所得溶液加入一個吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中），1200化/ min離屯、Imin，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
[00巧]e)向吸附柱CB2中加入600μL漂洗液PW(使用前請檢查是否已加入無水乙醇）， 回收的DNA是用于鹽敏感的實驗，如平末端連接，所W加入漂洗液PW后靜置2~5min再離 屯、。120(K)r/min離屯、Imin，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB2放入收集管。
[0056]f)向吸附柱CB2中加入600μL漂洗液PW，12000r/min離屯、Imin，倒掉收集管中 的廢液。
[0057]g)將吸附柱CB2放入收集管，12000r/min離屯、2min，盡量除去漂洗液。將吸附柱 置于室溫放置數分鐘，徹底驚干。
[0058]h)將吸附柱CB2放入收集管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量的洗脫緩沖液 EB，室溫放置2min，12000r/min離屯、2min，收集DNA溶液。
[0059] i)DNA產物于-20°C保存，用于后續試驗。
[0060] 2)T載體連接
[0061]PCR管中依次加入：pMD20-TVector1μ以純化過的innerPCR(即目標DNA片段） 產物 3μLSterilizedwater1μL加入 5μL(等量）的SolutionI至終體積 10μL。4°C 反應過夜。
[0062] 3)轉化感受態細胞
[0063]a)冰水浴中融化感受態細胞，并分裝為每支50μL。感受態細胞應剛從-70°C冰箱 取出放于冰浴上，連接產物的加入量不能超過感受態細胞體積的十分之一。
[0064]b)每支加入4μL連接產物，緩慢混均。
[0065] C)冰水上放置ASmin。
[0066]d)置于42°C水浴鍋中，熱激計時45sec。
[0067]e)立即將離屯、管放回冰水浴，吸取150μL混合液加入到LB培養基。
[0068]f)在37°C下，250;r/min搖菌比，目的是使質粒上相關的抗性標記基因表達，使菌 體復蘇。
[0069]g)將離屯、管中的菌液混勻，吸取30~50μL加到配置好的平板培養基上，用無 菌的彎頭玻棒輕輕的將細胞均勻涂開，待平板表面干燥后，倒置平板，37°C，225r/min培養 12-16h〇
[0070] 4)陽性重組子的鑒定及測序
[007。a)在1. 5血離屯、管中加入600μL含氨節的培養液，挑選白色菌落放入培養液中， 37°C下，250r/min過夜培養。取菌液作為模板進行菌落PCR鑒定。
[0072] b)菌落PCR 反應體系如下：
[0073]反應條件為：94°C預變性 3min;94°C30sec;55°C30sec30 個循環；72°CImin; 72°ClOmin。反應結束后取5μL反應產物，瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0074] C)將包含正確重組子的克隆送至生工生物進行測序。
[00巧]4、將測序正確的序列除去重疊部分，與構建的cDNA文庫松墨天牛憐酸丙糖異構 酶5'端序列進行拼接，獲得松墨天牛憐酸丙糖異構酶基因全長序列。
【主權項】
1. 一個松墨天牛憐酸丙糖異構酶基因全長序列，其特征在于該序列由1450個堿基對 組成，此全長序列為：序列中下劃線標示的atg為初始密碼子，下劃線標示的tga為終止密碼子，所獲得的松 墨天牛憐酸丙糖異構酶CDNA全長序列的編碼區從第514個核巧酸到1257個核巧酸。2. 根據權利要求所述的松墨天牛憐酸丙糖異構酶基因核巧酸序列，其表達的蛋白為松 墨天牛憐酸丙糖異構酶，其特征在于，松墨天牛憐酸丙糖異構酶由247個氨基酸組成，其氨 基酸序列為：AspHeValAsnAlaLysGln 245。3. 如權利要求I所述松墨天牛憐酸丙糖異構酶基因全長序列的克隆方法，其特征在于 其具體步驟如下： 用松墨天牛成蟲提取總RNA，進行引物設計和3'RACE擴增，獲得基因3'端未知序列； 將所獲得3'端序列進行基因克隆和測序，將測序正確的3'端序列與構建的CDNA文庫松 墨天牛憐酸丙糖異構酶5'端序列進行拼接，獲得松墨天牛憐酸丙糖異構酶基因全長序列。4. 如權利要求3所述松墨天牛憐酸丙糖異構酶基因全長序列的克隆方法，其特征在于 所述擴增的特異性引物為：
【專利摘要】松墨天牛磷酸丙糖異構酶基因全長序列及其克隆方法，涉及生物基因工程領域。所述克隆方法：用松墨天牛成蟲提取總RNA，采取RACE擴增獲得基因3′端序列，與構建的cDNA文庫松墨天牛磷酸丙糖異構酶5′端序列進行拼接獲得基因全長序列。該基因序列全長1450bp，基因開放閱讀框為514-1257bp，共編碼247個磷酸丙糖異構酶氨基酸。本發明補充了松墨天牛糖酵解酶類的基因，同時為新型血吸蟲病疫苗的研發提供研究思路和方向，具有重要免疫學意義。
【IPC分類】C12N15/10, C12N9/90, C12N15/61
【公開號】CN105368858
【申請號】CN201510271113
【發明人】吳華俊, 林同, 蔡紫玲, 羅淋淋
【申請人】華南農業大學
【公開日】2016年3月2日
【申請日】2015年5月21日